周游 王艷林 曹春雨 孫麗丹 楊建林

三峽大學(xué)醫(yī)學(xué)院 腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖北宜昌 443002

近年研究發(fā)現(xiàn)，腫瘤細(xì)胞中的總多胺含量顯著高于正常細(xì)胞［1］，多胺水平的異常升高促進(jìn)腫瘤生長和侵襲轉(zhuǎn)移，而多胺的耗竭則能抑制腫瘤細(xì)胞增殖，由此多胺代謝途徑已經(jīng)成為腫瘤防治和抗癌藥物設(shè)計(jì)的分子靶點(diǎn)［2-3］。精胺氧化酶（spermine oxidase，SMO）是多胺分解代謝的關(guān)鍵酶，以精胺（spermine）為底物，將其氧化為精脒（spermidine），同時(shí)生成 3-氨基丙醛和 H2O2［4-5］。研究證實(shí)，SMO表達(dá)異常導(dǎo)致的多胺代謝紊亂與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的發(fā)生發(fā)展密切相關(guān)［6］。我們前期運(yùn)用基于藥效團(tuán)的計(jì)算機(jī)輔助藥物設(shè)計(jì)技術(shù)和高通量虛擬篩選技術(shù)，獲得了一種靶向SMO 的新型小分子抑制劑SI-4650，通過分子和細(xì)胞水平實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SI-4650可通過抑制SMO活性，干擾細(xì)胞多胺代謝，誘導(dǎo)人神經(jīng)膠質(zhì)瘤U87MG 細(xì)胞和骨肉瘤143B 細(xì)胞發(fā)生凋亡和自噬性死亡［7-8］。惡性黑素瘤是一種高度惡性的皮膚腫瘤，具有易早期轉(zhuǎn)移、致死率高、對化療藥物不敏感等特點(diǎn)。本研究探索SI-4650對人惡性黑素瘤A375細(xì)胞增殖和多胺代謝的影響及其可能的分子機(jī)制，以期為惡性黑素瘤臨床治療藥物的開發(fā)提供新思路。

材料與方法

一、主要試劑與細(xì)胞

SI-4650（荷蘭 Specs 公司）；二甲基亞砜（DMSO，美國Sigma 公司）；DMEM 培養(yǎng)基（美國Gibco 公司）；胎牛血清、青霉素/鏈霉素雙抗（天津?yàn)笊镏破房萍加邢挢?zé)任公司）；RIPA蛋白裂解液（武漢賽維爾生物科技有限公司）；自噬小體標(biāo)記蛋白LC3-Ⅰ/Ⅱ抗體（美國CST 公司）；促凋亡蛋白Bax抗體、凋亡抑制蛋白Bcl-2抗體、聚腺苷二磷酸-核糖聚合酶（PARP）抗體、自噬相關(guān)蛋白Beclin-1抗體（美國Proteintech Group 公司）；β 肌動(dòng)蛋白抗體（北京科美博瑞科技有限公司）；辣根酶標(biāo)記二抗（北京中杉金橋生物技術(shù)有限公司）；熒光標(biāo)記的LC3 質(zhì)粒（pEGFP-LC3，美國Add Gene 公司）；ECL超敏顯影液（美國Thermo Scientific 公司）；BCA 蛋白定量試劑盒、FITC-Annexin V 凋亡檢測試劑盒（南京諾唯贊生物科技有限公司）；細(xì)胞膜熒光探針DIOC6（3）（美國Thermo Fisher 公司）。人惡性黑素瘤A375 細(xì)胞購于中國科學(xué)院細(xì)胞庫（上海），由腫瘤微環(huán)境與免疫治療湖北省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室傳代保存。

二、方法

1.MTT 法檢測 SI-4650 對 A375 細(xì)胞增殖的影響：取對數(shù)生長期A375細(xì)胞懸液接種于96孔細(xì)胞培養(yǎng)板中，每孔1.0 × 103個(gè)細(xì)胞，于37 ℃、5% CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中培養(yǎng)24 h，同時(shí)設(shè)未添加細(xì)胞的空白培養(yǎng)孔，棄培養(yǎng)基（未特殊說明時(shí)為含10%胎牛血清的DMEM 培養(yǎng)基），換用含終濃度為0、10、20、40、80、160 μmol/L SI-4650 的培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)，每個(gè)藥物濃度設(shè)置4 個(gè)復(fù)孔。分別繼續(xù)培養(yǎng)24、48、72 h后，棄培養(yǎng)基，每孔加MTT試劑200 μl（終濃度0.2 g/L），于37 ℃、5%CO2培養(yǎng)箱中孵育4 h 后，棄MTT 試劑，每孔以 150 μl DMSO 充分溶解，使用酶標(biāo)儀于490 nm 波長處檢測每孔吸光度（A值）。A375 細(xì)胞的生長抑制率 =［1-（實(shí)驗(yàn)組A值 - 空白組A值）/（陰性對照組A值- 空白組A值）］×100%。

