張婧柔 邵貴芳 王姣 張水 楊婷玉 鄧明華

（云南農(nóng)業(yè)大學(xué)園林園藝學(xué)院，昆明 650201）

雄性不育是高等植物中普遍存在的一種自然現(xiàn)象，指植物花器官從分化成雄蕊原基開始到產(chǎn)生功能性花粉期間，因受各種外界環(huán)境（光照、溫度、化學(xué)試劑）及其自身特性的影響，造成植物的雄性生殖器官不能產(chǎn)生正常的功能性花粉，但雌性生殖器官正常發(fā)育［1］。植物的雄性不育來源比較廣泛，可借助各種人工手段來獲取雄性不育系，如天然的不育品種、自交、種間或種屬間雜交、理化誘導(dǎo)和T-DNA插入誘導(dǎo)、基因工程等［2］。由于胞質(zhì)雄性不育植株在生產(chǎn)應(yīng)用上既可以篩選保持系，又可以獲得恢復(fù)系，因此，可以利用“三系配套”進(jìn)行高效人工制種。目前，國內(nèi)獲得辣椒三系品種的有向陽椒中發(fā)現(xiàn)并轉(zhuǎn)成穩(wěn)定不育系的8021A，以及21號(hào)牛角椒中發(fā)現(xiàn)并轉(zhuǎn)育的不育系9704A，該品種的不育系和不育度均高達(dá)100%，經(jīng)濟(jì)性狀優(yōu)良、抗性好、品質(zhì)優(yōu)、有較強(qiáng)的配合力和社會(huì)生產(chǎn)價(jià)值［3-4］。

根據(jù)花粉的敗育時(shí)期，將胞質(zhì)雄性不育（Cytoplasmic male sterility，CMS）分為孢子體雄性不育和配子體雄性不育，兩者都是在花粉發(fā)育的過程中出現(xiàn)了異常［5］。研究發(fā)現(xiàn)，9704A的不育系屬于孢子體敗育型。通過顯微和超微結(jié)構(gòu)觀察發(fā)現(xiàn)，不育系9704A的成熟花藥的藥隔維管組織發(fā)育正常，但花藥絨氈層細(xì)胞的核膜在花粉母細(xì)胞的細(xì)線期消失，隨后核裂解消失，絨氈層進(jìn)入花粉囊，與花粉母細(xì)胞黏連，導(dǎo)致減數(shù)分裂不能正常進(jìn)行［6］。高等植物CMS的發(fā)生與RNA編輯有一定的關(guān)系?；蜣D(zhuǎn)錄后通過堿基的插入、缺失或替換，使RNA產(chǎn)物的長度、結(jié)構(gòu)發(fā)生變化從而影響基因的表達(dá)模式或創(chuàng)造嵌合基因，導(dǎo)致線粒體的功能紊亂，造成胞質(zhì)雄性不育［7-9］。

ATP9作為線粒體呼吸代謝過程中的復(fù)合酶亞基基因，是一種重要的功能基因。大量研究表明，CMS與atp6、atp9等一些線粒體功能基因相關(guān)，一旦這些基因功能受損，將會(huì)直接影響生物體的正常能量供應(yīng)，影響其生命活動(dòng)［10］。目前，已有研究表明atp9是煙草的雄性不育相關(guān)基因，同時(shí)煙草也是植物基因工程常用的模式植物［11］。陶瑤［12］研究發(fā)現(xiàn)，與對(duì)照相比，轉(zhuǎn)基因煙草的花粉活力明顯下降。

植物線粒體atp9在棉花CMS系和保持系間編碼區(qū)序列存在差異，并且在兩系中發(fā)生不同的RNA編輯頻率，改變蛋白質(zhì)的疏水結(jié)構(gòu)，增加物種間的保守性［13］。姜偉［14］研究推測(cè)atp9與大豆的敗育可能存在一定的關(guān)系。吳國平［15］通過分子標(biāo)記技術(shù)發(fā)現(xiàn)甜椒細(xì)胞質(zhì)雄性不育系特異片段CMST6A201的功能可能與逆轉(zhuǎn)座子有關(guān)。

