陳麗潔 梁景耀 張錫寶 邵蕾 潘清麗 何素玲 劉玉梅 王建琴

廣州醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所 廣州市皮膚病防治所 510095

特應(yīng)性皮炎（atopic dermatitis，AD）是一種常見的慢性遺傳相關(guān)性炎癥性皮膚病，發(fā)病機(jī)制尚未完全明確。多認(rèn)為AD 發(fā)病與遺傳易感性、環(huán)境因素以及免疫因素密切相關(guān)［1］。目前對(duì)AD分子表型的認(rèn)識(shí)多基于基因芯片或者實(shí)時(shí)定量聚合酶鏈反應(yīng)測定等方法，而基于新一代RNA測序（RNA-seq）的研究很少。自2001年他克莫司及吡美莫司外用制劑上市以來，暫未見其他可以廣泛使用的安全高效治療AD的藥物［2］。提高對(duì)AD分子表型的認(rèn)識(shí)，有助于其新療法，特別是靶向治療的研發(fā)。RNA-seq能夠彌補(bǔ)表達(dá)譜芯片研究的不足，它不依賴于預(yù)設(shè)計(jì)，允許對(duì)整條基因組進(jìn)行分析，更大范圍地準(zhǔn)確檢測基因表達(dá)水平。轉(zhuǎn)錄組（transcriptome）指特定組織或細(xì)胞在某一功能狀態(tài)下所有轉(zhuǎn)錄本的總和，包括編碼RNA（mRNA）和非編碼RNA（ncRNA），它們能夠反映細(xì)胞的生長、發(fā)育、凋亡等一系列重要的生理過程。以Illumina 為基礎(chǔ)的轉(zhuǎn)錄組測序RNA-Seq，具有通量更高、運(yùn)行時(shí)間更短、測序片段更長、分析成本更低等優(yōu)點(diǎn)。本研究運(yùn)用RNA-seq技術(shù)篩選AD 皮損及非皮損組織的差異表達(dá)基因，從功能基因組水平揭示AD 的發(fā)病機(jī)制，為AD 的分子診斷、藥物治療、預(yù)防和新型藥物研發(fā)提供新的契機(jī)。

對(duì)象與方法

一、對(duì)象

選取2016年7-10月于廣州市皮膚病防治所/廣州醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所門診就診的5 例漢族AD患者，男3例，女2例，年齡9 ～ 23歲。

納入標(biāo)準(zhǔn)：①符合Williams診斷標(biāo)準(zhǔn)；②SCORAD評(píng)分＞25的中重度患者［3］；③切取皮損組織前1周沒有局部外用藥物治療，2 周內(nèi)未口服治療AD 的藥物。排除標(biāo)準(zhǔn)：患藥疹、高IgE綜合征、惡性嗜酸性粒細(xì)胞增多、皮膚感染、結(jié)締組織病及腫瘤性疾病等。選取腹部（2例）、背部（2例）或大腿處（1例）皮損及非皮損部位（在皮損邊緣取材，離皮損區(qū)約1.5 cm）皮膚組織，分別裝入有RNAlater 保存液（德國，Qiagen公司）的5 ml凍存管，-80 ℃冰箱保存，用于后續(xù)總RNA提取。

本研究經(jīng)過廣州市皮膚病防治所/廣州醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號(hào)：201611），取材前受試者或其監(jiān)護(hù)人均簽署知情同意書。

二、方法

1.RNA 提取及轉(zhuǎn)錄組測序：按照Trizol（美國Invitrogen 公司）法提取總RNA，構(gòu)建文庫，使用Agilent 2100 Bioanalyzer（RNA 6000 Nano Kit，美國Agilent 公司）檢測總 RNA 濃度、RIN 值、28S/18S 和片段大小。qRT-PCR 對(duì)文庫的有效濃度進(jìn)行準(zhǔn)確定量，以保證文庫質(zhì)量?；谶吅铣蛇厹y序（sequencing by synthesis，SBS）技術(shù)，利用 BGISEQ-500（深圳華大基因）平臺(tái)進(jìn)行高通量測序，得到100 bp的測序讀長。

2.測序數(shù)據(jù)過濾：將測序所得的原始數(shù)據(jù)（即raw reads）中低質(zhì)量、接頭污染以及未知堿基N 含量過高的reads 過濾掉，得到有效reads（即clean reads），以保證結(jié)果的可靠性。

