章英才 蘇偉東 柴雅紅

（1. 寧夏大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院，銀川 750021；2. 寧夏紅棗工程技術(shù)研究中心，靈武 750400）

近年來，靈武長棗鮮果保鮮、生理變化、栽培技術(shù)、品種選育等領(lǐng)域已有較深入的研究［1-2］，靈武長棗多糖的研究則僅限于果實(shí)多糖的分離提取、理化性質(zhì)分析、多糖含量及變化規(guī)律等方面［5］，而有關(guān)靈武長棗果實(shí)多糖中單糖成分分析、不同產(chǎn)地果實(shí)主要有效成分比較方面尚缺乏系統(tǒng)研究。

在前人研究基礎(chǔ)上，本項(xiàng)目組對原產(chǎn)于靈武市的靈武長棗果實(shí)進(jìn)行了多糖中單糖組成分析［10］，由于產(chǎn)地不同，果實(shí)多糖的單糖組成可能存在較大的差異，而揭示多糖的單糖組成及其差異對調(diào)控果實(shí)品質(zhì)及研究靈武長棗多糖活性等都有重要意義［11］。

因此，在明確原產(chǎn)地靈武長棗果實(shí)多糖單糖成分的基礎(chǔ)上，本研究選擇寧夏棗產(chǎn)區(qū)之一中寧地區(qū)的靈武長棗果實(shí)為材料，采用熱水浸提法及GC-MS等方法，分別對不同發(fā)育時期的寧夏中寧地區(qū)生產(chǎn)的靈武長棗果實(shí)多糖中單糖成分進(jìn)行定性分析和定量分析，系統(tǒng)研究該地區(qū)不同發(fā)育時期果實(shí)多糖中單糖的成分，明確不同地區(qū)靈武長棗果實(shí)多糖中單糖組成的差異，旨在為寧夏不同地區(qū)靈武長棗的開發(fā)利用及產(chǎn)業(yè)發(fā)展提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

以寧夏中寧縣棗園堡生長的靈武長棗果實(shí)為試驗(yàn)材料，選擇同期開放的花朵進(jìn)行標(biāo)記，試驗(yàn)重復(fù)3次。選取果實(shí)膨大前期（7月10日）、快速膨大期（8月9日）、著色期（9月8日）、完熟期（9月28日）外觀良好健康的果實(shí)上午9：00-11：00進(jìn)行采樣，所采樣品45℃烘干至恒重，粉碎后過60目篩備用。

RE-52A型旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀、SBS-Z100數(shù)控計(jì)滴自動部份收集器、YZ1515X恒流泵、FD-4中型冷凍干燥器、日本島津公司GCMS-QP2010氣相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用儀等主要儀器。

六甲基二硅胺烷、三甲基氯硅烷為色譜純，其他試劑均為分析純。DEAE-52纖維素填料（Whatman公司）、TOYOPEARL HW-55S凝膠樹脂（日本TOSOH公司）。標(biāo)準(zhǔn)單糖：葡萄糖（99.5%），阿拉伯糖、果糖、半乳糖、甘露糖（均＞99%）購自北京拜爾迪公司；核糖（99.6%），巖藻糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸（＞99%），購自國家標(biāo)準(zhǔn)物質(zhì)網(wǎng)；鼠李糖、木糖（均＞98%），購自北京化學(xué)試劑公司。

臨分別，王祥向老道討了個冥器留作紀(jì)念，雙方各奔東西，既沒有分贓不均，內(nèi)訌火拼。也沒有見財(cái)心起，大打出手。雙方是好聚好散，分了手還是好朋友。

1.2 方法

1.2.1 不同發(fā)育時期果實(shí)多糖的提取和含量測定 果實(shí)多糖的提取方法參見文獻(xiàn)［10］，采用苯酚-硫酸比色法測定多糖含量［12］。

1.2.2 不同發(fā)育時期果實(shí)粗多糖的分級純化 將粗多糖溶液過濾后，加樣至DEAE-52柱，分別用超純水、0.1、0.2和0.3 mol/L NaCl洗脫，以洗脫管數(shù)為橫坐標(biāo)，吸光度值為縱坐標(biāo)作洗脫曲線，分別合并各主峰收集管液，濃縮、透析、冷凍干燥后得到各多糖級分。將多糖各級分溶解后加樣至HW-55S柱，用0.2 mol/L NaCl溶液洗脫，根據(jù)洗脫曲線收集主峰管液，經(jīng)濃縮、透析、冷凍干燥后得到精制多糖。