2.SI-4650 預(yù)處理 A375 細(xì)胞：根據(jù) SI-4650 對A375 細(xì)胞的生長抑制率篩選SI-4650 處理A375 細(xì)胞的時(shí)間及濃度。后續(xù)實(shí)驗(yàn)使用0（對照組）、40、80 μmol/L SI-4650 處理48 h的A375細(xì)胞。

3.化學(xué)發(fā)光法分析A375 細(xì)胞內(nèi)SMO 的活性：收集上述各組A375細(xì)胞，分別以200 μl 0.083 mol/L甘氨酸緩沖液（pH 8.0）浸潤后置于-80 ℃冰箱，于低溫狀態(tài)凍融裂解細(xì)胞，4 ℃、12 000 r/min，離心10 min（本文涉及離心時(shí)離心半徑均為10 cm），取上清液，BCA法測定總蛋白濃度。每組樣本取總蛋白含量相同的細(xì)胞裂解液，參照文獻(xiàn)［9］配制酶反應(yīng)體系，以化學(xué)發(fā)光法檢測蛋白上清液中SMO 的活性，酶活性以單位總蛋白質(zhì)量（mg）、單位時(shí)間（s）內(nèi)的化學(xué)發(fā)光強(qiáng)度（RLU）表示。

4.高效液相色譜（HPLC）分析A375 細(xì)胞內(nèi)多胺水平：收集上述各組A375細(xì)胞，以800 μl裂解液冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液，BCA法測定總蛋白濃度。每組樣本取總蛋白含量相同的細(xì)胞裂解液，雙蒸水補(bǔ)至800 μl，加入10 μl 苯甲酰氯、20 μl 1 mmol/L DAH（內(nèi)標(biāo)分子）、500 μl 2 mol/L NaOH，渦旋 30 s，40 ℃水浴 20 min后，混入2 ml 飽和NaCl 溶液終止反應(yīng)。采用2 ml乙醚萃取反應(yīng)液，取上層乙醚液，反復(fù)萃取3 次后合并上層乙醚液，通風(fēng)櫥中揮發(fā)至干，1 ml 甲醇溶解標(biāo)本后，經(jīng)0.2 μm微孔濾膜過濾至樣品瓶中，以Waters-e2695 高效液相色譜分析儀分析。色譜分析條件：Luna C18色譜柱（5 μm，150 mm × 4.6 mm）為固定相，乙腈-水（38∶62）為流動(dòng)相，流速1 ml/min，柱溫30 ℃，檢測波長設(shè)為254 nm，以單位細(xì)胞總蛋白（1 mg）中多胺濃度表示相對多胺含量。

5.流式細(xì)胞儀檢測A375 細(xì)胞周期：收集上述各組 A375 細(xì)胞，室溫 1 000 r/min 離心 3 min 后，棄上清液，以1.5 ml預(yù)冷75%乙醇重懸細(xì)胞，4 ℃固定過夜。室溫1 000 r/min離心5 min后，棄上清液，以1.5 ml 1×PBS洗滌細(xì)胞，室溫1000 r/min離心5 min棄上清液。以500 μl結(jié)合緩沖液（含0.1%TritonX-100和50 μg/L RNase）重懸細(xì)胞后，加入 20 μl 0.5 g/L碘化丙錠（propidium iodide，PI），37 ℃水浴鍋中避光染色30 min，流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞周期。

6.流式細(xì)胞儀檢測A375 細(xì)胞凋亡：收集上述各組 A375 細(xì)胞，室溫 1 000 r/min 離心 3 min 后，棄上清液。以100 μl 結(jié)合緩沖液重懸細(xì)胞，每樣以5 μl FITC-Annexin V和5 μl PI混勻后染色，避光條件下25 ℃孵育15 min，再以400 μl 結(jié)合緩沖液重懸混勻后，采用流式細(xì)胞儀檢測細(xì)胞凋亡。