3.基因差異分析、功能注釋及生物學(xué)通路分析：使用DEseq2和PossionDis方法進(jìn)行差異檢測分析，DEseq2方法基于負(fù)二項(xiàng)分布原理，本研究根據(jù)既往文獻(xiàn)［4-5］描述的方法進(jìn)行差異表達(dá)基因檢測。對(duì)差異檢驗(yàn)得到的P值做多重假設(shè)檢驗(yàn)校正［6］，通過控制錯(cuò)誤發(fā)現(xiàn)率（false discovery rate，F(xiàn)DR），用于控制多重試驗(yàn)中的Ⅰ型錯(cuò)誤率［7］來決定P值的閾值。不同樣品之間表達(dá)水平變化倍數(shù)超過2 倍（|log2FC| ≥ 1）且FDR 校正P＜ 0.05 表示差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。根據(jù)差異基因檢測結(jié)果，使用R軟件中的pheatmap 函數(shù)進(jìn)行層次聚類分析。利用基因本體 論（gene ontology，GO）數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.geneontology.org/）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行功能注釋，采用 COG（cluster of orthologous groups of proteins）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行分類統(tǒng)計(jì)，P≤0.01的功能視為顯著富集。利用KEGG（Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes）數(shù)據(jù)庫（http：//www.genome.jp/kegg）對(duì)差異表達(dá)基因進(jìn)行pathway 功能分析，P≤0.01的通路視為顯著富集。

表1 候選基因引物序列

4.qRT-PCR 驗(yàn)證候選基因：為驗(yàn)證AD 患者轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果的準(zhǔn)確性，選取轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果中的5條基因，在NCBI上檢索目的基因CXCL1、KRT6A、IL36A、SERPINB4、PSAPL1 的 mRNA，用 Primer Premier5 設(shè)計(jì)引物，見表 1。另外選取 5 例 2018 年5-7月在廣州市皮膚病防治所/廣州醫(yī)科大學(xué)皮膚病研究所門診就診的中重度漢族AD 患者，排除和納入標(biāo)準(zhǔn)同前，男4例，女1例，年齡17 ～25歲?；颊呋蚱浔O(jiān)護(hù)人簽署知情同意書后，每例取皮損、非皮損部位組織各1 份，分別提取總RNA，逆轉(zhuǎn)錄為cDNA，使用ChamQ SYBR qPCR Master Mix 試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司），參照說明書進(jìn)行qPCR 擴(kuò)增，依據(jù)Real-time Quantitative PCR（美國ABI公司，StepOne Plus）系統(tǒng)說明書進(jìn)行qRT-PCR。每份樣品重復(fù)檢測3次，采用2-△△Ct法進(jìn)行相對(duì)表達(dá)量計(jì)算。

結(jié) 果

一、RNA-seq數(shù)據(jù)分析

通過RNA-seq分析，每份樣品平均獲得10.96 Gb數(shù)據(jù)，clean reads Q30 都在84.4%以上。共檢測到基因21 729 條，其中已知的基因?yàn)?9 268 條，預(yù)測新基因?yàn)? 545 條。檢測出23 153 個(gè)新轉(zhuǎn)錄本，其中18 889 個(gè)屬于已知蛋白編碼基因的新的可變剪接亞型，2 545個(gè)屬于新的蛋白編碼基因的轉(zhuǎn)錄本，其余1 719個(gè)屬于長鏈非編碼RNA。

二、差異表達(dá)基因檢測

RNA-seq 分析顯示，AD 患者皮損與非皮損組織相比，78 條基因表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，其中67 條在皮損中高表達(dá)，11 條低表達(dá)，包括已知與AD 炎癥（CXCL1/2/8、IL6/IL1β、MMP1、SERPINB4、S100A2、GZMB、OASL、OSM）、屏障功能（KRT16、FABP5、CYP1A1）、角質(zhì)形成細(xì)胞分化（IL-20）等相關(guān)的基因。見圖1、表2。在類聚分析熱圖中，皮損和非皮損表達(dá)的基因可以明顯的區(qū)分出來，見圖2，表明皮損和非皮損有各自特征的表達(dá)譜，有不同的病理生理學(xué)發(fā)病機(jī)制。

三、差異表達(dá)基因的GO分析

對(duì)這些差異表達(dá)基因進(jìn)行GO 分析顯示，在生物過程分類中，數(shù)量最多的是參與細(xì)胞過程（53 條）的基因，第2、3 位分別是參與單組織過程（47條）和代謝過程（45條）的基因。在分子功能分類中，催化活性（46 個(gè)）和結(jié)合整合功能（27 個(gè)）的基因數(shù)量最多。在細(xì)胞組分分類中，細(xì)胞（43個(gè)）、細(xì)胞組分（43 個(gè)）、細(xì)胞膜（30 個(gè)）基因數(shù)位居前三。此外，34條基因參與刺激反應(yīng)，27條參與多細(xì)胞生物過程，還有其他較多基因參與生物調(diào)控、定位和信號(hào)傳遞相關(guān)功能。見圖3。

