趙彩紅，王美皓，臧榮鑫，喬自林，馬忠仁，，王家敏，

(1.西北民族大學(xué) 生物醫(yī)學(xué)研究中心 甘肅省動物細(xì)胞技術(shù)創(chuàng)新中心，甘肅 蘭州 730030;2.西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030)

幼年敘利亞倉鼠腎細(xì)胞(Baby Hamster Syrian Kidney，BHK-21)由Macpherson IA[1]等人于1961年從1日齡的倉鼠腎臟中獲取并建系，主要用于大規(guī)模生產(chǎn)獸用疫苗等生物制品，如口蹄疫疫苗和狂犬疫苗[2]，同時日本乙型腦炎病毒[3]、寨卡病毒[4]以及特定的流感病毒株如A/WSN/ 33 [H1N1](WSN)[5]等也可在該細(xì)胞中增殖.因此，該細(xì)胞可廣泛應(yīng)用于病毒的分離和增殖.

早期用于口蹄疫疫苗生產(chǎn)的BHK-21細(xì)胞是貼壁依賴性細(xì)胞，該工藝較為繁瑣，生產(chǎn)成本高[6]，運用單個細(xì)胞懸浮在不含血清的培養(yǎng)基中生長增殖的無血清全懸浮培養(yǎng)方式已成為工業(yè)化培養(yǎng)哺乳細(xì)胞生產(chǎn)疫苗的必然趨勢[7].懸浮培養(yǎng)模式能克服貼壁培養(yǎng)型細(xì)胞生長貼附面積的限制，實現(xiàn)高密度增殖，提高了細(xì)胞產(chǎn)量[8].同時,還能取代極具不穩(wěn)定性、價格又昂貴的血清成分[9]，降低了生產(chǎn)成本，簡化了下游加工工藝[10]，使產(chǎn)品質(zhì)量得到有效控制.目前，已有諸多細(xì)胞[11-13]實現(xiàn)了全懸浮無血清培養(yǎng)，使得細(xì)胞得到最大程度的利用.研究表明，BHK-21細(xì)胞系易懸浮培養(yǎng)[14,15]，其適宜大規(guī)模培養(yǎng)[16].但細(xì)胞成瘤性是限制細(xì)胞生產(chǎn)應(yīng)用的主要因素之一.

細(xì)胞的成瘤性是指將完整的活細(xì)胞注入裸鼠、倉鼠或新生小鼠中能形成進(jìn)行性腫瘤的過程.作為疫苗生產(chǎn)的細(xì)胞基質(zhì)，BHK-21懸浮細(xì)胞成瘤性一直備受關(guān)注.馴化的懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞的生長特性以及成瘤性也未見報道.我們前期對貼壁型BHK-21細(xì)胞進(jìn)行了馴化，獲得了懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞[17].本研究旨在對馴化后的懸浮培養(yǎng)和貼壁培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行細(xì)胞形態(tài)、生長動力學(xué)和成瘤性的比較研究，確定懸浮培養(yǎng)方式對BHK-21細(xì)胞生長特性和成瘤性的影響，以期為疫苗等生物制品生產(chǎn)提供可靠的細(xì)胞基質(zhì).

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 動物

裸鼠BALB/c-nu/nu(雌性)，4～6周，體重21～23 g，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司.

1.1.2 細(xì)胞

貼壁培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞，購自ATCC，編號CCL-10，代次P53；懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞，由甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心對CCL-10馴化得到[17]；HELA和KMB-17細(xì)胞，由甘肅省動物細(xì)胞工程技術(shù)研究中心提供.

1.1.3 試劑

DMEM、MEM(Gibco)，BHK-21-SFM培養(yǎng)基、0.25%胰蛋白酶(蘭州百靈生物技術(shù)有限公司)，NBS(蘭州民海生物工程有限公司).