7.流式細(xì)胞儀檢測A375細(xì)胞線粒體膜電位情況：收集上述各組A375細(xì)胞，無血清DMEM培養(yǎng)液洗滌，室溫1 000 r/min離心3 min后，棄上清液。用無血清DMEM 培養(yǎng)液以2 000∶1 比例稀釋DIOC6（3）母液，取1 ml DIOC6（3）重懸細(xì)胞，37 ℃孵育20 min。室溫 1 000 r/min 離心 5 min 后，棄上清液，用1 ml 無血清DMEM 培養(yǎng)液洗滌細(xì)胞3 次后，以500 μl 1 × PBS 重懸混勻，流式細(xì)胞儀檢測DIOC6（3）探針的綠色熒光。細(xì)胞中單體DIOC6（3）綠色熒光強(qiáng)度越高，線粒體膜電位越低。

8.熒光顯微鏡觀察A375 細(xì)胞內(nèi)自噬小體的形成情況：取對數(shù)生長期A375 細(xì)胞懸液，按1.5 ×105個(gè)/孔接種于6 孔板中，培養(yǎng)至細(xì)胞融合度約80%時(shí)，取2 μg 攜帶綠色熒光蛋白GFP 和外源性LC3 的質(zhì)粒（pEGFP-LC3 質(zhì)粒）加入400 μl 無血清DMEM 培養(yǎng)基中混勻，再加入 4 μl TurboFect 轉(zhuǎn)染試劑，充分混勻并靜置20 min，隨后將上述混合液逐滴加入細(xì)胞培養(yǎng)孔中，繼續(xù)培養(yǎng)24 h，換用含0（對照組）、40、80 μmol/L SI-4650 的 DMEM 培養(yǎng)基培養(yǎng)48 h，倒置熒光顯微鏡下觀察自噬小體標(biāo)記物L(fēng)C3重組綠色熒光蛋白的胞內(nèi)聚集情況，分析A375細(xì)胞中自噬小體的形成情況。

9.Western印跡法檢測A375細(xì)胞凋亡、自噬相關(guān)蛋白表達(dá)：收集上述各組A375 細(xì)胞，冰上裂解30 min，4 ℃、12 000 r/min 離心15 min，取上清液，BCA 法測定總蛋白濃度。每組樣本取總蛋白質(zhì)量均為60 μg 的上清液，經(jīng)電泳、轉(zhuǎn)膜、封閉后，以對應(yīng)一抗于4 ℃孵育過夜，再以對應(yīng)二抗室溫孵育2 h，采用ECL化學(xué)發(fā)光法顯影并記錄結(jié)果，以目的蛋白與內(nèi)參β 肌動(dòng)蛋白灰度值之比反映目的蛋白相對水平。

10.統(tǒng)計(jì)學(xué)方法：采用SPSS 13.0 軟件，計(jì)量資料以表示，兩組間比較采用獨(dú)立樣本t檢驗(yàn)，多組均數(shù)比較采用單因素方差分析，組間比較采用SNK-q檢驗(yàn)，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

結(jié) 果

一、SI-4650抑制A375細(xì)胞增殖

見圖1。不同濃度SI-4650 及不同處理時(shí)間的A375 細(xì)胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=977.23、5.16，P＜0.05）。SI-4650處理A375細(xì)胞48 h，對細(xì)胞的IC50 值為（90.48 ± 6.99）μmol/L，各濃度組間細(xì)胞增殖抑制率差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)分意義（F=244.16，P＜ 0.05），40、80 μmol/L SI-4650 組抑制率與對照組相比差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜0.001）。

二、SI-4650對A375細(xì)胞內(nèi)SMO活性、總多胺含量的影響

對照組、40 μmol/L 組、80 μmol/L 組 A375 細(xì)胞SMO 的酶活性差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001），40、80 μmol/L組活性低于對照組（P＜ 0.01），80 μmol/L組活性低于40 μmol/L 組（P＜ 0.05）。3 組腐胺、精脒、精胺、總多胺含量差異均具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.001），40、80 μmol/L 組多胺含量均低于對照組（均P＜ 0.01）。見表1。

三、SI-4650對A375細(xì)胞周期的影響

對照組、40 μmol/L 組、80 μmol/L 組 A375 細(xì)胞G0/G1期、S期、G2/M期比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（均P＜ 0.05），40、80 μmol/L 組細(xì)胞 G0/G1、G2/M 期細(xì)胞比例低于對照組（P＜0.05），S期細(xì)胞比例高于對照組（P＜0.01）。見表2。

