王上上 倪春雅 鄒穎 李巍 徐金華

復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院皮膚科，上海 200040

蛋白酶活化受體2（protease activated receptor 2，PAR-2）廣泛分布于人體內(nèi)各組織和細(xì)胞，可被多種內(nèi)外源性絲氨酸蛋白酶激活，產(chǎn)生多種生物效應(yīng)。PAR-2 在皮膚組織尤其是炎癥性皮損的多種細(xì)胞（包括角質(zhì)形成細(xì)胞、真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞、免疫細(xì)胞等）中均有顯著表達(dá)，提示其可能參與皮膚炎癥和免疫反應(yīng)［1］。他克莫司是一種大環(huán)內(nèi)酯類免疫抑制劑，其外用制劑已廣泛應(yīng)用于皮膚科各個(gè)領(lǐng)域，并且發(fā)現(xiàn)外用他克莫司可降低銀屑病及特應(yīng)性皮炎患者皮損中PAR-2 的表達(dá)［2-3］，但其對人角質(zhì)形成細(xì)胞PAR-2 表達(dá)及功能的影響目前尚缺乏體外實(shí)驗(yàn)證實(shí)。我們應(yīng)用不同濃度他克莫司與人角質(zhì)形成細(xì)胞共培養(yǎng)，觀察PAR-2 mRNA和蛋白表達(dá)的變化及其對PAR-2 激動(dòng)劑所引起的鈣離子動(dòng)員的影響。

材料與方法

一、材料

人角質(zhì)形成細(xì)胞來源于華山醫(yī)院泌尿外科21例16 ～30歲男性包皮環(huán)切術(shù)后組織，該研究已通過復(fù)旦大學(xué)附屬華山醫(yī)院倫理委員會(huì)批準(zhǔn)（批件號2017-400），取材前患者或家屬均簽署知情同意書。二氧化碳培養(yǎng)箱（美國Thermo Fisher Scientific 公司），激光掃描共聚焦顯微鏡（日本Olympus公司），腔室玻片系統(tǒng)（美國Thermo Fisher Scientific公司），凝膠成像系統(tǒng)（美國Bio-Rad公司）；DMEM培養(yǎng)基、胎牛血清產(chǎn)自美國HyClone 公司，反轉(zhuǎn)錄試劑盒、實(shí)時(shí)熒光定量PCR 試劑盒產(chǎn)自日本Takara 公司；PAR-2、甘油醛-3-磷酸脫氫酶（GAPDH）引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成；Trizol、Fluo-4鈣檢測試劑盒產(chǎn)自美國Invitrogen 公司，他克莫司凍干粉（分析純，純度99.9%）、胰蛋白酶產(chǎn)自美國Sigma 公司，鼠抗人PAR-2 單克隆抗體（PAR-2msIgG）、山羊抗小鼠IgG 產(chǎn)自美國Santa Cruz公司。

二、方法

1.細(xì)胞培養(yǎng)及處理：采用胰蛋白酶消化法分離表皮，在37 ℃、5%CO2條件下用含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基培養(yǎng)人角質(zhì)形成細(xì)胞，以每孔105個(gè)細(xì)胞接種于無菌有蓋24孔板。細(xì)胞生長達(dá)70%融合時(shí)給予無血清DMEM培養(yǎng)基同步化24 h，更換為含10%胎牛血清的DMEM培養(yǎng)基，加入不同濃度（分別為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L，用二甲基亞砜稀釋）他克莫司共培養(yǎng)，以未加他克莫司組作為對照組，繼續(xù)培養(yǎng)24 h后收集細(xì)胞，進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.半定量反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)（RT-PCR）檢測人角質(zhì)形成細(xì)胞PAR-2 mRNA 的表達(dá)：Trizol 法提取經(jīng)上述處理的人角質(zhì)形成細(xì)胞RNA，逆轉(zhuǎn)錄合成cDNA，取cDNA行PCR反應(yīng)。設(shè)計(jì)引物序列，PAR-2 上游引物 5′-GGCACCATCCAAGGAACCA-3′，下游引物 5′-CTGTTTCAACTGTAACTCCTTTTC CA-3′；GAPDH 上游引物 5′-CCACTCCTCCACCTTT GAC-3′，下游引物5′-ACCCTGTTGCTGTAGCCA-3′。PCR 反應(yīng)體系 25 μl，反應(yīng)條件為 94 ℃變性 30 s，60 ℃退火30 s，72 ℃延伸40 s，共40 個(gè)循環(huán)。反應(yīng)結(jié)束后，取5 μl PCR產(chǎn)物，瓊脂糖凝膠電泳，溴化乙錠顯色，拍照，ImageJ 軟件分析目的基因片段的灰度值與相應(yīng)GAPDH 灰度值，以其比值表示PAR-2 mRNA表達(dá)水平。

