王燕新，廖圓圓，郭曉農(nóng),2，蔡德育

( 1．西北民族大學(xué) 生命科學(xué)與工程學(xué)院，甘肅 蘭州 730030;2.蘭州大學(xué) 草地農(nóng)業(yè)科技學(xué)院,草地農(nóng)業(yè)生態(tài)系統(tǒng)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,甘肅 蘭州 730030)

枇杷葉(EriobotryajaponicaThunb)為雙子葉植物，又名蘆桔葉、杷葉，是我國中草藥中的一種藥材[1-2].枇杷葉做成的膏狀物，具止咳祛痰、祛熱潤肺的功能，而蒸制枇杷葉取露，可以解暑.近幾年，一些實(shí)驗(yàn)報(bào)道了枇杷葉內(nèi)有許多已經(jīng)了解的成分，如皂苷、黃酮類、多糖等物質(zhì)[3-5].目前對(duì)枇杷的研究主要集中在止咳祛痰、抗炎消腫、抗腫瘤等方面，而對(duì)于其所含多糖的相關(guān)報(bào)道較少.有研究表明，多糖可以提高人體免疫力[6]，能夠抗腫瘤[7]、抗衰老[8]、抑菌[9].多糖類化合物在生物學(xué)各方面都有較高的利用價(jià)值和開發(fā)潛力.從植物葉片中提取得到的多糖類化合物，已成為全世界關(guān)注的熱門課題，但還缺乏對(duì)多糖成分和藥理的深入探究.因此本實(shí)驗(yàn)選取枇杷葉作為實(shí)驗(yàn)材料，研究其多糖的抗氧化活性.

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

95%乙醇，氯仿，無水乙醇，丙酮，正丁烷，三氯甲烷，6.0 mmol/L硫酸亞鐵溶液，6.0 mmol/L水楊酸，50.0 mmol/LTris-HCl緩沖液，5.0 mmol/L鄰苯三酚溶液，0.2 mol/L磷酸緩沖液(pH6.6)，1%鐵氰化鉀溶液，0.1%三氯化鐵，不同濃度的過氧化氫溶液，15%三氯乙酸，0.67%硫代巴比妥酸.試驗(yàn)試劑均為國產(chǎn)分析純.

1.2 儀器與設(shè)備

加熱套，球形燒瓶，冷凝管，旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀，坩堝，水浴鍋，離心機(jī)，分光光度計(jì)，電子天平等.

1.3 方法

1.3.1 枇杷葉的預(yù)處理

枇杷葉除去塵土和葉背部毛絮，蒸餾水潤洗放入托盤并用60 ℃的烘箱烘烤24 h，粉碎備用.

1.3.2 枇杷葉多糖的粗提

稱取50 g枇杷葉原材料粉末，按照料液質(zhì)量體積比1∶20加入蒸餾水，回流法提取三次，每次2.5 h，合并提取液.旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀蒸發(fā)合并的提取液，得到濃縮液500 mL，90 ℃水浴鍋中水浴2 h至葉綠素完全析出.濾除葉綠素沉淀后加3倍體積95%乙醇靜置48 h進(jìn)行醇沉(醇沉3次)，使多糖完全沉淀，所得溶液為多糖粗提取物.

1.3.3 枇杷葉多糖的精提

用濾紙過濾上述所得溶液，得到浸膏.將浸膏轉(zhuǎn)入坩堝，沸水浴加熱濃縮，即得粗多糖干品，稱重，計(jì)算得率.將得到的羅布麻粗多糖干品用蒸餾水溶解，通過SevAge法除去蛋白， 再加入3倍體積95%的乙醇，使乙醇最終體積為80%，4 ℃靜置24 h.離心后將沉淀備用， 并用95%的乙醇、無水乙醇、丙酮以及乙醚分別對(duì)得到的沉淀進(jìn)行清洗，最后在60 ℃下烘干，即可得到枇杷葉多糖[10].

