邱 靜，楊 瓊，譚子虎，謝文婷，王小燕

(1.湖北中醫(yī)藥大學(xué)中醫(yī)臨床學(xué)院，湖北 武漢 430061；2.湖北省中醫(yī)院老年病科，湖北 武漢 430061)

阿爾茨海默病(Alzheimer’s disease AD)是發(fā)生于老年和老年前期，以進行性認(rèn)知功能障礙和行為損害為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)退行性病變[1]。其患病率隨年齡增長而逐漸升高[2]。目前AD發(fā)病機制尚未闡明，其中β淀粉樣蛋白(amoyloid-beta，Aβ)沉積是AD發(fā)生發(fā)展的關(guān)鍵，也是導(dǎo)致其他病理改變的起始環(huán)節(jié)。Aβ沉積誘導(dǎo)小膠質(zhì)細(xì)胞(microglial，MG)激活被認(rèn)為是AD發(fā)病的核心病理機制之一。髓細(xì)胞觸發(fā)受體2(triggering receptor expressed on moyeloid cells 2，TREM2)是MG上表達(dá)的特異性基因，其R47H位點基因突變可以增加近3倍罹患AD的風(fēng)險[3]。研究發(fā)現(xiàn)，調(diào)節(jié)TREM2表達(dá)水平可以影響MG功能，改善AD病理改變[4]。

AD屬于中醫(yī)“癡呆”“健忘”等范疇，中醫(yī)認(rèn)為其病機為“髓減腦消、神機失用”，筆者臨證以健脾補腎、化痰祛瘀為法，擬方加減薯蕷丸，取得顯著療效。前期研究顯示，加減薯蕷丸可以抑制Aβ沉積，改善癡呆模型大鼠的認(rèn)知功能，但其是否影響TREM2表達(dá)尚未進行相關(guān)研究。本實驗擬通過加減薯蕷丸干預(yù)AD模型大鼠，觀察其對AD模型大鼠海馬區(qū)TREM2和Iba1蛋白表達(dá)水平及對Iba1+細(xì)胞數(shù)量的影響，探討其改善AD認(rèn)知功能的可能機制，為臨床應(yīng)用提供更多證據(jù)支持。

1 材料

1.1 實驗動物 SPF級健康雄性SD大鼠30只，購于湖北省實驗動物研究中心，生產(chǎn)許可證號：SCXK(鄂)2015-0018，體質(zhì)量(200±20)g，飼養(yǎng)于湖北省中醫(yī)院實驗動物中心，通過Morris水迷宮測試篩選出健康大鼠，隨機分為正常組、模型組、中藥組，每組10只。

1.2 實驗藥物 加減薯蕷丸：現(xiàn)為湖北省中醫(yī)院的院內(nèi)制劑——薯蕷健脾益智合劑，批準(zhǔn)文號為鄂藥制字Z20150027，由山藥、熟地黃、黨參、白芍、當(dāng)歸等14味中藥組成，由湖北省中醫(yī)院藥材制劑科進行煎煮濃縮提純制備為口服液250 mL，真空包裝，每毫升含原藥材1 g。

2 方法

2.1 AD模型大鼠制備

2.1.1 Aβ1-42寡聚體制備 將Aβ1-42粉末加入預(yù)冷的200 μL六氟異丙醇(Hexafluoroisopropanol，HFIP)，使其最終濃度為1 mmoL/L；輕輕吹打瓶壁，使Aβ粉末充分溶解，在常溫下孵育60 min。隨后將其放在冰上5～10 min，轉(zhuǎn)移并分裝至離心管中，在室溫下使HFIP揮發(fā)，第2日用真空濃縮離心機使HFIP徹底蒸發(fā)，在離心管底可見一層薄膜，將薄膜置于-80 ℃中凍存。需要時再將膜取出，在二甲基亞砜中溶解，使其最終濃度為5 mmol/L；用F12培養(yǎng)基(不含有酚紅)進行稀釋，4 ℃下孵育24 h；14 000 r/min冰凍離心機離心10 min，最終形成的清液即為Aβ1-42寡聚體。