3.Western印跡檢測人角質(zhì)形成細(xì)胞PAR-2蛋白的表達(dá)：使用蛋白裂解液將經(jīng)上述處理的人角質(zhì)形成細(xì)胞裂解后收集上清液，用BCA 法定量，調(diào)整蛋白濃度。應(yīng)用半干轉(zhuǎn)法轉(zhuǎn)膜，使用0.45 μm孔徑聚偏氟乙烯膜，恒流200 mA轉(zhuǎn)膜1.5 h，轉(zhuǎn)膜后用麗春紅染色試劑對膜染色；加針對PAR-2的鼠抗人抗體，4 ℃孵育過夜后，加辣根過氧化物酶標(biāo)記山羊抗鼠IgG 室溫孵育1 h，ECL 發(fā)光法檢測反應(yīng)條帶。以β肌動(dòng)蛋白為內(nèi)參，凝膠成像系統(tǒng)觀察拍攝電泳凝膠成像照片，ImageJ 軟件分析蛋白條帶的灰度值，以目的蛋白與β肌動(dòng)蛋白的灰度比值表示蛋白表達(dá)水平。

4.免疫熒光檢測人角質(zhì)形成細(xì)胞PAR-2 的表達(dá)：24 孔板內(nèi)鋪圓形蓋玻片，接種人角質(zhì)形成細(xì)胞，生長融合達(dá)50%時(shí)，無血清培養(yǎng)24 h，與不同濃度（0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L）他克莫司分別共培養(yǎng)24 h 后棄培養(yǎng)基，制備細(xì)胞爬片，加入一抗PAR-2 msIgG孵育，4 ℃過夜，加入二抗異硫氰酸熒光素標(biāo)記山羊抗小鼠IgG 孵育，沖洗后用4′，6-二脒基-2-苯基吲哚封片劑封片，激光掃描共聚焦顯微鏡觀察PAR-2的表達(dá)，每標(biāo)本取5個(gè)獨(dú)立高倍視野測量PAR-2的平均吸光度（A值），取均值。

5.Fluo-4 檢測他克莫司對PAR-2 激動(dòng)劑引起的人角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)員的影響：將人角質(zhì)形成細(xì)胞接種于腔室玻片系統(tǒng)，生長融合達(dá)50%時(shí)，無血清培養(yǎng)24 h，與不同濃度（0、10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L）他克莫司分別共培養(yǎng)24 h；每孔加入含F(xiàn)luo-4 的染色液，37 ℃孵育30 min，室溫孵育30 min。激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察，選擇488 nm氬激光為激發(fā)波長，設(shè)定各項(xiàng)參數(shù)，記錄背景熒光；加入PAR-2激動(dòng)劑胰蛋白酶，激光掃描共聚焦顯微鏡下動(dòng)態(tài)掃描細(xì)胞內(nèi)熒光強(qiáng)度變化，每5 秒記錄1次，測量100 s，Olympus Fluoview 系統(tǒng)軟件記錄和數(shù)據(jù)化細(xì)胞的熒光強(qiáng)度圖像和曲線。