目前，關(guān)于辣椒胞質(zhì)雄性不育形成機(jī)理的研究已經(jīng)從細(xì)胞生物學(xué)、分子生物學(xué)、遺傳學(xué)等角度展開并取得一定的研究進(jìn)展，而與線粒體的作用關(guān)系一直是研究的熱點(diǎn)。線粒體基因組和核基因組的相互沖突，影響了轉(zhuǎn)錄水平，轉(zhuǎn)錄后水平基因的調(diào)控，造成了雄性不育的發(fā)生。Touzet等［16］指出一些研究表明花粉的生產(chǎn)中斷是由于線粒體的呼吸作用能量缺乏而導(dǎo)致的，并就CMS的未知機(jī)制的相關(guān)研究提出排他性的假說：花粉生產(chǎn)中斷被一種只存在花藥中且能改變細(xì)胞結(jié)構(gòu)的物質(zhì)所作用［17］。在辣椒雄性可育和不育株系中的線粒體atp6基因，通過反向PCR進(jìn)行擴(kuò)增，檢測(cè)不育系中的該基因在3'編碼區(qū)域被截?cái)啵?8］。新的開放閱讀框可能來自線粒體NADH脫氫酶的基因，可能來自線粒體細(xì)胞色素氧化酶的基因，也可能是線粒體F0F1-ATP合酶的相關(guān)基因［19］。

本研究以辣椒胞質(zhì)雄性不育系和同型保持系為試驗(yàn)材料，分離ATP9，比較ATP9的一級(jí)結(jié)構(gòu)在2個(gè)材料和轉(zhuǎn)錄前后的差異，并進(jìn)行時(shí)空表達(dá)分析，為研究辣椒胞質(zhì)雄性不育機(jī)理提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

選取湖南省蔬菜研究所選育的辣椒胞質(zhì)雄性不育系9704A（不育率高達(dá)100%）和同型保持系9704B為試驗(yàn)材料。種植于云南農(nóng)業(yè)大學(xué)后山園林園藝學(xué)院蔬菜實(shí)驗(yàn)基地。2個(gè)品種均于2017年1月上旬播種，2017年4月下旬定植，定植之后進(jìn)行生長期常規(guī)管理。

待辣椒進(jìn)入盛花盛果時(shí)期取樣。在盛花期，取胞質(zhì)雄性不育系9704A與同型保持系9704B的4個(gè)不同花期（造孢細(xì)胞增殖期、花粉母細(xì)胞減數(shù)分裂期、小孢子單核靠邊期和小孢子成熟期）花蕾作為研究兩系表達(dá)譜差異的材料；在盛果期，取同型保持系9704B植株的莖、葉、花、果皮、胎座和種子6個(gè)不同組織作為組織表達(dá)材料。所取材料均需液氮冷凍后-80℃保存?zhèn)溆?，用于DNA和RNA的提取。

1.2 方法

1.2.1 DNA和RNA的提取及cDNA的合成 利用BioTeKe公司試劑盒提取DNA，用TRIzol試劑對(duì)各組織與花蕾不同發(fā)育時(shí)期的RNA進(jìn)行提取，提取完畢后立即用紫外分光光度計(jì)和1%瓊脂糖凝膠電泳雙重檢測(cè)RNA濃度與純度，檢測(cè)合格后，使用TaKaRa公司的反轉(zhuǎn)錄試劑盒進(jìn)行cDNA的合成。

1.2.2 目的基因CaATP9的擴(kuò)增 根據(jù)GENbANK中公布的辣椒線粒體基因組中假定的ATP9序列為模板設(shè)計(jì)特異性引物擴(kuò)增其CDS全長編碼序列。用Primer 5.0設(shè)計(jì)特異性引物F1（5'-TT CAGTGTACCGCTTGTGACGCCTAT-3'） 和R1（5'-CGCTCGCTCCCACCTGTCTTCTT-3'），引物序列合成和基因測(cè)序均由昆明擎科生物技術(shù)有限公司完成。PCR反應(yīng)條件為98℃ 2 min；98℃ 10 s，58℃15 s，72℃ 10 s，35 個(gè)循環(huán) ；72℃ 5 min，4℃保存。RT-PCR反應(yīng)體系為94℃ 2 min；94℃ 30 s，55℃ 30 s，72℃ 10 s，39個(gè)循環(huán) ；72℃ 5 min；4℃保存。