1.3.4 枇杷葉多糖含量測定1.3.4.1 多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制備

參照李瑞燕[11]研究方法進(jìn)行多糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的繪制.

1.3.4.2 提取物中多糖含量的測定

準(zhǔn)確稱取干燥的枇杷葉多糖的粉末約2 mg，配制成0.2、 0.4、 0.6、0.8、 1.0、1.2 mg/mL的溶液,測定樣品吸光度值即可反映樣品的多糖含量.

1.4 枇杷葉多糖體外抗氧化能力的研究

本實(shí)驗(yàn)通過枇杷葉多糖對(duì)羥自由基清除作用、超氧自由基的清除作用、還原作用，以及用分光光度法對(duì)DPPH自由基清除作用來探究枇杷葉多糖的抗氧化活性作用的強(qiáng)弱，并用維生素C(Vc)作為陽性對(duì)照.

1.4.1 樣品溶液制備

將枇杷葉多糖先配制成2 mg/mL的起始濃度備用，再將樣品及標(biāo)品Vc依次配成濃度為0.2、0.4、0.6、0.8、1.0、1.2 mg/mL，保鮮膜封口待用，并用標(biāo)準(zhǔn)Vc做陽性對(duì)照.

1.4.2 對(duì)羥自由基的清除作用[12-13]

取10 mL具塞試管，按順序加入6 mmol/L FeSO42 mL，6 mmol/L水楊酸2 mL，不同濃度的樣品溶液2 mL，最后加6 mmol/LH2O22 mL進(jìn)行啟動(dòng)反應(yīng)，37 ℃下反應(yīng)1 h，在510 nm下測量各濃度的吸光度.以蒸餾水替換樣品形成一個(gè)空白對(duì)照組.以濃度為6 mmol/L的 FeSO4、濃度為6 mmol/L的水楊酸和蒸餾水各2 mL混合形成樣品的本底吸收(即不加H2O2).計(jì)算羥自由基清除率.

清除率(%) =[A0-(Ax-Ax0)]/A0×100%

上式中的A0為空白對(duì)照組的A值，Ax為加入樣品后的A值，Ax0為樣品本底的A值.

1.4.3 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用[14]

取10 mL具塞試管，分別加入50 mmol/L Tris-HCl緩沖液(pH8.2，含2 mmol/LEDTA-2NA)4.5 mL、5.0 mmol/L鄰苯三酚溶液(以10 mmol/L鹽酸配制)0.2 mL.之后添加上述的枇杷葉多糖樣品1.0 mL，蒸餾水2.5 mL，將其混勻.以體積相等的10 mmol/L的鹽酸替換鄰苯三酚為空白調(diào)零，用相等的去離子水取代樣品作為對(duì)照組.于25 ℃下放置20 min，在波長為325 nm下檢測樣品和對(duì)照管的A值，每次檢測相隔30 s，計(jì)算A值(吸光度)在線性范圍內(nèi)跟時(shí)間的改變值的關(guān)系，多次測量并計(jì)算，此步驟操作3次.以Vc陽性作對(duì)照組，同種方法也進(jìn)行3次平行試驗(yàn)，取平均值.然后計(jì)算超氧陰離子自由基的清除率.

清除率=(V1-V2)/V1×100%

上式中V1為對(duì)照組鄰苯三酚的自氧化速率△A/min；V2為樣品，管鄰苯三酚的自氧化速率△A/min.

1.4.4 還原能力的測定[15]

依次取各樣品溶液2 mL，吸取0.2 mol/L的磷酸鹽緩沖液(pH 6.6)2 mL后加入1%鐵氰化鉀2 mL，搖勻后在50 ℃水浴鍋中放置20 min，使其充分反應(yīng).從水浴鍋中拿出后充分混勻加入2 mL的10%三氯乙酸.再用移液槍吸取2 mL的混合溶液，加上2 mL蒸餾水和0.4 mL 的0.1%的三氯化鐵于反應(yīng)管中，反應(yīng)10 min后，于700 nm波長處測定A值.以Vc作陽性對(duì)照，用上述同種方法重復(fù)操作.