1.1.4 儀器

CO2培養(yǎng)箱(Thermo，3111型 )、倒置相差顯微鏡(Olympus，CK40-32PH型)、CASY快速細(xì)胞活力分析儀(德國ALIT).

1.2 方法

1.2.1 細(xì)胞培養(yǎng)

常規(guī)法復(fù)蘇HELA細(xì)胞、KMB17細(xì)胞以及貼壁培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞于T25方瓶內(nèi)培養(yǎng)，常規(guī)法復(fù)蘇懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞于T125搖瓶內(nèi)培養(yǎng).其中HELA細(xì)胞采用添加10%NBS的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，KMB17細(xì)胞以及貼壁培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞添加了10%NBS的MEM培養(yǎng)基培養(yǎng)，懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞采用BHK-21-SFM培養(yǎng)基進(jìn)行培養(yǎng).待貼壁細(xì)胞長成致密單層后按1∶4比例傳代，懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞待生長至4.0～6.0×106/mL時可按5.0×105/mL傳代培養(yǎng).將復(fù)蘇后第3、4代的貼壁培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞以及懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞分別進(jìn)行生長動力學(xué)和裸鼠體內(nèi)成瘤性試驗.

1.2.2 細(xì)胞形態(tài)觀察

細(xì)胞培養(yǎng)過程中，觀察貼壁培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞以及馴化后的懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞的狀態(tài)，進(jìn)行拍照，并做好記錄.

1.2.3 細(xì)胞生長曲線繪制

取復(fù)蘇后適應(yīng)培養(yǎng)第3代的貼壁培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞，用胰酶消化后制成單細(xì)胞懸液，計數(shù)并稀釋成1.0×104/mL.將稀釋好的細(xì)胞懸液接種到24孔板內(nèi)，置于37 ℃，5%CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng).每隔24 h，取3孔消化計數(shù)，直至細(xì)胞密度降低為止.同理，將復(fù)蘇適應(yīng)后第3代的懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞，稀釋成50.0×104/mL，接種到150 mL搖瓶中，培養(yǎng)體積為40 mL.繪制貼壁培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞以及懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞生長曲線，并求細(xì)胞最大増殖密度以及倍增時間(PDT).

1.2.4 裸鼠成瘤試驗1.2.4.1 細(xì)胞懸液制備

取培養(yǎng)至對數(shù)生長期的HELA細(xì)胞(陽性對照細(xì)胞)、KMB17細(xì)胞(陰性對照細(xì)胞)、以及復(fù)蘇后適應(yīng)培養(yǎng)第4代的貼壁培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞，采用胰酶消化法并以1 000 rpm離心5～10 min收集細(xì)胞，而馴化后的懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞則直接離心收集細(xì)胞.將收集的4組細(xì)胞均采用PBS重懸制備注射用細(xì)胞懸液，細(xì)胞濃度調(diào)整至5×107cells/mL.

1.2.4.2 裸鼠接種與觀察

裸鼠接種試驗分組見表1，共接種40只裸鼠.采用裸鼠背部皮下注射的接種方式，每只接種細(xì)胞懸液0.2 mL.將貼壁培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞與馴化后懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞接種至裸鼠皮下，觀察貼壁培養(yǎng)型與馴化后的懸浮培養(yǎng)型的BHK-21細(xì)胞對裸鼠成瘤能力的影響.同時在裸鼠皮下注入陰性對照細(xì)胞與陽性對照細(xì)胞，以確定造模是否成功.接種后SPF級環(huán)境下繼續(xù)飼養(yǎng)裸鼠，之后每2天記錄裸鼠體重，并用游標(biāo)卡尺測量瘤體積[瘤體長(a)、寬(b)，腫瘤體積=(a×b2)/2]，同時繪制裸鼠瘤體積生長曲線圖，觀察裸鼠活動情況，并記錄存活情況.