圖1 5 例特應(yīng)性皮炎皮損與非皮損組織差異基因表達(dá)量比較 1 ～5：分別為病例1 ～5的皮損與非皮損比較；6：5例合計(jì)的皮損與非皮損比較

表2 特應(yīng)性皮炎皮損與非皮損組織相比差異表達(dá)基因及差異倍數(shù)

圖2 特應(yīng)性皮炎皮損與非皮損基因表達(dá)聚類分析 1 ～5：分別為病例4、5、1、3、2 的非皮損；6 ～ 10：分別為病例1、2、4、5、3 的皮損

四、差異表達(dá)基因Pathway功能分析

78 條差異表達(dá)基因富集于132 條通路，其中13條通路顯著富集，包括白細(xì)胞介素17信號(hào)通路、NOD 樣受體信號(hào)通路、Toll 樣受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體、胞質(zhì)DNA-傳感通路、沙門菌感染相互作用通路等。見圖4。

五、qRT-PCR驗(yàn)證基因表達(dá)變化

結(jié)果顯示，CXCL1、KRT6A、IL36A、SERPINB4在皮損中的mRNA 表達(dá)明顯高于非皮損組織，而PSAPL1在皮損中的mRNA表達(dá)明顯低于非皮損組織，與轉(zhuǎn)錄組測序結(jié)果趨勢一致（圖5）。

討 論

目前AD轉(zhuǎn)錄組的研究主要利用傳統(tǒng)的基因芯片技術(shù)，只能檢測已知基因的轉(zhuǎn)錄本表達(dá)量，不能發(fā)現(xiàn)未知的新轉(zhuǎn)錄本，基因組覆蓋面較狹窄。RNASeq 測定差異基因的準(zhǔn)確率顯著高于基因芯片［8］。了解患者皮損和非皮損差異表達(dá)基因?qū)τ谔接慉D的發(fā)病機(jī)制及尋找更精確的診斷方法及生物學(xué)標(biāo)志物均具有重要意義。

我們首次運(yùn)用新一代高通量測序技術(shù)對(duì)漢族中重度AD患者皮損和非皮損組織的轉(zhuǎn)錄組進(jìn)行測序和功能分析。樣品比對(duì)顯示，基因組的平均比對(duì)率為 92.26%，clean reads Q20 都在95.34%以上，說明此次序列的質(zhì)量滿足轉(zhuǎn)錄組分析的要求。共篩選得到21 729 條基因，其中19 268 條為已知基因，2 545條為預(yù)測的新基因。對(duì)皮損及非皮損組織進(jìn)行差異表達(dá)基因分析，并對(duì)差異表達(dá)轉(zhuǎn)錄組基因進(jìn)行功能分析，發(fā)現(xiàn)差異表達(dá)基因可能通過調(diào)節(jié)相關(guān)基因mRNA的表達(dá)進(jìn)而影響AD炎癥的病理生理學(xué)改變。根據(jù)KEGG 數(shù)據(jù)庫分析發(fā)現(xiàn)，這些差異基因涉及132 個(gè)具體的代謝途徑分支，影響IL-17 信號(hào)通路、NOD樣受體信號(hào)通路、Toll樣受體信號(hào)通路、腫瘤壞死因子信號(hào)通路、細(xì)胞因子受體、胞質(zhì)DNA-傳感通路等，為進(jìn)一步大量挖掘AD 發(fā)病過程中的重要基因，開展AD 靶點(diǎn)治療及功能驗(yàn)證等提供了基礎(chǔ)數(shù)據(jù)。