1.2.3 不同發(fā)育時期果實(shí)精制多糖中單糖組成分析

1.2.3.1 精制多糖的GC-MS分析 果實(shí)精制多糖的水解和衍生、GC-MS檢測條件、以及標(biāo)準(zhǔn)單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作方法見文獻(xiàn)［10］。

1.2.3.2 精制多糖中單糖組成的定性與定量 通過將多糖各級分中單糖的出峰時間與各種標(biāo)準(zhǔn)單糖的出峰時間對照，及NIST譜庫對照，對多糖各級分組成進(jìn)行定性分析。采用外標(biāo)法對多糖各組分中的阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、果糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸進(jìn)行定量分析，根據(jù)各單糖的回歸方程計(jì)算出多糖中單糖的含量。

1.2.4 數(shù)據(jù)處理 用Microsoft Excel 2010進(jìn)行數(shù)據(jù)計(jì)算，利用SPSS 18.0對果實(shí)多糖主要成分試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行差異顯著性分析。

2 結(jié)果

2.1 多糖的提取

不同發(fā)育時期果實(shí)粗多糖的提取得率分別為：膨大前期0.43%、快速膨大期0.527%、著色期0.80%和完熟期0.618%；粗多糖含量分別為：膨大前期32.43%、快速膨大期44.19%、著色期54.33%和完熟期47.15%，著色期＞完熟期＞快速膨大期＞膨大前期。果實(shí)多糖得率和含量隨果實(shí)的發(fā)育進(jìn)程呈現(xiàn)先上升至著色期，然后略下降的趨勢，但總體呈上升趨勢。

2.2 不同發(fā)育時期果實(shí)粗多糖的分級純化

2.2.1 果實(shí)粗多糖的分級 由圖1知，不同發(fā)育時期果實(shí)粗多糖經(jīng)DEAE-52纖維素柱層析時，多糖樣品各得到4個洗脫峰，從左到右分別為超純水洗脫所收集組分、0.1、0.2和0.3 mol/L NaCl洗脫所收集組分，分別為Ju-0、Ju-1、Ju-2和Ju-3。峰形較對稱，各多糖級分為均一級分。

表1 中寧靈武長棗果實(shí)粗多糖經(jīng)DEAE-52纖維素色譜柱后4個多糖組分得率的測定

圖1 中寧地區(qū)靈武長棗果實(shí)粗多糖經(jīng)DEAE-52洗脫曲線

由表1可知，不同發(fā)育時期中寧地區(qū)靈武長棗果實(shí)4個多糖級分中Ju-2經(jīng)DEAE-52纖維素色譜柱分離純化后的得率均為最高，4個級分在快速膨大期的得率總體較高。

2.2.2 果實(shí)粗多糖的純化 HW-55S分子排阻柱層析具有分子篩的作用，各時期的4個多糖級分按分子量的大小先后流出，達(dá)到純化的目的。不同發(fā)育時期果實(shí)多糖各級分經(jīng)HW-55S的洗脫曲線中峰形單一且較對稱，純化效果較好。

2.3 不同發(fā)育時期果實(shí)精制多糖的單糖成分分析

2.3.1 單糖標(biāo)準(zhǔn)品標(biāo)準(zhǔn)曲線的制作 配制不同質(zhì)量濃度梯度的阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸各標(biāo)準(zhǔn)單糖溶液（根據(jù)1.2.3單糖的定性與定量方法和研究結(jié)果可知各樣品多糖中不含果糖），對各標(biāo)準(zhǔn)品衍生后分別進(jìn)行GC-MS分析，得到各標(biāo)準(zhǔn)品衍生物的總離子流圖（圖2）。并繪制各單糖標(biāo)準(zhǔn)曲線，得到回歸方程（表2），10種標(biāo)準(zhǔn)單糖均呈現(xiàn)良好的線性關(guān)系。

2.3.2 不同發(fā)育時期果實(shí)精制多糖的單糖成分分析 各發(fā)育時期果實(shí)精制多糖的各多糖級分水解、衍生后進(jìn)行GC-MS分析，分別得到各樣品總離子流圖（圖3），可見果實(shí)精制多糖各級分的單糖被成功分離。