1.4.5 對(duì)DPPH自由基的清除作用

量取2 mL的DPPH溶液，加入2 mL的95%的乙醇，完全混合均勻后測519 nm處的A值.此時(shí)的A值為A0.

量取2 mL的DPPH溶液，加入樣品溶液2 mL，完全混勻，靜置30分鐘后，測519 nm處的A值.

清除率=(A0-A)/A0×100%

2 結(jié)果與分析

2.1 對(duì)羥自由基的清除作用

羥自由基是毒害極強(qiáng)、風(fēng)險(xiǎn)極高的一類活性氧物質(zhì).羥自由基可以消滅紅細(xì)胞，降解DNA及細(xì)胞膜、多糖等物質(zhì).大部分由羥自由基所導(dǎo)致的不良后果會(huì)因加入羥自由基清除劑后大幅度改善.羥自由基的清除率是評(píng)判相關(guān)藥品抗氧化能力不可或缺的依據(jù).探討羥自由基的清除劑對(duì)探究和揭示一些發(fā)病原因、致病機(jī)理、衰老原理是不可小覷的.在羥自由基清除的反應(yīng)中，H2O2和鐵離子二價(jià)狀態(tài)時(shí)接觸后會(huì)發(fā)生芬頓反應(yīng)，并且可以產(chǎn)生羥自由基，且其活性很高.這個(gè)自由基能與水楊酸有效結(jié)合，會(huì)得到有顏色的化合物.但在這個(gè)體系中可添加某些作為清除劑的化合物.這個(gè)物質(zhì)就會(huì)與水楊酸發(fā)生競爭反應(yīng)且為良性的，可以降低合成有顏色物質(zhì)的量.因此，可利用吸光值的變動(dòng)來評(píng)價(jià)枇杷葉多糖對(duì)羥自由基的清除效力[16].

圖1葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線 圖2對(duì)羥自由基的清除作用

由圖2可知，隨著枇杷葉多糖質(zhì)量濃度的增加，其對(duì)羥自由基的清除也隨之加強(qiáng)，同時(shí)對(duì)照組Vc的清除能力也伴著其質(zhì)量濃度的加大而增強(qiáng).最后根據(jù)分析得出，在0.2～1.2 mg/mL的質(zhì)量濃度時(shí)，枇杷葉多糖和Vc的變化程度與自由基清除作用都呈弱線性相關(guān).由圖中結(jié)果可以看出,對(duì)羥自由基的清除能力Vc好于枇杷葉多糖.

2.2 對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用

超氧陰離子是全部自由基的前身，在生物體內(nèi)的反應(yīng)中進(jìn)行氧化還原反應(yīng)，有2%～5%的氧可能會(huì)生成超氧陰離子自由基，且有毒，它的毒作用會(huì)導(dǎo)致氧中毒反應(yīng).在堿性環(huán)境下鄰苯三酚能夠自氧化并且產(chǎn)生中間產(chǎn)物，然而它卻能促使鄰苯三酚的自氧化，在實(shí)驗(yàn)下可以測得物質(zhì)對(duì)鄰苯三酚自氧化的阻礙作用，從而可以表現(xiàn)其對(duì)超氧自由基的清除能力.

由圖3顯示，由于枇杷葉多糖和Vc溶液質(zhì)量濃度的加大，枇杷葉多糖對(duì)超氧自由基的清除率呈顯著遞增作用，維生素C的清除率也呈上升趨勢.從圖3可以得出結(jié)論：枇杷葉多糖和Vc的變化趨勢與自由基清除能力呈線性相關(guān)關(guān)系，而且Vc的線性相關(guān)關(guān)系略好于枇杷葉多糖.