1.2.3 生物信息學(xué)分析 利用NCBI（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov）服務(wù)器上的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool（CDART）工具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）獲取蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域；利用GenScan（http：//genes.mit.edu/GENSCAN.html）預(yù)測(cè)cDNA序列；通過Compute pI/Mw Tool（http：//us.expasy.org/tools/pi_tool.html）預(yù)測(cè)氨基酸的分子量（Mw）和等電點(diǎn)（pI）；利用SOPMA程序（http：//npsa-pbil.ibcp.fr/）預(yù)測(cè)蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)；使用 DNAStar、BioEdit、ClustalX、MEGA 4和DNAman軟件進(jìn)行核苷酸序列及氨基酸序列的比對(duì)和構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.4 實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析 采用TaKaRa公司熒光定量試劑盒進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR分析，染料為SYBR Green，在Applied Biosystem熒光定量PCR儀上進(jìn)行，根據(jù)CaATP9的測(cè)序結(jié)果設(shè)計(jì)熒光定量引物為F2（5'-GAAGGTGCAAAATCAATGGG-3'）和R2（5'-CTAAAGGACTTGGAATACGA-3'）。qRT-PCR反應(yīng)體系（20 μL）為 10 μL SYBR Premix Ex Taq Ⅱ（購于 TaKaRa公司）、10 μmol/L 上下游引物各 0.8 μL、2 μL cDNA 模板、0.4 μL ROX Reference Dye Ⅱ和 6μL dH2O。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 34 s，40個(gè)循環(huán)。每個(gè)樣品設(shè)3次重復(fù)。熔解曲線分析：在65℃-95℃進(jìn)行，每上升0.5℃讀板一次，每次時(shí)間為5 s。

采取相對(duì)定量的方法，以ddH2O為陰性對(duì)照，以ACTIN為陽性內(nèi)對(duì)照，所用引物為F3（5'-TGCAGGAATCCACGAGACTAC-3'） 和 R3（5'-TACCACCACTGAGCACAATGTT-3'），采用 2-ΔΔCT方法計(jì)算相對(duì)表達(dá)量。

2 結(jié)果

2.1 CaATP9的擴(kuò)增

分別以辣椒胞質(zhì)雄性不育系9704A與同型保持系9704B的DNA和cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。均能擴(kuò)增出一條約500 bp的目的條帶，與預(yù)期結(jié)果相符（圖 1）。

圖1 辣椒CaATP9擴(kuò)增結(jié)果

2.2 CaATP9序列及氨基酸序列

經(jīng)測(cè)序，該片段包含一個(gè)完整的開放閱讀框（Open reading frame，ORF），長度為 234 bp，編碼一條由77個(gè)氨基酸殘基組成的肽鏈（蛋白質(zhì)）。分析發(fā)現(xiàn)，CaATP9在不育系和保持系之間的擴(kuò)增序列完全一致。利用Compute pI/Mw Tool推測(cè)，發(fā)現(xiàn)CaATP9蛋白含有77個(gè)氨基酸殘基（圖2），等電點(diǎn)為8.760，分子量為7.88651 kD，無信號(hào)肽，PSORT程序亞細(xì)胞定位顯示該蛋白位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)的概率是55.6%。DNA測(cè)序結(jié)果表明該片段在保持系和不育系中的片段序列完全一致，長度為234 bp，在兩系之間不存在任何堿基差異。

圖2 辣椒CaATP9的CDS全序列及其編碼的氨基酸序列

2.3 CaATP9在辣椒9704A和9704B的轉(zhuǎn)錄本分析

對(duì)CaATP9的DNA和cDNA序列進(jìn)行比較，發(fā)現(xiàn)在保持系中，從RNA轉(zhuǎn)錄生成cDNA過程中，存在5處編輯位點(diǎn)，編輯方式均為c→t，不育系中也存在相同的編輯位點(diǎn)和編輯方式。這些編輯位點(diǎn)的出現(xiàn)，改變了氨基酸的種類，由4個(gè)親水性氨基酸（DNA模板）變換成4個(gè)疏水氨基酸。編輯提高了蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)的疏水性，也增強(qiáng)了蛋白質(zhì)三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性（圖3）。不育系和保持系中的DNA序列一致，cDNA序列也完全一致，不管是保持系還是不育系，都只是在DNA轉(zhuǎn)錄生成cDNA的過程中發(fā)生改變。

圖3 CaATP9在9704A與9704B中轉(zhuǎn)錄本的編輯位點(diǎn)

2.4 CaATP9蛋白保守結(jié)構(gòu)域

利用NCBI服務(wù)器上的Conserved Domain Architecture Retrieval Tool（CDART） 工 具（http：//www.ncbi.nlm.nih.gov/BLAST）對(duì)所推導(dǎo)的CaATP9蛋白質(zhì)的保守結(jié)構(gòu)域進(jìn)行預(yù)測(cè)，該蛋白的保守結(jié)構(gòu)域?yàn)锳TPE和ATP-synt_C域，推測(cè)其屬于超ATP-synt_C家族（圖4）。