1.2.4.3 統(tǒng)計學(xué)處理

2 結(jié)果

2.1 細(xì)胞形態(tài)觀察

貼壁培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞為成纖維樣細(xì)胞，形態(tài)整齊、大小均一、邊緣清晰(圖1，A).而馴化后的BHK-21懸浮細(xì)胞為圓形細(xì)胞，細(xì)胞均質(zhì)透明、大小均一、細(xì)胞均勻分散，無明顯結(jié)團(tuán)現(xiàn)象(圖1，B).

A.BHK-21 貼壁細(xì)胞(48 h，10×) B.BHK-21 懸浮細(xì)胞(48 h，10×)

圖2 貼壁和懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞生長曲線

2.2 細(xì)胞生長特性

貼壁培養(yǎng)型與馴化后的懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞生長曲線如圖 2 所示，均呈典型的“S”型.如圖2所示，貼壁培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞的最大增殖密度為39.67×104/mL，細(xì)胞群體倍增時間為23.03 h；懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞的最大增殖密度為517×104/mL,與貼壁培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞的最大增殖濃度具有顯著差異(P<0.05)，細(xì)胞群體倍增時間為21.36 h.

2.3 裸鼠體內(nèi)成瘤實驗結(jié)果

2.3.1 接種后裸鼠狀況統(tǒng)計

統(tǒng)計各實驗組裸鼠活動情況、存活情況，并對成瘤情況進(jìn)行統(tǒng)計(表 1).繪制生存函數(shù)曲線(圖3).接種貼壁組的裸鼠在觀察期內(nèi)存活良好，活動正常，而懸浮組的裸鼠，其活動異常，在第六日便有裸鼠出現(xiàn)精神萎靡不振、采食量低，甚至死亡.如圖3所示，裸鼠接種BHK-21懸浮細(xì)胞后，其生存率低于貼壁組.

表1裸鼠接種后記錄

圖3 不同細(xì)胞接種后裸鼠生存函數(shù)曲線

2.3.2 不同培養(yǎng)方式對裸鼠成瘤能力的影響

如表2所示，接種陰性對照組細(xì)胞的裸鼠未形成腫瘤，且裸鼠存活良好；接種陽性對照組細(xì)胞的裸鼠腫瘤形成率達(dá)到100%，表明造模成功.

同時，將貼壁組以及懸浮組的細(xì)胞注入裸鼠皮下后，表現(xiàn)出了不同的裸鼠成瘤能力.本研究發(fā)現(xiàn)接種不同細(xì)胞后，裸鼠在觀察期內(nèi)其體重是增加的(圖4，A)，但懸浮組裸鼠的體重增長率均低于其他三組(圖4，B)(P>0.05).同時，接種懸浮組的裸鼠成瘤體積增長率高于其他三組(圖4，C)，其最終瘤體積也與陽性組和貼壁組的裸鼠最終瘤體積存在顯著差異(圖4，D)(P<0.05).

3 討論

幼倉鼠腎(BHK-21)細(xì)胞已成功建立了傳代細(xì)胞系，目前已用于生產(chǎn)各類病毒性疾病的獸用疫苗，如口蹄疫疫苗[2]等，其在重組蛋白[18,19]等方面也有研究.現(xiàn)如今，為了獲得高效高產(chǎn)的生物制品，細(xì)胞作為至關(guān)重要的媒介，在如何提高增殖密度，簡化操作流程等方面已被大量研究[20].同時，在生產(chǎn)人用疫苗等生物制品方面，傳代哺乳動物細(xì)胞系的安全性始終令人擔(dān)憂[21].

