段敏杰 伊洪偉 王進 武崢

（重慶市農(nóng)業(yè)科學院，重慶 401329）

中國是梨原產(chǎn)國，也是世界第一產(chǎn)梨大國，梨產(chǎn)量占世界總產(chǎn)量的2/3，出口量約占世界總出口量的1/6，中國梨在世界梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展中具有舉足輕重的作用［1］。重慶作為砂梨適宜種植區(qū)和長江流域砂梨主產(chǎn)區(qū)，2018年栽培面積維持在3.6×104hm2，總產(chǎn)量為47.3×105t。在實際生產(chǎn)栽培中，梨樹受到黑斑病、黑星病、輪紋病、炭疽病等多種真菌性病害的影響，梨樹病害已成為制約世界梨產(chǎn)業(yè)發(fā)展的主要因素［2］。其中，梨黑斑病是一種廣泛發(fā)生的世界性病害，尤其是在日本、韓國和中國南部砂梨產(chǎn)區(qū)發(fā)病嚴重［1］。梨黑斑病是由鏈格孢屬（Alternariasp.）真菌引起的一種病害［3］，主要侵染梨樹葉片、嫩枝和果實，造成早期落葉、果實畸形、龜裂，甚至落果，嚴重影響梨樹產(chǎn)量和梨果品質［4］。目前，防治黑斑病的方法主要是使用甲基托布津、多菌靈等化學藥劑，長期使用這些化學藥劑，不僅造成環(huán)境污染，同時也使部分菌株對化學藥劑敏感性降低，防治效果下降。而且，由于梨樹童期長，遺傳背景復雜，大部分品種自交不親和等特性，傳統(tǒng)的抗病育種成本高、效率低。通過分子生物學發(fā)掘梨抗病基因，利用分子抗病育種培育抗病良種可以縮短育種年限，提高育種效率，是解決梨黑斑病危害的有效途徑。

富亮氨酸重復序列受體樣蛋白激酶（The leucine-rich repeats receptor-like protein kinase，LRRRLK）是植物中已知的最大的一類跨膜類受體蛋白激酶［5］，它由胞外LRR結構域、單次跨膜域和胞內(nèi)激酶結構域組成。1990年，Walker等［6］從玉米中首次發(fā)現(xiàn)LRR-RLK，之后越來越多的LRR-RLK被挖掘［7］。在擬南芥中，通過測序分析鑒定出至少223個LRR-RLKs［8］，其中超過30個通過遺傳和生化研究確定了其功能［9］。目前，已有研究表明，LRRRLKs的功能主要包括兩個方面：一是在植物的生長發(fā)育過程中發(fā)揮作用，如形態(tài)發(fā)生、器官形成和激素調(diào)節(jié)；二是參與植物生物和非生物脅迫應答反應［10］。Kim 等［11］和 Stahl等［12］研究發(fā)現(xiàn)，LRRRLKs中的BRI1、BAK1和CLV1在植物的生長和發(fā)育過程中發(fā)揮決定性的作用，而FLS2等其他LRRRLKs基因參與了植物自身防御反應［13］。

目前，已通過轉錄組測序獲得梨黑斑病抗病相關基因，但還需通過抗病基因精細定位與基因表達、功能驗證等方法相結合篩選梨黑斑病抗病關鍵基因。

本研究利用同源基因克隆方法獲得一個LRRLRK類抗病相關基因，利用生物信息學、Southern Blot、亞細胞定位等方法對該基因展開分析，同時，利用實時熒光定量PCR技術分析該基因在梨黑斑病誘導下的表達情況，為進一步研究其在梨抗病防御中的作用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

“黃花梨”（Pyrus pyrifolia）、“愛宕梨”（Pyrus pyrifolia）、“翠玉梨”（Pyrus pyrifolia）、“黃冠梨”（Pyrus pyrifolia×Pyrus bretschneideri） 均 來 自 重 慶市農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所梨資源圃。RNA提取試劑盒（Hipure Total RNA Mini Kit）、DNA提取試劑盒（HiPure SF Plant DNA Maxi Kit）、質粒提取試劑盒（HiPure Plasmid Micro Kit） 等 購 自 Magen（ 中國）。Southern blot試劑盒購自Roche（美國）。反轉錄試劑盒（PrimeScriptTMRT reagent Kit）、熒光染料（TB GreenTMPremix Ex TaqTM）等購自TaKaRa（中國）。PCR試劑、TGEM-T-easy、T4連接酶、大腸桿菌DH5α等購自TSINGKE（中國）。