6.數(shù)據(jù)處理和統(tǒng)計(jì)分析：采用SPSS 14 統(tǒng)計(jì)軟件，方差齊性檢驗(yàn)后，采用單因素方差分析比較組間人角質(zhì)形成細(xì)胞PAR-2表達(dá)和細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度，不同組別與對照組間比較采用LSD-t檢驗(yàn)。P＜0.05認(rèn)為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、PAR-2在人角質(zhì)形成細(xì)胞中的表達(dá)

免疫熒光染色顯示，PAR-2在人角質(zhì)形成細(xì)胞中呈中低水平表達(dá)，位于細(xì)胞膜和細(xì)胞質(zhì)，呈顆粒狀均質(zhì)分布（圖1）。

二、他克莫司對人角質(zhì)形成細(xì)胞PAR-2 mRNA表達(dá)的影響

半定量RT-PCR 檢測顯示，各濃度他克莫司組與對照組間PAR-2 mRNA 表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 18.99，P＜ 0.001）；與對照組相比，10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 他克莫司組表達(dá)水平均顯著下降（t值分別為2.93、3.28、4.41、4.85、10.48，P＜0.05 或 0.01）。PAR-2 mRNA 表達(dá)水平與他克莫司濃度呈負(fù)相關(guān)（r=-0.962，P=0.009）。見圖2。

三、他克莫司對人角質(zhì)形成細(xì)胞PAR-2蛋白表達(dá)的影響

Western印跡檢測顯示，共培養(yǎng)24 h后，各濃度他克莫司組人角質(zhì)形成細(xì)胞與對照組間PAR-2 蛋白表達(dá)水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 5.672，P=0.001）。與對照組相比，10-5和10-6mol/L他克莫司組PAR-2蛋白水平顯著下降，t值分別為3.149、3.255，P值分別為0.014、0.012，而10-9、10-8、10-7mol/L他克莫司組下降不顯著（t值分別為0.518、0.907、0.499，P值分別為0.618、0.391、0.631）。見圖3。

免疫熒光法分析結(jié)果顯示，人角質(zhì)形成細(xì)胞與不同濃度他克莫司共培養(yǎng)24 h后，各組間PAR-2蛋白的表達(dá)差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 2.851，P=0.037）。與對照組比較，10-5、10-6和10-7mol/L 他克莫司組PAR-2 表達(dá)水平顯著下降（t值分別為3.217、2.542、2.587，P值 分 別 為 0.012、0.035、0.032），10-9和 10-8mol/L 他克莫司組無明顯變化（t值分別為0.870、1.647，P值分別為0.409、0.138）。見圖4。

圖1 免疫熒光檢測人角質(zhì)形成細(xì)胞蛋白酶活化受體2（PAR-2）表達(dá) PAR-2 表達(dá)于胞膜和胞質(zhì)，呈顆粒狀均質(zhì)分布（× 600）DAPI：4′，6-二脒基-2-苯基吲哚

圖2 半定量RT-PCR檢測人角質(zhì)形成細(xì)胞蛋白酶活化受體2（PAR-2）mRNA的表達(dá) 2A： RT-PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果；2B：各組PAR-2 mRNA相對表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)比較。M：DNA標(biāo)準(zhǔn)參照物；1：對照組；2 ～ 6：分別為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L他克莫司組。與對照組比較，a：P ＜ 0.05，b：P ＜ 0.01，c：P ＜ 0.001

圖3 Western印跡檢測人角質(zhì)形成細(xì)胞蛋白酶活化受體2（PAR-2）蛋白表達(dá) 3A：Western印跡圖譜；3B：各組PAR-2相對表達(dá)水平統(tǒng)計(jì)比較。1：對照組；2 ～ 6：分別為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L他克莫司組。與對照組比較，a：P ＜ 0.05

圖4 免疫熒光半定量檢測人角質(zhì)形成細(xì)胞蛋白酶活化受體2（PAR-2）的表達(dá) 4A：免疫熒光染色圖（×400）；4B：各組PAR-2平均光密度值比較。1：對照組；2 ～ 6：分別為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5 mol/L他克莫司組。a：與對照組（未加他克莫司組）比較，P ＜ 0.05