2.3 還原能力的測定

反應(yīng)的還原效果可以用抗氧化劑的抗氧化效果反映出來.它的機(jī)理是添加物將鐵氰化鉀變成了亞鐵氰化鉀，亞鐵氰化鉀再與三價(jià)鐵反應(yīng)，生成一種物質(zhì)叫做普魯士藍(lán),并在700 nm處測它的A值(吸光度),以此來評(píng)估還原力的強(qiáng)弱：A值(吸光值)越高，則顯示所加物的還原能力越強(qiáng).

圖3對(duì)超氧陰離子自由基的清除作用 圖4還原能力的測定

由圖4顯示，隨著質(zhì)量濃度的加大，枇杷葉多糖和Vc的吸光度值也增大，即其還原的能力也在呈增強(qiáng)趨勢.從圖4可以得出結(jié)論：枇杷葉多糖的還原能力與質(zhì)量濃度呈線性相關(guān)，而且強(qiáng)于Vc的線性相關(guān)關(guān)系.

2.4 對(duì)DPPH自由基的清除作用

DPPH(1,1-Diphenyl-2-picrylhydrazyl radical)即1,1-二苯基-2-苦基肼基自由基，由于其分子中存在數(shù)個(gè)吸引電子的-NO2和苯環(huán)的大π鍵，故氮自由基可以保持穩(wěn)定.當(dāng)清除掉體系中的DPPH自由基時(shí)，其在519 nm處的A值就會(huì)下降.DPPH作為穩(wěn)定的自由基，可用來檢測清除自由基活性的情況，能夠提供理想而簡單的藥理模型.

由圖5結(jié)果可知，枇杷葉多糖對(duì)DPPH自由基的清除率在質(zhì)量濃度為0.2～1.2 mg/mL時(shí)，隨著枇杷葉多糖溶液濃度和Vc溶液濃度的增加，其清除率逐漸增加，呈現(xiàn)弱線性關(guān)系.可見枇杷葉多糖和Vc對(duì)DPPH自由基表現(xiàn)出較好的清除效果，而且Vc溶液對(duì)DPPH的清除率在1.0 mg/mL處達(dá)到99.5%.枇杷葉多糖對(duì)DPPH自由基清除能力略弱于Vc溶液.

圖5 對(duì)DPPH自由基的清除作用

2.5 討論

本次實(shí)驗(yàn)以Vc為對(duì)照組，從四個(gè)方面對(duì)枇杷葉多糖的抗氧化能力進(jìn)行評(píng)價(jià)，從所得結(jié)論的折線圖可以看出枇杷葉多糖都有著較為顯著的抗氧化活性，而且枇杷葉多糖的濃度越大，效果越明顯.變化程度與羥自由基清除效果，超氧陰離子的清除效果，還原能力以及對(duì) DPPH自由基的清除能力都呈線性相關(guān).在還原能力的測定中表現(xiàn)出枇杷葉多糖高于Vc，但是對(duì)超氧陰離子、羥自由基和DPPH自由基的清除能力均表現(xiàn)為枇杷葉多糖略低于Vc.通過實(shí)驗(yàn)得到的數(shù)據(jù)做出折線圖后分析得到：枇杷葉多糖是一種含一定的抗氧化能力物質(zhì)，而且其抗氧化的作用呈弱線性關(guān)系.Vc是一種具有較強(qiáng)抗氧化能力的抗氧化劑，可以作為自由基清除劑.

3 結(jié)論

通過水提法所得枇杷葉多糖提取率為6.43%.其體外抗氧化活性的研究表明，羥自由基的清除率、超氧陰離子自由基清除率以及DPPH的自由基的清除率均隨枇杷葉多糖濃度的增加而增加，最高清除率分別為59.4%、62%、73.9%，說明枇杷葉多糖具有良好的抗氧化活性，有較強(qiáng)的自由基清除能力，還具有一定的抗氧化能力.