中寧地區(qū)不同發(fā)育時期果實(shí)精制多糖各級分的單糖組成及質(zhì)量如表3所示。

圖2 混合標(biāo)準(zhǔn)單糖的總離子流圖

2.3.2.1 針對不同組分的單糖 Ju-0中，以阿拉伯糖＞核糖、半乳糖為主，占單糖總量的60%-78%；Ju-1中，快速膨大期以葡萄糖醛酸＞半乳糖醛酸為主，占單糖總量的75%，而其余時期以阿拉伯糖、半乳糖為主，占單糖總量的48%-52%；Ju-2、Ju-3中，膨大前期以阿拉伯糖＞半乳糖＞鼠李糖為主，均占單糖總量的77%，而其余時期均以葡萄糖醛酸＞半乳糖醛酸為主，占單糖總量的45%-74%。

表2 標(biāo)準(zhǔn)單糖的回歸方程

針對不同發(fā)育時期的單糖總量，膨大前期：阿拉伯糖＞半乳糖＞鼠李糖；快速膨大期：葡萄糖醛酸＞半乳糖醛酸＞阿拉伯糖＞鼠李糖＞半乳糖；著色期：葡萄糖醛酸＞阿拉伯糖＞鼠李糖＞半乳糖＞半乳糖醛酸；完熟期：葡萄糖醛酸＞阿拉伯糖＞半乳糖＞核糖。

2.3.2.2 針對不同發(fā)育時期單糖總量變化及各組分單糖含量變化 針對Ju-0，阿拉伯糖、核糖、半乳糖、葡萄糖含量為快速膨大期＞完熟期＞著色期＞膨大前期，鼠李糖、甘露糖為快速膨大期＞著色期＞完熟期。針對Ju-1，阿拉伯糖、半乳糖含量隨果實(shí)的生長發(fā)育而不斷升高，即完熟期＞著色期＞快速膨大期＞膨大前期，鼠李糖、巖藻糖為快速膨大期＞完熟期＞著色期＞膨大前期，糖醛酸含量為快速膨大期＞完熟期＞膨大前期。針對Ju-2，鼠李糖隨果實(shí)的生長發(fā)育總體是升高的趨勢，即完熟期＞著色期＞膨大前期＞快速膨大期，核糖、巖藻糖、半乳糖為完熟期＞著色期＞膨大前期＞快速膨大期，糖醛酸含量為著色期＞完熟期＞快速膨大期＞膨大前期。針對Ju-3，阿拉伯糖、鼠李糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖隨果實(shí)的生長發(fā)育而不斷升高，即完熟期＞著色期＞快速膨大期＞膨大前期，核糖含量為完熟期＞快速膨大期＞著色期＞膨大前期，膨大前期的半乳糖醛酸、葡萄糖醛酸含量遠(yuǎn)小于其他發(fā)育時期。

從各單糖總含量來看，阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖均是隨果實(shí)生長發(fā)育逐漸增高，即完熟期＞著色期＞快速膨大期＞膨大前期；核糖、巖藻糖均為完熟期＞快速膨大期＞著色期＞膨大前期；甘露糖為快速膨大期＞完熟期＞著色期＞膨大前期；葡萄糖、葡萄糖醛酸為著色期＞快速膨大期＞完熟期＞膨大前期；木糖為快速膨大期＞著色期＞完熟期＞膨大前期；半乳糖醛酸為快速膨大期＞完熟期＞著色期＞膨大前期。

因此，在膨大前期到完熟期整個果實(shí)發(fā)育過程中，單糖含量增加的有阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖，且完熟期總含量阿拉伯糖＞半乳糖＞鼠李糖，以及核糖、巖藻糖、甘露糖；而完熟期總含量降低的有葡萄糖、葡萄糖醛酸、木糖、半乳糖醛酸。

2.3.2.3 針對同一時期單糖各組分的含量變化 膨大前期，半乳糖醛酸含量大小為Ju-1＞Ju-2＞Ju-3，葡萄糖醛酸Ju-2＞Ju-1＞Ju-3，其余各糖均為Ju-2最大，Ju-0、Ju-1、Ju-3含量大小接近?？焖倥虼笃冢喊⒗?、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖均為Ju-0＞Ju-1＞Ju-2＞Ju-3，葡萄糖醛酸和半乳糖醛酸均為Ju-1＞Ju-3＞Ju-2，鼠李糖和核糖分別為 Ju-1＞Ju-0＞Ju-3＞Ju-2 和 Ju-0＞Ju-1＞Ju-3＞Ju-2。 著 色 期 ：阿 拉 伯糖、核糖為 Ju-0＞Ju-1＞Ju-2＞Ju-3，鼠李糖和巖藻糖為 Ju-3＞Ju-2＞Ju-0＞Ju-1，甘露糖、半乳糖為 Ju-1＞Ju-0＞Ju-2＞Ju-3，葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸為Ju-2＞Ju-3，Ju-0、Ju-1中無。完熟期：阿拉伯糖、核糖為Ju-1＞Ju-0＞Ju-2＞Ju-3，鼠李糖為 Ju-2＞Ju-3＞Ju-1＞Ju-0，巖藻糖、半乳糖醛酸為Ju-3＞Ju-2＞Ju-1，葡萄糖醛酸為Ju-2＞Ju-3＞Ju-1。