四、SI-4650對A375細(xì)胞凋亡的影響

圖1 MTT法檢測精胺氧化酶抑制劑SI-4650對人惡性黑素瘤A375 細(xì)胞增殖的影響 隨著SI-4650 濃度的增加和作用時(shí)間的延長，A375細(xì)胞抑制率逐漸增加。a：與對照組相比，P ＜0.01。n=4

表1 不同濃度精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375細(xì)胞精胺氧化酶活性、多胺含量的影響（）

注：n=3。a 與對照組相比，P ＜ 0.001

SI-4650（μmol/L）多胺含量（mg/L） 精胺氧化酶活性（RLU）0（對照組）40 80 F值P值腐胺0.55±0.02 0.32±0.04a 0.25±0.01a 109.30＜0.001精脒1.31±0.01 0.88±0.01a 0.67±0.01a 10029.27＜0.001精胺2.17±0.02 1.97±0.01a 1.88±0.01a 338.02＜0.001總多胺4.03±0.01 3.18±0.03a 2.81±0.01a 2931.07＜0.001 159307.17±9138.16 61432.85±2620.92a 43337.35±1221.25a 242.58＜0.001

表2 不同濃度精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375細(xì)胞周期、凋亡細(xì)胞比例及細(xì)胞中單體DIOC6（3）綠色熒光強(qiáng)度的影響（）

表2 不同濃度精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375細(xì)胞周期、凋亡細(xì)胞比例及細(xì)胞中單體DIOC6（3）綠色熒光強(qiáng)度的影響（）

注：n=3。與對照組相比，a P ＜ 0.05，b P ＜ 0.01

SI-4650（μmol/L）0（對照組）40 80 F值P值細(xì)胞周期比例（%）G0/G1期76.87±2.52 70.68±0.69a 65.78±0.28b 26.74＜0.01 S期15.63±2.48 27.61±2.05b 31.58±1.45b 31.66＜0.001 G2/M期7.50±1.55 3.11±1.56a 2.64±1.18a 6.91＜0.05凋亡細(xì)胞比例（%）5.20±0.46 7.59±0.63b 20.14±2.27b 100.68＜0.001 DIOC6（3）熒光強(qiáng)度1 311.67±40.47 2 029.00±56.20b 2 950.67±48.03b 570.22＜0.001

流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示，對照組、40 μmol/L組、80 μmol/L 組A375細(xì)胞凋亡比例差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001），40、80 μmol/L 組凋亡比例高于對照組（P＜ 0.05）。單體DIOC6（3）的綠色熒光峰值顯示，3 組細(xì)胞熒光強(qiáng)度差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=20.73，P＜ 0.01），40、80 μmol/L 組細(xì)胞熒光強(qiáng)度高于對照組（P＜ 0.05）。見表2，圖2、3。

Western 印跡法顯示，3 組間促凋亡蛋白Bax、凋亡降解標(biāo)志蛋白c-PARP、凋亡抑制蛋白Bcl-2水平差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001），40、80 μmol/L組細(xì)胞Bax、c-PARP 水平高于對照組（P＜ 0.001，P＜ 0.05），Bcl-2 水平低于對照組（P＜ 0.001）。見表3、圖4。

五、SI-4650對A375細(xì)胞自噬的影響

倒置熒光顯微鏡觀察結(jié)果示，對照組細(xì)胞中熒光蛋白呈彌散性均勻分布，40 μmol/L 組細(xì)胞出現(xiàn)斑點(diǎn)狀聚集熒光，80 μmol/L 組細(xì)胞聚集熒光斑點(diǎn)更多（圖5A）。Western 印跡法顯示，對照組、40 μmol/L組、80 μmol/L組A375細(xì)胞內(nèi)自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白Beclin-1 和自噬微管蛋白LC3-Ⅱ水平差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（P＜ 0.001），40、80 μmol/L 組細(xì)胞Beclin-1、LC3-Ⅱ水平均高于對照組（P＜ 0.01）。見圖5B。

圖2 流式細(xì)胞儀檢測精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375細(xì)胞的影響 40、80 μmol/L SI-4650組細(xì)胞凋亡比例高于對照組