2.1.2 SD大鼠雙側(cè)側(cè)腦室注射Aβ1-42建立AD模型 參照文獻[5]制備AD大鼠模型，使用異氟烷對大鼠進行吸入麻醉。將處于麻醉狀態(tài)的大鼠固定于腦立體定位儀上，將大鼠顱頂正中部皮膚切開以充分暴露顱骨，用H2O2輕輕擦拭清理周圍組織，使前囟和中線都充分暴露。在中線旁左側(cè)1.5 mm，用鈍性注射器針頭輕鉆顱骨，用腦定位儀及微量進樣器在大鼠左側(cè)側(cè)腦室進行定位(前囟后0.8 mm，中線旁左側(cè)1.5 mm，深度4 mm)。用微量進樣器注射針，緩慢注入Aβ1-42 2 μL，注射時間>3 min，留針2 min，并緩慢撤針，防止注射的Aβ1-42從針道溢出。用同樣方法進行右側(cè)側(cè)腦室立體定位下注射Aβ1-42。注射完成后清理創(chuàng)口，縫合皮膚，并給予常規(guī)抗感染治療，注意觀察大鼠一般情況。模型復(fù)制1周后，采用行為學(xué)評分篩選模型復(fù)制成功大鼠。

2.2 給藥方法 各組模型復(fù)制成功的大鼠，7 d后開始灌胃：正常組、模型組大鼠每日給予10 mL/kg生理鹽水灌胃，參考前期研究文獻，加減薯蕷丸10 g/kg對大鼠發(fā)揮最佳劑量效應(yīng)[6]，因此中藥組大鼠每日給予加減薯蕷丸10 g/kg灌胃，共灌胃4周。

2.3 檢測指標(biāo)及方法

2.3.1 Western blot法檢測TREM2、Iba1蛋白表達(dá)水平 大鼠腹腔麻醉后直接斷頭取腦，冰上迅速分離雙側(cè)海馬，用于指標(biāo)檢測。海馬組織勻漿后加入裂解液進行裂解，并對蛋白濃度進行定量；取等量組織加入蛋白變性劑，在100 ℃水中煮10 min使蛋白變性；取50 μg變性后蛋白用15% 蛋白凝膠電泳進行分離，后轉(zhuǎn)移到聚偏二氟乙烯膜上，使用5%脫脂牛奶進行封閉1 h后，孵育一抗(TREM2濃度為1∶100，Iba1及GADPH濃度為1∶1 000)4 ℃過夜；進行洗脫后滴加二抗，37 ℃下孵育2 h，洗脫后進行化學(xué)發(fā)光液顯色、曝光并進行定量分析。晾干膠片，掃描膠片，用BandScan分析膠片灰度值。

2.3.2 免疫熒光染色觀察各組海馬區(qū)MG數(shù)量 大鼠腹腔麻醉后，生理鹽水灌注心臟。取大鼠海馬組織，用4%中性甲醛緩沖液實施固定。梯度乙醇進行脫水，二甲苯透明處理，采用石蠟包埋切片(4 μm)。用二甲苯脫蠟處理，經(jīng)不同濃度梯度乙醇進行水化處理，然后蒸餾水浸洗。用修復(fù)液(0.01 mmol/L枸櫞酸緩沖液，pH 6.0)95 ℃孵育10～15 min，放置40 min使其冷卻到室溫。用山羊血清在常溫條件下封閉30 min；在避光的條件下采用標(biāo)準(zhǔn)化熒光素進行標(biāo)記抗體，并在37 ℃的條件下孵育30 min，并用緩沖液沖洗浸泡處理，每次3 min。封片，并于暗室條件下采用熒光顯微鏡觀察。使用IPP 6.0軟件對免疫熒光照片進行光密度分析，每張切片選取3張400倍照片。

3 結(jié)果

3.1 各組大鼠海馬區(qū)TREM2、Iba1蛋白表達(dá)水平比較 與正常組比較，模型組TREM2蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)；與模型組比較，中藥組TREM2蛋白表達(dá)水平顯著降低(P<0.05)，Iba1蛋白表達(dá)水平顯著增加(P<0.05)。見圖1、圖2。