總之，各組分總含量的變化規(guī)律為：膨大前期 Ju-2＞Ju-1＞Ju-3＞Ju-0；快速膨大期 Ju-1＞Ju-0＞Ju-3＞Ju-2；著 色 期 Ju-2＞Ju-3＞Ju-0＞Ju-1；完 熟 期 Ju-2＞Ju-1＞Ju-3＞Ju-0。

圖3 完熟期果實(shí)精制多糖各組分總離子流圖

3 討論

寧夏靈武地區(qū)是靈武長棗的主產(chǎn)區(qū)，靈武、中寧地區(qū)產(chǎn)靈武長棗果實(shí)粗多糖得率和含量隨果實(shí)生長發(fā)育，總體上均呈現(xiàn)增加的趨勢，但變化趨勢有所不同。中寧地區(qū)果實(shí)粗多糖得率和含量先上升，在著色期分別達(dá)到最高后完熟期略有下降，而靈武地區(qū)果實(shí)粗多糖得率和含量持續(xù)上升至完熟期達(dá)到最高［10］。趙愛玲等［13］用苯酚-硫酸法測定比較了24個品種棗果實(shí)白熟期、脆熟期和完熟期的多糖含量，發(fā)現(xiàn)其多糖含量呈現(xiàn)遞增的趨勢，在完熟期達(dá)到最高。這與靈武地區(qū)不同發(fā)育時期多糖含量的增加趨勢基本一致，也與楊軍等［14］對靈武地區(qū)果實(shí)多糖含量的研究結(jié)果相同。

表3 中寧地區(qū)不同發(fā)育時期果實(shí)精制多糖的單糖組成（單位：mg）

中寧和靈武地區(qū)不僅多糖含量的變化趨勢有所不同，而且相同時期不同地區(qū)的多糖含量也存在差異，說明產(chǎn)地對靈武長棗多糖的含量產(chǎn)生影響，這可能與其氣候、土壤條件差異等有關(guān)［15-16］。陳宗禮等［17］分析陜北多個棗品種多糖含量，發(fā)現(xiàn)同一品種不同產(chǎn)地的棗多糖含量具有差異，在不同產(chǎn)地的狗頭棗和大木棗等均表現(xiàn)出極顯著差異，不同產(chǎn)地間狗頭棗多糖含量最高與最低值相差39.68%，不同產(chǎn)地間大木棗多糖含量最高比最低值高出10.35%。與此不同的是，趙愛玲等［13］比較了壺瓶棗在不同地區(qū)間多糖含量，發(fā)現(xiàn)相同品種在不同地域間的含量差異比較小，在1 mg/g-3 mg/g之間，這與本研究結(jié)果不同。反映出不同棗品種果實(shí)多糖含量在不同地域間存在差異。

經(jīng)DEAE-52纖維素柱分離純化，中寧和靈武地區(qū)果實(shí)多糖樣品均分別得到1種中性多糖組分和3種酸性多糖組分，各組分多糖的得率在不同發(fā)育時期大小不同，在相同發(fā)育時期不同地區(qū)各不相同。表明靈武長棗多糖的主要形式為酸性多糖，且各發(fā)育時期果實(shí)4個多糖級分中均是酸性組分2經(jīng)DEAE-52色譜柱分離純化后的得率最高。潘瑩［18］采用DEAE-52纖維素柱對冬棗多糖進(jìn)行分離，得到1個中性和1個酸性組分；劉琳［19］對臨澤小棗的多糖進(jìn)行DEAE-52纖維素柱分離，得到1個中性、4個酸性共5種多糖級分；戴艷［20］將駿棗多糖的DEAE-52純化后，得到1個中性、4個酸性組分，酸性多糖回收率明顯高于中性，且酸性組分2和4回收率最高?？偟膩砜矗际撬嵝远嗵谴笥谥行?，這與本研究結(jié)果一致，但酸性組分?jǐn)?shù)目與本試驗(yàn)所得結(jié)果有所差異，這可能與棗品種不同、采用洗脫液濃度或填料不同等有關(guān)。