梨黑斑病病原菌由重慶市農(nóng)業(yè)科學院果樹研究所早熟梨課題組分離保存。

1.2 方法

1.2.1PpEMS1全長CDS的克隆 利用Hipure Total RNA Mini Kit（雙柱法）提取“黃冠梨”葉片總RNA，參照PrimeScriptTMRT reagent Kit說明書反轉錄合成cDNA。根據(jù)白梨基因組數(shù)據(jù)庫，應用軟件primer5.0設計PpEMS1全長引物PpEMS1-f和PpEMS1-r，以黃冠cDNA為模板，進行PCR擴增，電泳產(chǎn)物回收后連接TGEM-T-easy載體，并通過熱激轉化法轉入大腸桿菌DH5α，涂布于LB/Amp固體培養(yǎng)基。挑取單菌落進行PCR驗證，并將陽性菌液送擎科生物技術有限公司進行測序。

1.2.2 生物信息學分析 利用vector軟件對測序結果進行分析，尋找最大開放閱讀框（Open reading frame，ORF）；利用SMART在線數(shù)據(jù)庫對蛋白結構域進行分析；利用ExPASY網(wǎng)站在線分析蛋白基本性質分子量、pI、氨基酸殘基組成、親疏水性等；在線（http：//wolfopsort.org/）預測亞細胞定位；在 線（http：//nls-mapper.iab.keio.ac.jp/cgi-bin/NLS_Mapper_form.cgi）預測核定位信號；利用ClustalX 2.0和MEGA 5.0構建PpEMS1與擬南芥部分已知功能LRR-RLKs家族基因的系統(tǒng)進化樹。

1.2.3PpEMS1的表達分析 采集黃花和愛宕嫩葉，以葉脈為中心，在葉背分別用無菌針頭創(chuàng)傷后接種梨黑斑病病原菌和無菌水，放置培養(yǎng)箱中。分別于1、2、3、4、5、6、7和8 d后提取葉片總RNA。

以RNA為反轉錄模板，參照PrimeScriptTMRT reagent Kit說明反轉錄合成cDNA。根據(jù)PpEMS1保守序列區(qū)設計熒光定量PCR引物E1-f和E1-r，以持家基因Actin為內(nèi)參基因，應用life technologies公司生產(chǎn)的7500Fast熒光實時定量PCR儀（美國）進行熒光定量PCR分析（表1）。

PCR 反應體系（12 μL）為 6 μL TB Green Premix Ex Taq、1 μL cDNA、特異引物各 0.3 μL和ddH2O 4.4 μL。反應程序為 94℃ 3 min ；94℃ 30 s，60℃ 15 s，72℃ 30 s，40 個循環(huán) ；72℃ 10 min。

表1 本研究所用引物序列

1.2.4 Southern Blot分析 采集“黃冠梨”、“黃花梨”、“愛宕梨”、“翠玉梨”嫩葉，利用HiPure SF Plant DNA Maxi Kit提取基因組DNA，并用BglⅡ和EcoR V完全酶切。根據(jù)PpEMS1保守序列區(qū)設計雜交探針，并與酶切產(chǎn)物在尼龍膜上雜交。探針標記、雜交及信號檢測等操作均按照雜交試劑盒（DIG High Primer DNA Labeling and Detection Starter KitⅠ，Roche）說明書進行。

1.2.5PpEMS1煙草瞬時表達分析 設計包含酶切位點KpnⅠ/BamHⅠ的引物，以測序正確質粒為模板擴增PpEMS1，并回收電泳產(chǎn)物。同時用KpnⅠ/BamHⅠ酶切電泳回收產(chǎn)物和pSAT6-mRFP-N1載體，酶切產(chǎn)物用T4連接酶進行連接，得到pSAT6-PpEMS1：mRFP-N1融合表達載體。進一步用KpnⅠ/XbaⅠ和KpnⅠ/SpeⅠ對中間載體Psat6-PpEMS1：mRFP-N1、Psat6-mGFP-N1和植物表達載體PLGN-35s-nos進行酶切，酶切產(chǎn)物經(jīng)連接后得到表達載體PLGN-PpEMS1：mRFP-35s-nos和 PLGN-mGFP-35snos，轉入大腸桿菌DH5α，提取陽性克隆單菌落質粒酶切驗證后測序，測序結果正確的質粒轉化農(nóng)桿菌。提取農(nóng)桿菌陽性單菌落置于kan抗性的LB培養(yǎng)基，放于28℃搖床中震蕩培養(yǎng)24 h，轉速220 r/min。離心后重懸菌體，調(diào)節(jié)OD值至1。采用注射法進行本氏煙表皮轉化，24℃培養(yǎng)3 d后共聚焦顯微鏡觀察熒光信號。