3.2 免疫熒光染色 中藥組Iba1+細(xì)胞平均光密度值為(0.019 8±0.003 1)，模型組平均光密度值為(0.018 7±0.003 1)，正常組平均光密度值為(0.015 7±0.003 5)，組間比較差異均有統(tǒng)計學(xué)意義(P<0.05)，與模型組比較，中藥組海馬區(qū)Iba1+細(xì)胞數(shù)量明顯增加(P<0.05)。見圖3。

圖1Westernblot法檢測加減薯蕷丸對AD模型大鼠海馬區(qū)TREM2及Iba1蛋白表達(dá)水平的影響

注：與正常組比較，*P<0.05；與模型組比較，#P<0.05

4 討論

TREM2是在MG上表達(dá)的免疫受體，可通過與各種配體結(jié)合，如Aβ、載脂蛋白、脂蛋白或陰離子脂質(zhì)，激活Wnt/β-catenin信號通路促進MG增殖，并通過Akt/GSK3β通路抑制MG凋亡；TREM2可以調(diào)節(jié)炎癥小體的關(guān)鍵成分，以抑制MG增生；TREM2還可以激活PI3K/AKT/mTOR通路，調(diào)節(jié)MG自噬并維持細(xì)胞能量和生物合成代謝，從而促進MG的存活[7]。TREM2作為感受因子探測細(xì)胞受損后釋放的脂類物質(zhì)從而進一步引發(fā)細(xì)胞吞噬作用，TREM2在R47H位點突變會抑制細(xì)胞對脂類物質(zhì)的敏感性，降低MG介導(dǎo)的吞噬作用，從而促進中樞神經(jīng)系統(tǒng)(central nervous system，CNS)中的炎癥反應(yīng)。TREM2除了上調(diào)參與AD調(diào)控，下調(diào)之后同樣可以參與AD調(diào)控。本研究發(fā)現(xiàn)，加減薯蕷丸可以降低AD模型大鼠海馬區(qū)TREM2蛋白表達(dá)水平。在AD患者及動物模型中本身存在TREM2蛋白的大量表達(dá)，這種表達(dá)的上調(diào)與Aβ區(qū)域分布及Aβ含量呈正相關(guān)[9]。減少TREM2表達(dá)，可以減少Aβ斑塊周圍相關(guān)巨噬細(xì)胞的聚集，減少神經(jīng)炎癥因子的表達(dá)，同時可以減少Aβ的沉積[10]。6月齡SD大鼠比2月齡大鼠探究行為增多、學(xué)習(xí)記憶能力增強，其機制與海馬區(qū)TREM2蛋白水平下降有關(guān)[11]。阻斷MG上的TREM2信號可以減輕神經(jīng)炎癥，可以在Tau蛋白病變環(huán)境中防治神經(jīng)退行性變[12]。

圖3免疫熒光染色顯示各組大鼠海馬區(qū)Iba1+細(xì)胞(10×40倍，綠色箭頭示Iba1+細(xì)胞)

MG在CNS的損傷和修復(fù)中發(fā)揮重要作用，是CNS最重要的免疫防線[13]。MG參與AD發(fā)生和發(fā)展，Aβ沉積導(dǎo)致的MG激活在發(fā)病過程中起著雙重作用：Aβ沉積可以誘導(dǎo)MG趨化，使MG向Aβ沉積區(qū)域聚集，發(fā)揮吞噬作用；而激活MG可以分泌促炎因子和神經(jīng)毒素，導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞損傷和死亡[14]。骨髓來源的巨噬細(xì)胞具有更強的Aβ吞噬能力，促進骨髓來源巨噬細(xì)胞向Aβ沉積區(qū)域趨化，增加其吞噬Aβ的能力，同時調(diào)節(jié)腦內(nèi)MG的活化狀態(tài)由致炎的M1型向抗炎的M2型轉(zhuǎn)變，是AD防治的潛在靶點。Iba1是在一個17 kDa的鈣結(jié)合蛋白，可以同時標(biāo)記巨噬細(xì)胞和MG[16]。在CNS內(nèi)Iba1是MG特異性標(biāo)記物[17]，但在本研究中，Iba1可能既標(biāo)記了CNS內(nèi)的MG，同時也標(biāo)記了外周來源的巨噬細(xì)胞。正常情況下大腦存在完整的血腦屏障，外周巨噬細(xì)胞不容易穿過血腦屏障進入腦實質(zhì)內(nèi)，但本實驗?zāi)Ｐ蛷?fù)制過程中對大鼠腦結(jié)構(gòu)完整性造成創(chuàng)傷，巨噬細(xì)胞通過損傷部位進入到CNS內(nèi)，導(dǎo)致模型組海馬區(qū)Iba1的蛋白水平升高，免疫熒光染色顯示海馬區(qū)Iba1+數(shù)量明顯增多。經(jīng)加減薯蕷丸干預(yù)后，中藥組Iba1蛋白水平和Iba1+細(xì)胞增加較模型組更多，加減薯蕷丸具有健脾補腎、化痰祛瘀的功效，腎藏精、主骨生髓、通于腦，通過補腎作用促進外周骨髓來源的巨噬細(xì)胞向腦內(nèi)趨化，這與中醫(yī)“腎生髓充腦”理論具有一定的相似性，同時加減薯蕷丸組方中白芍、當(dāng)歸、川芎等活血化瘀藥物可能在其中也起到重要促進作用。