本研究中，采用適用分離多糖的分子量范圍為1×103-2×105的HW-55S凝膠色譜柱，其分離純化效果理想，所得組分均為單一對稱峰，證實(shí)了各多糖組分為均一多糖。相比目前棗多糖純化常用的Sephadex等凝膠柱，HW樹脂填料為改性的聚甲基丙烯酸酯，具有更好的耐壓性能，適合棗多糖純化使用。

GC-MS綜合了GC靈敏度高、分析速度快和MS鑒別能力強(qiáng)的優(yōu)點(diǎn)，適用于靈武長棗果實(shí)多糖的分析。通過將多糖各級分中單糖的出峰時間與各種標(biāo)準(zhǔn)單糖的出峰時間對照，及NIST譜庫對照，并根據(jù)各單糖的回歸方程對多糖各級分組成進(jìn)行定性和定量分析，結(jié)果準(zhǔn)確可靠。研究表明，中寧地區(qū)果實(shí)阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖等單糖的含量均是隨果實(shí)生長發(fā)育逐漸增高，但不同地區(qū)或不同發(fā)育時期之間，糖醛酸含量變化差異較為明顯，不同地區(qū)靈武長棗果實(shí)多糖的單糖組成差異主要在于阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖和糖醛酸的動態(tài)變化。王東營［21］研究灘棗多糖時，發(fā)現(xiàn)灘棗多糖的單糖組成、以及阿拉伯糖含量最高的研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果相似，也與靈武地區(qū)果實(shí)的研究結(jié)果基本接近。但石浩等［22］發(fā)現(xiàn)糖棗中木糖醇、葡萄糖、半乳糖所含比例較高，趙智慧等［23］發(fā)現(xiàn)金絲小棗主要組成為半乳糖醛酸，這些研究結(jié)果與本實(shí)驗(yàn)結(jié)果有差異。并且，中寧地區(qū)和靈武主產(chǎn)區(qū)不同發(fā)育時期果實(shí)多糖中均不含有果糖，但金絲小棗和冬棗果實(shí)多糖中卻含有果糖，且果糖含量在各發(fā)育時期均高于其他單糖［24］。不論是中寧地區(qū)還是靈武地區(qū)，不同發(fā)育時期果實(shí)多糖中單糖含量雖各不相同，但單糖組成種類相同，而金絲小棗和冬棗果實(shí)多糖中單糖的種類隨果實(shí)發(fā)育呈遞增趨勢［24］。這些研究結(jié)果的差異不僅與棗種類有關(guān)，還可能與產(chǎn)地、多糖提取方法、單糖成分分析手段等有關(guān)。

總之，中寧和靈武地區(qū)雖同處黃河中上游地區(qū)，但其地理位置和所處的環(huán)境存在一定的差異。生長于兩地區(qū)的靈武長棗果實(shí)多糖含量的變化趨勢、多糖級分?jǐn)?shù)目和含量以及多糖中單糖的組成等，在不同發(fā)育時期既存在差異也存在相似或相同。導(dǎo)致同一品種不同產(chǎn)地的果實(shí)多糖產(chǎn)生差異的因素，可能是因?yàn)閷幭牟煌貐^(qū)間土壤、水分存在一定的差異，呈現(xiàn)較大的不均衡性；除此之外，氣溫、地溫也是棗樹生長的2個重要環(huán)境因子，濕度的調(diào)控對棗樹的生長也極為重要；其次光照等因素對棗樹的生長和產(chǎn)量影響也很大。這些可能是導(dǎo)致寧夏不同地區(qū)靈武長棗品質(zhì)差異的重要因素，還需要在以后的實(shí)驗(yàn)中明確各種因素影響靈武長棗果實(shí)多糖中單糖組成的深層次機(jī)制，進(jìn)而調(diào)控果實(shí)品質(zhì)。

4 結(jié)論

不同發(fā)育時期寧夏中寧地區(qū)靈武長棗果實(shí)各精制多糖總共含有阿拉伯糖、鼠李糖、核糖、巖藻糖、木糖、甘露糖、半乳糖、葡萄糖、葡萄糖醛酸、半乳糖醛酸10種單糖，不含果糖，以阿拉伯糖、半乳糖、核糖、鼠李糖、糖醛酸含量較高，巖藻糖、葡萄糖含量次之，木糖、甘露糖含量較低，但其含量各組分有差異。