圖4 辣椒CaATP9編碼蛋白質(zhì)的保守域

圖5 辣椒CaATP9蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)

2.5 CaATP9蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)

利用SOPMA程序預(yù)測(cè)CaATP9蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)，其含65個(gè)α-螺旋（84.42%），6個(gè)β-轉(zhuǎn)角（7.79%），6個(gè)無規(guī)則卷曲（7.79%）。預(yù)測(cè)的該蛋白質(zhì)二級(jí)結(jié)構(gòu)見圖5。

2.6 CaATP9多物種氨基酸序列比對(duì)

CaATP9在胞質(zhì)雄性不育系9704A與同型保持系9704B中編碼的氨基酸序列無差異。通過Blast（protein）比對(duì)， 并利用 DNAStar、MEGA4、ClustalX、DNAMAN等生物信息學(xué)軟件進(jìn)行分析，發(fā)現(xiàn)辣椒CaATP9推導(dǎo)出來的蛋白質(zhì)氨基酸序列與GenBank中煙草（YP_173404.1）、天仙子（YP_009121945.1）、闊葉十大功勞（AAW30239.1）、胡蘿卜（AFB77174.1）、輪藻（NP_943666.1）、綠竹（ABY55207.1）ATP9氨基酸序列具有相似性（圖6）。

圖6 辣椒CaATP9蛋白與其他種類ATP9蛋白質(zhì)序列比較

2.7 ATP9多物種系統(tǒng)進(jìn)化樹

將辣椒CaATP9氨基酸序列與煙草（YP_173404.1）、天仙子（YP_009121945.1）、闊葉十大功勞（AAW30239.1）、胡蘿卜（AFB77174.1）、輪藻（NP_943666.1）、綠竹（ABY55207.1）的ATP9氨基酸序列構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，表明辣椒CaATP9與輪藻、胡蘿卜的親緣關(guān)系較近，與其他物種的親緣關(guān)系稍遠(yuǎn)（圖7）。

圖7 辣椒CaATP9系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.8 CaATP9在辣椒同型保持系9704B中的多組織表達(dá)分析

通過對(duì)CaATP9在辣椒同型保持系9704B的莖、葉、花、果皮、胎座、種子6個(gè)組織中的表達(dá)分析，結(jié)果（圖8）表明，6個(gè)組織中，CaATP9均有表達(dá)，但在不同組織中表達(dá)量差異較為明顯，其中在花中的表達(dá)量最高，在莖中表達(dá)量最低。

圖8 CaATP9在9704B不同組織中的表達(dá)分析

2.9 CaATP9在辣椒胞質(zhì)雄性不育系9704A與同型保持系9704B花蕾不同發(fā)育時(shí)期的表達(dá)分析

利用實(shí)時(shí)熒光定量的方法，以辣椒胞質(zhì)雄性不育系9704A與同型保持系9704B為材料，選取盛花期4個(gè)不同發(fā)育階段的花蕾，對(duì)CaATP9的表達(dá)量進(jìn)行分析。結(jié)果表明，CaATP9表達(dá)量在胞質(zhì)雄性不育系9704A與保持系9704B中存在一定差異，特別是小孢子成熟期辣椒胞質(zhì)雄性不育系與同型保持系中的表達(dá)水平差異極顯著。伴隨著小孢子的發(fā)育過程，在同保持系9704B花蕾中表現(xiàn)為先升高再下降的變化趨勢(shì)，在小孢子單核期表達(dá)水平最高，在成熟期表達(dá)量最低。而辣椒胞質(zhì)雄性不育系9704A中CaATP9的表達(dá)量呈現(xiàn)持續(xù)上升的趨勢(shì)，在小孢子成熟期達(dá)到最高。

在不同材料花蕾發(fā)育的同一時(shí)期，CaATP9的表達(dá)也存在一定差異，在花蕾發(fā)育的造孢細(xì)胞增殖期和花粉的減數(shù)分裂時(shí)期，兩種材料的表達(dá)水平差異不大；在小孢子單核期，CaATP9的表達(dá)水平在辣椒胞質(zhì)雄性不育系9704A中明顯低于同型保持系9704B；在小孢子成熟期，CaATP9在辣椒胞質(zhì)雄性不育系9704A的表達(dá)量明顯高于同型保持系9704B，在同型保持系9704B中幾乎不表達(dá)（圖9）。