圖3 流式細(xì)胞儀檢測精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）作用于人惡性黑素瘤A375 細(xì)胞后單體DIOC6（3）綠色熒光強(qiáng)度 40、80 μmol/L SI-4650組熒光強(qiáng)度高于對照組，提示線粒體膜電位低于對照組

圖4 Western印跡法檢測精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375 細(xì)胞凋亡影響 40、80 μmol/L SI-4650 組促凋亡蛋白Bax、凋亡降解標(biāo)志蛋白c-PARP水平高于對照組，凋亡抑制蛋白Bcl-2水平低于對照組

表3 不同濃度精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375細(xì)胞凋亡、自噬蛋白水平的影響（）

表3 不同濃度精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375細(xì)胞凋亡、自噬蛋白水平的影響（）

注：n=3。與對照組相比，a P ＜ 0.01，b P ＜ 0.001

SI-4650（μmol/L）0（對照組）40 80 F值P值凋亡相關(guān)蛋白水平自噬相關(guān)蛋白Bax 0.32±0.04 0.83±0.12a 1.18±0.16a 35.51＜0.001 Bcl-2 1.03±0.25 0.65±0.09b 0.12±0.002b 27.54＜0.001 Bax/Bcl-2 0.33±0.17 1.28±0.12b 8.98±1.38b 104.85＜0.001 c-PARP 0.18±0.005 0.32±0.002b 0.79±0.035b 730.11＜0.001 Beclin1 0.66±0.006 1.00±0.007a 1.14±0.003b 35.87＜0.001 LC3-Ⅱ0.20±0.001 0.31±0.00002a 0.98±0.003b 425.04＜0.001 LC3-Ⅰ/LC3-Ⅱ12.98±0.005 3.13±0.003b 0.90±0.001b 424.89＜0.001

圖5 精胺氧化酶抑制劑（SI-4650）對人惡性黑素瘤A375細(xì)胞自噬的影響 5A：倒置熒光顯微鏡下觀察（×1 200），SI-4650 處理轉(zhuǎn)染了自噬小體標(biāo)記蛋白LC3熒光質(zhì)粒的A375細(xì)胞后，40 μmol/L組細(xì)胞中出現(xiàn)斑點(diǎn)狀聚集熒光，80 μmol/L 組聚集熒光斑點(diǎn)更多；5B：Western 印跡法顯示，40、80 μmol/L SI-4650 組細(xì)胞自噬相關(guān)標(biāo)志蛋白Beclin-1、LC3-Ⅱ水平高于對照組

討 論

SMO 表達(dá)異常導(dǎo)致多胺代謝紊亂與包括腫瘤在內(nèi)的多種疾病的病理進(jìn)程密切相關(guān)［2，6］。研究證實(shí)，SMO 高表達(dá)是導(dǎo)致肺癌、前列腺癌及胃腸道癌癥等惡性腫瘤發(fā)生發(fā)展的重要誘發(fā)因素［10-11］。惡性黑素瘤惡性程度高，預(yù)后極差。我們的前期研究設(shè)計(jì)了一種靶向SMO 的新型小分子抑制劑SI-4650，本文探索了SI-4650 對人惡性黑素瘤A375細(xì)胞增殖和多胺代謝的影響。

本研究發(fā)現(xiàn)，SI-4650 能有效抑制A375 細(xì)胞的增殖，在共培養(yǎng)48 h 條件下的IC50 為90.48 ±6.99 μmol/L，隨SI-4650作用時(shí)間延長和劑量增大，抑制效應(yīng)也隨之增加。并可誘導(dǎo)A375細(xì)胞周期阻滯在S期。SMO作為多胺分解代謝的關(guān)鍵酶，可以將精胺氧化為精脒，同時(shí)產(chǎn)生3-氨基丙醛和H2O2［4-5］。本研究發(fā)現(xiàn)，SI-4650能有效抑制A375細(xì)胞中SMO 的酶活性，且酶活性隨藥物濃度增加而降低；HPLC分析發(fā)現(xiàn)，經(jīng)SI-4650處理后，SMO酶促反應(yīng)催化產(chǎn)物精脒含量隨著藥物濃度的增加而逐漸減少，總多胺含量也顯著下降，但SMO催化反應(yīng)底物精胺含量并未發(fā)生相應(yīng)的升高，可能的原因?yàn)镾MO酶活性的抑制導(dǎo)致多胺降解代謝受阻，精胺通過精脒/精胺N1 乙?；D(zhuǎn)移酶（SSAT）的催化轉(zhuǎn)變?yōu)橐阴；罚ㄟ^腫瘤細(xì)胞膜表面高表達(dá)的多胺轉(zhuǎn)運(yùn)載體直接排出細(xì)胞外［12-13］，使得細(xì)胞內(nèi)并未出現(xiàn)精胺的積累。由此證實(shí)SI-4650 作為SMO 的抑制劑，有效抑制A375 細(xì)胞內(nèi)的SMO 酶活性，進(jìn)而影響SMO 催化精胺的轉(zhuǎn)化，干擾A375 細(xì)胞正常的多胺代謝進(jìn)程，降低細(xì)胞內(nèi)總多胺含量，從而抑制A375細(xì)胞的增殖。