圖5 胰蛋白酶刺激后人角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)員情況 激光掃描共聚焦顯微鏡（×400）下觀察發(fā)現(xiàn)，加入胰蛋白酶后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度迅速升高，30 ～45 s達(dá)到峰值

四、他克莫司對人角質(zhì)形成細(xì)胞PAR-2活化引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)員的影響

激光掃描共聚焦顯微鏡下觀察發(fā)現(xiàn)在角質(zhì)形成細(xì)胞中加入胰蛋白酶后，細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度一過性增高，胰蛋白酶引起細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)員的達(dá)峰時(shí)間是30 ～ 45 s（圖5）。

與不同濃度的他克莫司共培養(yǎng)24 h后，角質(zhì)形成細(xì)胞中胰蛋白酶引起的細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)員的達(dá)峰時(shí)間均為30 ～45 s，且鈣離子濃度在90 s時(shí)明顯下降，各組間在上升速度、達(dá)峰時(shí)間和下降速度方面無明顯區(qū)別。各組間細(xì)胞內(nèi)鈣離子峰濃度比較差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F= 4.953，P= 0.003）；與對照組比較，10-5、10-6和 10-7mol/L 他克莫司組鈣離子動(dòng)員的峰濃度顯著降低（t值分別為2.582、2.821、2.923，P值分別為0.032、0.022、0.019），10-8和10-9mol/L 他克莫司組無明顯變化（t值分別為0.846、0.462，P值分別為0.422、0.657）。見圖6。

圖6 他克莫司對胰蛋白酶引起的細(xì)胞內(nèi) 鈣離子動(dòng)員的影響1：對照組；2 ～ 6：分別為10-9、10-8、10-7、10-6、10-5mol/L 他克莫司組。a：與對照組比較，P ＜ 0.05

討 論

PAR-2是蛋白酶激活受體家族中的一員，屬于典型的G蛋白偶聯(lián)受體，具有七次跨膜結(jié)構(gòu)和獨(dú)特的激活方式，廣泛分布于人體內(nèi)各組織和細(xì)胞（包括皮膚），參與皮膚感染、瘙癢和腫瘤等多個(gè)病理生理過程［4］。PAR-2激活后可引起各種細(xì)胞因子如白細(xì)胞介素6、8和粒細(xì)胞-巨噬細(xì)胞集落刺激因子及趨化因子的分泌和釋放［5］，調(diào)節(jié)皮膚的免疫應(yīng)答和炎癥反應(yīng)。實(shí)驗(yàn)誘導(dǎo)的過敏性和刺激性接觸性皮炎的炎癥反應(yīng)在PAR-2 基因敲除小鼠中均明顯減弱，提示PAR-2 在皮膚炎癥過程中發(fā)揮重要作用［6］。角質(zhì)形成細(xì)胞和真皮血管內(nèi)皮細(xì)胞是PAR-2的主要效應(yīng)細(xì)胞［7］，在炎癥性皮膚病如特應(yīng)性皮炎和銀屑病皮損中，角質(zhì)形成細(xì)胞和血管內(nèi)皮細(xì)胞PAR-2 表達(dá)均顯著增加［2-3］。所以，角質(zhì)形成細(xì)胞PAR-2 的前炎癥效應(yīng)可能作為治療皮膚炎癥的一個(gè)新靶位。

他克莫司的作用機(jī)制與環(huán)孢素相似，均通過抑制細(xì)胞增殖的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路來發(fā)揮作用。他克莫司的主要靶細(xì)胞是淋巴細(xì)胞，通過抑制早期淋巴細(xì)胞相關(guān)基因的表達(dá)，抑制淋巴細(xì)胞的免疫活性［8］。除了淋巴細(xì)胞，他克莫司還可直接作用于特應(yīng)性皮炎樣皮損中的角質(zhì)形成細(xì)胞，促進(jìn)轉(zhuǎn)化生長因子β釋放，下調(diào)可誘導(dǎo)性一氧化氮合酶mRNA和蛋白表達(dá)，并通過調(diào)節(jié)核因子κB 來抑制角質(zhì)形成細(xì)胞分泌腫瘤壞死因子α［9］。