2 結果

2.1 PpEMS1全長CDS克隆

根據(jù)PpEMS1的全長引物PpEMS1-f和PpEMS1-r，以“黃冠”cDNA為模板擴增獲得約3800 bp的基因片段（圖1），經(jīng)測序分析，該基因全長3894 bp。

圖1 PpEMS1的CDS全長克隆

2.2 生物信息學分析

2.2.1 PpEMS1蛋白一級結構預測分析 ExPASY ProtParam tool在線預測分析表明，PpEMS1蛋白分子量為140.59 kD；理論等電點為5.42；該蛋白由20種氨基酸組成，其中Leu含量最多，Ser、Glu、Pro、Ala等含量較為豐富，Trp含量最少，堿性帶正電荷的氨基酸共128個，酸性帶負電荷的氨基酸共100個，整個蛋白為帶正電堿性蛋白；半衰期大于10 h；不穩(wěn)定系數(shù)為32.95，屬穩(wěn)定蛋白；平均親水性為0.041，屬親水性蛋白。

2.2.2 PpEMS1蛋白結構域分析 SMART在線數(shù)據(jù)庫分析顯示：PpEMS1蛋白激酶除具有引導信號肽SP外，還包括LRR-RLKs典型的亮氨酸重復結構域（Leucine-rich repeats，LRRs）、單跨膜結構域（Single transmembranous domain，STM）以及激酶活性結構域（Kinase domain，KD），其LRRs屬于胞外LRRs結構（圖2）。說明該蛋白激酶屬于LRR-RLK家族。

2.2.3 PpEMS1蛋白的亞細胞定位預測和NLS預測 Psort在線預測分析顯示該蛋白位于細胞質膜的得分最高；NLS預測顯示該蛋白激酶氨基酸序列1261-1294處為核定位序列。

2.2.4PpEMS1系統(tǒng)進化樹分析 通過查閱文獻和NCBI數(shù)據(jù)庫比對，獲得擬南芥（Arabidopsis thaliana）部分已知功能LRR-RLK相關基因，運用MEGA5.0軟件構建NJ系統(tǒng)進化樹（圖3），PpEMS1與擬南芥AtEMS1親緣關系最近，其次是AtBIR1。AtEMS1參與調(diào)控花藥體細胞及生殖細胞形態(tài)建成，AtBIR1參與調(diào)控植物抗性相關信號通路，與細胞防御反應相關。

圖2 PpEMS1蛋白保守結構域預測分析

圖3 PpEMS1系統(tǒng)進化樹分析

2.3 PpEMS1的表達分析

實時熒光定量PCR分析表明，“黃花梨”（較耐）和“愛宕梨”（易感）在接種梨黑斑病病原菌1、2、3、4、5、6、7和8 d后，“黃花梨”中，該基因的表達呈現(xiàn)先下降后逐漸升高，在6 d時達到最高點，之后逐漸降低；“愛宕梨”中，該基因的表達基本呈現(xiàn)先上升后下降的趨勢，在4 d的時候達到最高點。同時，4 d之前該基因的表達量在“愛宕梨”中均高于“黃花梨”，4 d后“黃花梨”中均高于“愛宕梨”（圖 4）。

圖4 “黃花梨”和“愛宕梨”接種梨黑斑病不同時期后PpEMS1的表達分析

2.4 PpEMS1的Southern Blot分析

對“黃冠梨”（HG）、“黃花梨”（HH）、“愛宕梨”（AD）、“翠玉梨”（CY）4個品種進行Southern Blot分析，結果（圖5）表明，在“黃冠梨”、“黃花梨”、“翠玉梨”中，該基因都以單拷貝形式存在，在“愛宕梨”中以多拷貝形式存在。