圖4 BHK-21細(xì)胞不同培養(yǎng)方式對裸鼠成瘤能力的影響

目前，已有諸多關(guān)于貼壁細(xì)胞以及懸浮細(xì)胞生長特性的研究.懸浮培養(yǎng)工藝不僅彌補了貼壁培養(yǎng)產(chǎn)量低的不足，更降低了企業(yè)的生產(chǎn)成本，對疫苗產(chǎn)業(yè)的下游純化技術(shù)降低了要求[10].貼壁細(xì)胞與懸浮細(xì)胞相比，其培養(yǎng)方式不僅發(fā)生了改變，細(xì)胞結(jié)構(gòu)也發(fā)生變化[22,23].本研究將貼壁培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞和馴化后的懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞進(jìn)行了生長特性的比較研究，發(fā)現(xiàn)馴化后的懸浮培養(yǎng)型BHK-21細(xì)胞在同樣的培養(yǎng)體積下其最大增殖密度遠(yuǎn)高于貼壁細(xì)胞.同時其BHK-21懸浮細(xì)胞的倍增時間也比貼壁細(xì)胞短.表明懸浮培養(yǎng)BHK-21細(xì)胞能夠提高細(xì)胞產(chǎn)量，同時懸浮培養(yǎng)方式還可以簡化操作流程，節(jié)省了成本.喬自林[17]等人將此株馴化后的BHK-21懸浮細(xì)胞在5 L生物反應(yīng)器上進(jìn)行培養(yǎng)，分別采用了流加培養(yǎng)方式和批培養(yǎng)方式，其最大增殖密度以及倍增時間均比本研究好，其可能存在的原因是生物反應(yīng)器能更精準(zhǔn)地控制培養(yǎng)過程中的DO、pH等參數(shù)，使得細(xì)胞能在最佳的培養(yǎng)條件下生長.

細(xì)胞的成瘤性使得該細(xì)胞作為生產(chǎn)疫苗等生物制品的細(xì)胞基質(zhì)的可能性大大減小，因為它可能誘導(dǎo)宿主產(chǎn)生腫瘤，也可能將自身攜帶的腫瘤進(jìn)行同質(zhì)異體傳遞，對宿主機體產(chǎn)生很大損傷[24].對于哺乳動物生產(chǎn)的疫苗是否安全，多家醫(yī)藥機構(gòu)進(jìn)行了嚴(yán)謹(jǐn)?shù)尿炞C.研究發(fā)現(xiàn),將完整的MDCK活細(xì)胞注入裸鼠后會形成進(jìn)行性腫瘤[25-27].郝鵬[28]等人也采用降血清的方式,獲得細(xì)胞倍增時間約35 h的懸浮培養(yǎng)型MDBK細(xì)胞.Liu J[29]等人通過單克隆法篩選出了低成瘤性的MDCK細(xì)胞，劉鑫瑩[13]等人也用同樣的方式獲得需添加1%血清的懸浮培養(yǎng)的ST細(xì)胞，這些均表明能增加病毒產(chǎn)量，但細(xì)胞的成瘤性并未明確化，因此還需進(jìn)行摸索.于義娟[30]等人也對懸浮培養(yǎng)的BHK-21細(xì)胞進(jìn)行了裸鼠敏感性實驗，發(fā)現(xiàn)接種低于《中華獸藥典》要求的細(xì)胞量，即103個細(xì)胞也能使裸鼠成瘤.因此，篩選低成瘤性或無成瘤性的BHK-21細(xì)胞勢在必行.

4 結(jié)論

本研究將貼壁型的BHK-21細(xì)胞以及由該細(xì)胞馴化而來的懸浮培養(yǎng)型的BHK-21細(xì)胞接種至裸鼠背部皮下，發(fā)現(xiàn)采用低血清方式馴化得到的BHK-21懸浮細(xì)胞，其成瘤率與貼壁型的BHK-21一致，但其懸浮型的BHK-21細(xì)胞其成瘤體積更大，對裸鼠的機能損壞更為嚴(yán)重.因此，采用低血清馴化獲得BHK-21懸浮細(xì)胞的方式還有待改善，對得到的BHK-21細(xì)胞還需進(jìn)一步探索，以降低其成瘤性，提高生物制品的生物安全性.