本研究發(fā)現(xiàn)，SI-4650干預(yù)后可使A375細(xì)胞凋亡比例升高，同時(shí)Western 印跡法顯示，A375 細(xì)胞內(nèi)的促凋亡蛋白Bax表達(dá)上調(diào)，凋亡抑制蛋白Bcl-2表達(dá)下調(diào)，Bax/Bcl-2 比值顯著升高，細(xì)胞內(nèi)凋亡降解標(biāo)志蛋白c-PARP水平增高。同時(shí)利用熒光染料DiOC6（3）檢測發(fā)現(xiàn)，細(xì)胞線粒體膜電位顯著降低。提示SI-4650 作用A375 細(xì)胞后，可引起B(yǎng)ax、Bcl-2 表達(dá)改變導(dǎo)致的跨線粒體膜孔形成，線粒體膜電位下降，膜通透性增加，從而釋放凋亡因子，通過線粒體途徑誘導(dǎo)A375細(xì)胞發(fā)生凋亡。

細(xì)胞凋亡和細(xì)胞自噬分別稱為Ⅰ型、Ⅱ型程序性細(xì)胞死亡，探究細(xì)胞凋亡和自噬在抗腫瘤效應(yīng)中發(fā)揮的作用及其相關(guān)分子機(jī)制為當(dāng)前的研究熱點(diǎn)之一。誘導(dǎo)黑素瘤自噬可有效抑制其生長，可能達(dá)到治療的目的［14-16］。本研究發(fā)現(xiàn)，SI-4650 干預(yù)A375細(xì)胞后，壞死細(xì)胞數(shù)量顯著增多，提示SI-4650抑制A375 細(xì)胞增殖的機(jī)制不僅為誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡。進(jìn)一步實(shí)驗(yàn)證實(shí)，SI-4650還可誘導(dǎo)A375細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。本研究采用SI-4650 處理預(yù)先轉(zhuǎn)染LC3 熒光蛋白基因的A375 細(xì)胞后，細(xì)胞內(nèi)的熒光信號由彌散狀向斑點(diǎn)聚集狀轉(zhuǎn)化，提示SI-4650 處理使A375 細(xì)胞內(nèi)LC3 蛋白聚集到了自噬小體上。自噬激活相關(guān)蛋白Beclin-1 是形成自噬體的關(guān)鍵分子之一，與多種蛋白相互作用共同調(diào)控自噬體的形成與成熟；LC3-Ⅱ作為自噬體形成的特異性分子標(biāo)記物，與自噬小體的數(shù)量密切相關(guān)，由LC3-Ⅰ在自噬發(fā)生過程中轉(zhuǎn)化而來［17-19］。本研究顯示，SI-4650 干預(yù)后A375 細(xì)胞中自噬激活相關(guān)蛋白Beclin-1 和LC3-Ⅱ的表達(dá)增多，這些結(jié)果均提示SI-4650可誘導(dǎo)A375細(xì)胞發(fā)生自噬性死亡。

綜上，本研究證實(shí)，SI-4650具有抑制人惡性黑素瘤A375 細(xì)胞增殖的藥理活性，其機(jī)制可能與影響細(xì)胞周期、干擾細(xì)胞內(nèi)多胺代謝和誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡以及自噬性死亡相關(guān)，提示SI-4650 在人惡性黑素瘤治療及研究中的潛在應(yīng)用價(jià)值。但鑒于黑素瘤的高轉(zhuǎn)移性和藥物靶向性是腫瘤患者臨床治療的難點(diǎn)之一，因此SI-4650對A375細(xì)胞的侵襲遷移以及正常黑素細(xì)胞的影響尚需進(jìn)一步研究。

利益沖突所有作者均聲明不存在利益沖突