本研究顯示，體外培養(yǎng)的角質(zhì)形成細(xì)胞與一定濃度的他克莫司共培養(yǎng)后，PAR-2 mRNA和蛋白表達(dá)均受到抑制，其中10-9mol/L 他克莫司即可使PAR-2 mRNA表達(dá)顯著降低，而PAR-2蛋白的表達(dá)下降在他克莫司濃度＞10-7mol/L 時(shí)才有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，表明他克莫司對PAR-2 mRNA 的抑制更顯著。出現(xiàn)這一現(xiàn)象的原因可能是他克莫司主要通過與FKBP12蛋白結(jié)合抑制轉(zhuǎn)錄因子活化T細(xì)胞核因子（NFAT）而發(fā)揮作用，它所阻斷的主要是轉(zhuǎn)錄過程，但基因的轉(zhuǎn)錄和翻譯發(fā)生的時(shí)間和位點(diǎn)存在時(shí)空間隔，基因在轉(zhuǎn)錄后，還要經(jīng)歷轉(zhuǎn)錄后加工和轉(zhuǎn)錄產(chǎn)物降解、翻譯以及翻譯后加工及修飾等，因此導(dǎo)致他克莫司對PAR-2基因轉(zhuǎn)錄水平和翻譯水平影響并不完全一致的現(xiàn)象。由此推測他克莫司可能通過抑制PAR-2 基因的表達(dá)來抑制PAR-2 在細(xì)胞表面的表達(dá)，不過他克莫司影響PAR-2基因表達(dá)的信號轉(zhuǎn)導(dǎo)通路尚需進(jìn)一步明確。

鈣離子作為第二信使在細(xì)胞中廣泛參與各種生命活動(dòng)，多種炎癥因子的分泌及表達(dá)均需要鈣離子參與。PAR-2 激動(dòng)劑胰蛋白酶可識別并裂解PAR-2的N末端的特殊部位，引發(fā)細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)員，使細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度一過性升高［10］。因此細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)員可以作為PAR-2活化的一項(xiàng)指標(biāo)，用以衡量PAR-2的功能。本研究顯示，胰蛋白酶能引起人角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)鈣離子濃度一過性升高，其達(dá)峰濃度受他克莫司的影響，他克莫司濃度＞10-7mol/L時(shí)峰值鈣離子濃度顯著降低，而對于細(xì)胞內(nèi)鈣離子動(dòng)員的上升速度、達(dá)峰時(shí)間和下降速度則無影響。由于角質(zhì)形成細(xì)胞中PAR-2 蛋白表達(dá)水平亦表現(xiàn)出與他克莫司濃度的相關(guān)性，即當(dāng)他克莫司濃度大于10-7mol/L 時(shí)才出現(xiàn)PAR-2 蛋白表達(dá)的下降，所以他克莫司對人角質(zhì)形成細(xì)胞PAR-2 活化引起的Ca2+峰值濃度的變化與PAR-2 表達(dá)量的變化具有一致性，提示他克莫司可能并不影響蛋白酶激活PAR-2 的過程，PAR-2 整體功能的下降可能是由PAR-2表達(dá)量的下降引起。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，他克莫司可抑制角質(zhì)形成細(xì)胞PAR-2的功能性表達(dá)，可能通過抑制PAR-2基因的表達(dá)來實(shí)現(xiàn)，推測外用他克莫司可能通過直接抑制皮膚角質(zhì)形成細(xì)胞PAR-2 的表達(dá)來治療炎癥性皮膚病。但是，本研究主要為體外實(shí)驗(yàn)，他克莫司在體內(nèi)炎癥狀態(tài)下發(fā)揮的具體作用還有待進(jìn)一步深入研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突