2.5 PpEMS1蛋白的亞細胞定位

構建基因與綠色熒光蛋白GFP的融合表達載體，經(jīng)測序驗證，獲得正確融合表達載體。載體轉入農(nóng)桿菌后通過注射法瞬時侵染本氏煙，注射后培養(yǎng)48 h，對本氏煙進行DAPI染色，在激光共聚焦顯微鏡下觀察葉片中基因的定位情況（圖6）。對照組中GFP蛋白在細胞膜和細胞核均存在，試驗組融合蛋白熒光信號在細胞膜和細胞核中均有表達。

圖5 PpEMS1的Southern Blot分析

圖6 PpEMS1蛋白激酶的亞細胞定位

3 討論

本研究從“黃冠梨”克隆獲得一個預測為富亮氨酸重復序列受體樣蛋白激酶EMS1的基因，暫命名為PpEMS1。Southern blot分析表明，在“黃花梨”、“翠玉梨”、“黃冠梨”中，該基因都以單拷貝形式存在，在“愛宕梨”中以多拷貝形式存在。實時熒光定量PCR分析表明，該基因受梨黑斑病誘導上調(diào)表達。該蛋白激酶具有一段NLS，亞細胞定位顯示融合蛋白在細胞質膜和細胞核均有表達，推測該蛋白激酶合成后可能分別在質膜和核膜發(fā)揮作用。

黑斑病病原菌可以在花期和果實生長發(fā)育時期通過各種途徑潛伏侵染，也可以通過氣孔和傷口侵染葉片，對果實和葉片造成傷害。當病原菌侵入健康的植物細胞和組織后，寄主植物細胞的正常生理功能遭到破壞，病原菌不僅奪取寄主植物的營養(yǎng)物質和水分，同時還給植物施加機械壓力并產(chǎn)生有害代謝產(chǎn)物，如酶、毒素等，使植株產(chǎn)生病癥。病原菌要侵入植物內(nèi)，必須克服植物細胞壁的障礙，病原菌通過產(chǎn)生降解酶穿透細胞壁，破壞寄主細胞結構，有利于病原菌侵入。

已有多項研究表明，受體蛋白激酶參與植物的抗病防御過程。Song等［14］研究表明，水稻Xa21對水稻黃單胞菌具有抗病作用；在擬南芥中，F(xiàn)LS2與細菌鞭毛蛋白的感知有關［15］；富亮氨酸重復序列受體蛋白激酶BIR2是植物免疫系統(tǒng)中BAK1的負調(diào)控因子［16］；NIK1參與了植物抗病毒免疫反應過程［17］。

在擬南芥中，EMS1受體蛋白激酶被證實與小孢子細胞及絨氈層細胞分化有關，EMS1通過信號調(diào)節(jié)控制生殖細胞和周邊體細胞的命運［18］。在柑橘中，EMS受體蛋白激酶受柑橘潰瘍病誘導表達，推測該蛋白激酶可能參與植物的抗病防御過程［19］。目前只鑒定出少數(shù)LRR-RLKs類蛋白激酶的配體，TPD1是EMS1蛋白激酶的一種小富半胱氨酸蛋白配體［20］，可以與EMS1相互作用，誘導EMS1磷酸化，進而引起細胞內(nèi)一些列生理生化反應［21］。研究表明，擬南芥β-碳酸酐酶（βCAs）是EMS1激酶的下游互作蛋白，其中βCA1和βCA4協(xié)同EPF2和CO2響應分泌蛋白共同調(diào)節(jié)氣孔的發(fā)育和運動［22-23］。在植物木質部纖維中，富亮氨酸重復序列受體樣蛋白激酶PXC1參與了植物細胞壁的形成［24］，EMS1與細胞分化相關，它是否也參與到植物次生細胞壁的形成，并在病原菌侵染細胞壁時發(fā)揮作用，有待進一步研究。

4 結論

從“黃冠梨”中克隆獲得一個LRR-RLK家族基因PpEMS1，它以不同拷貝數(shù)存在于不同梨基因組中，其蛋白作為跨膜蛋白，主要在細胞膜發(fā)揮作用，可能參與了梨黑斑病抗病防御過程。