圖9 CaATP9在9704A與9704B花蕾不同發(fā)育時(shí)期中的表達(dá)

3 討論

RNA編輯是一種發(fā)生在高等植物中轉(zhuǎn)錄后水平的基因表達(dá)調(diào)控現(xiàn)象，主要通過替換或插入、缺失等方式進(jìn)行。在多數(shù)情況下，替換方式主要發(fā)生在植物線粒體和葉綠體基因組的轉(zhuǎn)錄本中［20］。發(fā)生RNA編輯的位點(diǎn)大多數(shù)都會(huì)影響氨基酸的序列，影響蛋白正常功能的發(fā)揮。通過分析發(fā)生RNA編輯后的氨基酸殘基及其在蛋白質(zhì)中的結(jié)構(gòu)功能發(fā)現(xiàn)，編輯后的氨基酸通常由絲氨酸→亮氨酸/苯丙氨酸、精氨酸→色氨酸，由親水性氨基酸變?yōu)槭杷园被?，增?qiáng)了蛋白亞基互作的疏水性，可能更有助于蛋白間的互作；其次RNA編輯的發(fā)生位點(diǎn)一般在蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)的核心區(qū)，通過α螺旋的中斷與折疊，增強(qiáng)蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性［21-22］。在本研究中，所選取的CaATP9在不育系和保持系均存在RNA編輯，且編輯方式為堿基替換，替換方式均為C-T的替換，該替換是因?yàn)榛蚪MDNA編碼的C殘基發(fā)生了脫氨基來完成的［23］。CaATP9在不育系和保持系中發(fā)生堿基替換，且替換的位點(diǎn)和方式均一致，發(fā)生的編輯一般都是在密碼子的第一、第二位，僅個(gè)別發(fā)生在第三位，發(fā)生在密碼子第三位的RNA編輯一般不會(huì)造成氨基酸種類的改變，而第一、第二位點(diǎn)的RNA編輯會(huì)通過改變氨基酸的種類，增加蛋白結(jié)構(gòu)的疏水性，提高蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)的穩(wěn)定性。

線粒體作為植物能量的“動(dòng)力工廠”，為植物提供90%以上的必需能量。線粒體內(nèi)膜上的5個(gè)復(fù)合體，參與氧化呼吸，通過一系列遞氫和遞電子傳遞鏈，產(chǎn)生ATP。能量是植物正常生長發(fā)育的必要條件，貫穿植物的整個(gè)生命活動(dòng)過程。植物的呼吸速率不僅代表代謝活動(dòng)的強(qiáng)弱，也可以顯示植物生長過程的能量代謝強(qiáng)度。一些研究表明，花藥發(fā)育過程中，不育系的呼吸速率明顯低于保持系［24-25］。在保持系9704B的各組織中，基本呈現(xiàn)生殖器官（花、果、種子）CaATP9的表達(dá)量高于營養(yǎng)器官（莖、葉），與前人的研究成果“生殖器官的呼吸速率明顯高于營養(yǎng)器官”一致［26-29］。

小孢子的正常發(fā)育是決定植株可育的關(guān)鍵因素。目前，單子葉植株的花粉敗育主要發(fā)生在小孢子成熟后期，雙子葉植物的花粉敗育主要發(fā)生在四分體時(shí)期或小孢子發(fā)育時(shí)期［30］。辣椒作為典型的雙子葉植物，其敗育主要發(fā)生在四分體時(shí)期。本研究表明，在小孢子發(fā)育過程中，辣椒胞質(zhì)雄性不育系的9704A的CaATP9基因的表達(dá)與同型保持系9704B相比存在較大的差異，這種表達(dá)差異有可能造成線粒體能量代謝系統(tǒng)的紊亂，導(dǎo)致在小孢子發(fā)育期間能量供應(yīng)不足，引起敗育。

4 結(jié)論

CaATP9通過堿基替換、插入或缺失的方式進(jìn)行編輯。推測(cè)該基因的RNA編輯產(chǎn)物可能會(huì)導(dǎo)致線粒體功能不能正常發(fā)揮而引起雄性不育。

在辣椒花蕾發(fā)育的4個(gè)時(shí)期，CaATP9在不育系9704A和保持系9704B中表達(dá)量差異較為明顯。由于CaATP9與線粒體呼吸代謝活動(dòng)相關(guān)，推測(cè)其可能在轉(zhuǎn)錄后水平對(duì)辣椒的胞質(zhì)雄性不育起作用。