加減薯蕷丸來源于漢代張仲景《金匱要略》中的薯蕷丸，由已故名老中醫(yī)呂繼端教授去其祛風(fēng)之藥，取其補中之效，同時加用補腎填精、化痰開竅藥物以切合癡呆脾腎虧虛、痰瘀互結(jié)的病機化裁形成，方中山藥、熟地黃、制何首烏、杜仲、枸杞子、五味子滋補肝腎、填精益髓；黨參、白術(shù)、茯苓健脾益氣；石菖蒲、遠(yuǎn)志化痰開竅益智；白芍、當(dāng)歸、川芎活血祛瘀；全方共奏健脾補腎、化痰祛瘀、開竅益智之效。前期臨床研究顯示加減薯蕷丸可有效改善AD患者的簡易智力狀態(tài)檢查量表評分、AD評定量表認(rèn)知部分評分及中醫(yī)證候積分[18]。前期動物實驗發(fā)現(xiàn)加減薯蕷丸可以減少腦低灌注模型Aβ沉積并減少Tau蛋白磷酸化水平[19]?，F(xiàn)代藥理學(xué)研究也證實，加減薯蕷丸方中多種中藥及其有效成分可以起到改善AD病理和認(rèn)知功能的作用。如石菖蒲中有效成分β細(xì)辛醚可以通過核因子κB信號通路抑制MG的活化，從而發(fā)揮抗炎作用[20]。白芍總苷可以通過抑制MG過度激活及炎癥細(xì)胞因子的過表達(dá)，改善Aβ沉積導(dǎo)致的海馬區(qū)炎癥反應(yīng)[21]。遠(yuǎn)志提取物可以通過調(diào)節(jié)腦源性神經(jīng)營養(yǎng)因子及其受體酪氨酸受體激酶受體B信號通路促進Aβ降解，改善AD小鼠的學(xué)習(xí)記憶功能[22]；遠(yuǎn)志總皂苷可通過提高AD模型大鼠海馬區(qū)nAChRα7的表達(dá)，改善AD大鼠的認(rèn)知功能[23]。山藥可以通過增強腦組織ATP酶活性提高機體抗氧化能力，改善癡呆小鼠認(rèn)知功能[24]。

AD的發(fā)病機制存在多種假說，Aβ瀑布學(xué)說在其中占據(jù)核心地位，Aβ可與MG上多種受體結(jié)合，引起多條信號通路激活的級聯(lián)反應(yīng)，而這些激活的通路又經(jīng)過彼此之間的相互作用而影響器官、細(xì)胞等最終功能狀態(tài)。本研究發(fā)現(xiàn)，加減薯蕷丸可以降低海馬區(qū)TREM2蛋白水平表達(dá)，同時增加海馬區(qū)Iba1+細(xì)胞數(shù)量，推測加減薯蕷丸可能通過減少Aβ介導(dǎo)的神經(jīng)炎癥，同時增加發(fā)揮吞噬Aβ作用的外周巨噬細(xì)胞數(shù)量來發(fā)揮改善AD病理的作用。但AD本身發(fā)病機制復(fù)雜，加減薯蕷丸作用于AD的相關(guān)機制仍需要進行深入研究。