圖3 特應(yīng)性皮炎皮損差異表達(dá)基因GO功能分類圖

本研究發(fā)現(xiàn)的78 條顯著差異表達(dá)基因，其中27 條目前已有報(bào)道和AD 相關(guān)，包括CXCL128、IL61β、MMP1、SERPINB4、S100A2 等。我們隨機(jī)選取5個(gè)候選基因用qRT-PCR進(jìn)行驗(yàn)證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序趨勢一致，表明本研究結(jié)果可靠。在78條顯著差異表達(dá)基因中，上調(diào)倍數(shù)較高的6條基因與IL-17通路中中性粒細(xì)胞趨化、對(duì)外界病原的免疫、炎癥宿主的自身免疫防御調(diào)節(jié)相關(guān)。有研究顯示，IL-17 在亞裔AD 患者的發(fā)病機(jī)制中起非常關(guān)鍵的作用［9］，本研究結(jié)果與上述研究相符。已發(fā)現(xiàn)銀屑病和AD 皮損中IL-17 過表達(dá)，而且有研究表明，IL-17C 作為炎癥的主要介質(zhì)在這兩種疾病中具有致病性［10-11］，因而提示抗IL-17 的生物制劑有可能用于治療亞裔AD。一項(xiàng)抗IL-17c 的單克隆抗體MOR106 的Ⅰ期臨床試驗(yàn)結(jié)果令人鼓舞，研究組80%的AD 患者達(dá)到EASI50，相比之下，安慰劑組比例不到20%，而且MOR106還顯示出良好的安全性［12］。2018年Sanyal等［10］運(yùn)用免疫組化、RNA-Seq等發(fā)現(xiàn)，非洲裔美國AD 患者具有Th2/Th22 偏向性，Th2 和Th22 標(biāo)記物及IgE 與疾病嚴(yán)重程度顯著相關(guān)，但其Th1和Th17軸較歐洲裔美國AD患者衰減［13］。2015年一項(xiàng)運(yùn)用RNA-seq對(duì)18例中重度美裔AD患者皮損和非皮損組織差異表達(dá)基因的研究發(fā)現(xiàn)，髓系細(xì)胞表達(dá)的觸發(fā)受體TREM-1（triggering receptor expressed on myeloid cells 1）通路和IL-36因子基因在患者皮損中高表達(dá)［14］。本研究中發(fā)現(xiàn)的差異表達(dá)基因與該研究有很多重合，但本研究顯示，漢族AD的差異表達(dá)基因具有以IL-17為主的模式特點(diǎn)。

圖4 特應(yīng)性皮炎皮損差異表達(dá)基因Pathway富集結(jié)果

本研究顯示，炎癥相關(guān)基因CXCL1、IL-1β、CXCL8、IL1RL1、OSM 等在皮損處顯著高表達(dá)。Jung 等［15］發(fā)現(xiàn)用異澤蘭黃素 eupatilin 治療 AD 小鼠，IL-1β 水平會(huì)相應(yīng)降低。Khattri 等［16］用生物制劑ustekinumab 治療中重度成人AD，4 周后CXCL1水平降低。在哮喘患者痰細(xì)胞中CXCL8的表達(dá)水平和巨噬細(xì)胞的百分比呈負(fù)相關(guān)［17］，在嚴(yán)重的哮喘患者中 OSM 主要來源是中性粒細(xì)胞［18］。IL-33 和IL1RL1 變異與巴西人群中哮喘和過敏性哮喘有關(guān)，而RA50、IL-33 和 IL1RL1 多態(tài)性與中國人群特應(yīng)性哮喘有關(guān)［19］。

本研究顯示，屏障功能相關(guān)的SERPINB3/B4、KRT16 基因在漢族AD 患者皮損處顯著高表達(dá)。已經(jīng)有研究證實(shí)，SERPINB3/B4和小鼠早期炎癥和屏障功能障礙相關(guān)，且用于構(gòu)建小鼠AD 模型［20］。有學(xué)者匯總5 項(xiàng)獨(dú)立研究分析AD 差異表達(dá)基因［21］，總共127個(gè)樣本，89條基因表達(dá)有顯著差異，功能注釋顯示這些基因參與免疫反應(yīng)（如防御素、原蛋白）、角質(zhì)形成細(xì)胞分化、表皮發(fā)育（如FLG、CORIN、AQP、LOR、KRT16）、炎 癥（如 IL-37、IL27RA、CCL18）和脂質(zhì)代謝（如AKR1B10、FAD7、FAR2）。本研究發(fā)現(xiàn)，角質(zhì)形成細(xì)胞分化相關(guān)基因IL-20 在皮損處顯著高表達(dá)。促炎細(xì)胞因子IL-20和IL-24 對(duì)FLG 表達(dá)有一定影響，并參與FLG 的終末分化［22］。

圖5 特應(yīng)性皮炎（5例）皮損與非皮損組織差異表達(dá)基因的實(shí)時(shí)定量PCR 驗(yàn)證 選取5 個(gè)轉(zhuǎn)錄組測序所得的差異表達(dá)基因CXCL1、KRT6A、IL36A、SERPINB4、PSAPL1 進(jìn)行實(shí)時(shí)定量 PCR 驗(yàn)證，結(jié)果與轉(zhuǎn)錄組測序顯示的表達(dá)趨勢一致

綜上，本研究通過新一代高通量轉(zhuǎn)錄組測序技術(shù)篩選出漢族中重度AD皮損和非皮損間差異表達(dá)基因，為進(jìn)一步探索AD 的病理生理學(xué)機(jī)制和個(gè)性化治療提供了依據(jù)。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突