李念峰 方天星 倪玉芳 曾凡才

（西南醫(yī)科大學(xué)基礎(chǔ)醫(yī)學(xué)院生物化學(xué)與分子生物學(xué)實(shí)驗(yàn)室，瀘州 646000）

NODAL 是 TGF-β（Transforming growth factor-β）超家族成員之一，最初發(fā)現(xiàn)NODAL作為一個(gè)重要的形態(tài)發(fā)生素分子，主要在胚胎發(fā)育過程中發(fā)揮作用［1］。隨著生物個(gè)體的生長發(fā)育，NODAL基因表達(dá)逐漸關(guān)閉，成年后僅發(fā)現(xiàn)在胎盤、子宮內(nèi)膜和發(fā)育期乳腺等少數(shù)幾種生殖相關(guān)的正常組織中表達(dá)。后有研究發(fā)現(xiàn)NODAL在黑色素瘤細(xì)胞中重新表達(dá)，又陸續(xù)發(fā)現(xiàn)它在乳腺癌、膠質(zhì)瘤、前列腺癌、胰腺癌、子宮內(nèi)膜癌、甲狀腺癌和肝癌等腫瘤細(xì)胞中高表達(dá)，且可能與這些腫瘤的發(fā)生和發(fā)展相關(guān)［2-5］。綜合文獻(xiàn)分析和我們的研究經(jīng)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，研究NODAL分子的功能具有一定的復(fù)雜性［3-6］。首先，在核酸和蛋白表達(dá)水平上準(zhǔn)確檢測NODAL表達(dá)存在一定的難度。最初發(fā)現(xiàn)NODAL存在促腫瘤作用的美國西北大學(xué)Hendrix MJ 實(shí)驗(yàn)室根據(jù)他們多年的研究經(jīng)驗(yàn)提出在mRNA水平不易檢測到NODAL基因的表達(dá)，分析多個(gè)實(shí)驗(yàn)室在核酸和蛋白水平檢測NODAL表達(dá)的結(jié)果并不一致［7］。我們?cè)谘芯窟^程中也面臨同樣的困惑。其次，TGF-β超家族不僅成員眾多，而且這些細(xì)胞因子與受體存在一個(gè)配體可與多個(gè)受體結(jié)合，一個(gè)受體又可接受多個(gè)配體信號(hào)的特點(diǎn)［8］。TGF-β超家族至少有35個(gè)成員，它們屬于細(xì)胞因子。傳遞這些細(xì)胞因子信號(hào)到胞內(nèi)的受體屬于絲氨酸/蘇氨酸激酶受體，根據(jù)結(jié)構(gòu)和功能不同分為Ⅱ型受體和I型受體，哺乳動(dòng)物有5種II型受體和7種I型受體［9］。例如，研究發(fā)現(xiàn)NODAL分子至少可通過ALK4或ALK7兩個(gè)I型受體傳遞信號(hào)，而ALK4和ALK7受體則還可接受包括NODAL分子在內(nèi)的其它多種 TGF-β 超家族成員的信息［4，8，10-11］。最后，不同研究結(jié)果之間相互矛盾。多數(shù)研究認(rèn)為NODAL基因具有促腫瘤作用，但有部分研究認(rèn)為NODAL分子有抑制腫瘤的作用［12］。

研究基因功能的常用技術(shù)是基因敲除（Gene knock-out）或基因敲低（Gene knock-down）。已報(bào)道的文獻(xiàn)均采用的基因敲低NODAL表達(dá)后觀察對(duì)腫瘤細(xì)胞功能的影響。由于基因敲低技術(shù)一般不容易將基因表達(dá)完全抑制，另一方面這種抑制作用對(duì)基因表達(dá)的影響也是暫時(shí)。鑒于NODAL基因研究的復(fù)雜性，本研究擬通過基因敲除以及恢復(fù)該基因表達(dá)以進(jìn)一步研究NODAL基因在腫瘤細(xì)胞中的功能。并且還可通過敲除NODAL基因驗(yàn)證NODAL抗體的特異性。

乳腺癌在中國女性中發(fā)病率最高，死亡率位居所有癌癥的第6位［13］。其中三陰性乳腺癌的預(yù)后最差，因此本研究選取三陰性乳腺癌細(xì)胞株MDAMB-231作為基因敲除的靶細(xì)胞，采用CRISPR/Cas9技術(shù)敲除該細(xì)胞內(nèi)NODAL基因，為進(jìn)一步揭示NODAL基因在乳腺癌細(xì)胞中的分子機(jī)制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 主要試劑 MDA-MB-231細(xì)胞株、UCATMCRISPR/Cas9快速構(gòu)建及活性檢測試劑盒、AIOTMgene KO Cell Line Kit（ProuR）、CRISPR 質(zhì) 粒 均 購自北京百奧賽圖基因生物技術(shù)有限公司。嘌呤霉素（Puromycin）購自北京索萊寶科技有限公司。質(zhì)粒提取試劑盒、DNA純化試劑盒、瓊脂糖凝膠回收試劑盒購自廣州Omega飛揚(yáng)生物工程有限公司。限制性核酸內(nèi)切酶、T4連接酶購自寶日醫(yī)生物技術(shù)（北京）有限公司，細(xì)胞培養(yǎng)相關(guān)試劑購自美國Thermo公司。

1.1.2 主要實(shí)驗(yàn)儀器 細(xì)胞培養(yǎng)箱、PCR儀、凝膠成像儀、恒溫?fù)u床、恒溫培養(yǎng)箱、熒光顯微鏡、生物安全工作臺(tái)。

1.2 方法

1.2.1 敲除方案及Cas9/sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建 利用NCBI（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/） 查 找NODAL基因信息，分析NODAL基因生物學(xué)特征，根據(jù)NODAL基因CDS區(qū)結(jié)構(gòu)及性質(zhì)，確定敲除位點(diǎn)，制定敲除NODAL基因第二外顯子的敲除方案（圖1）。以MDA-MB-231細(xì)胞系cDNA為模板，設(shè)計(jì)引物并用PCR擴(kuò)增靶位點(diǎn)序列，測序確認(rèn)靶序列與GenBank中的NODAL基因參考序列一致，并利用此序列信息設(shè)計(jì)sgRNA，以確保Cas9/sgRNA的效率。

利用CRISPR在線設(shè)計(jì)工具（http：//CRISPR.mit.edu/），在NODAL基因第二外顯子位置5'端設(shè)計(jì)了7條sgRNA序列，即sgRNA1-7，3'端設(shè)計(jì)了4條sgRNA序列，即sgRNA8-11（表1），由英濰捷基（上海）貿(mào)易有限公司合成sgRNA oligo及其互補(bǔ)鏈。

圖1 敲除方案示意圖

表1 sgRNA oligo設(shè)計(jì)

sgRNA oligo經(jīng)變性-退火之后形成sgRNA oligo雙鏈，利用UCATMCRISPR/Cas9快速構(gòu)建及活性檢測試劑盒連入BbsI核酸內(nèi)切酶處理后的PCS質(zhì)粒載體中，通過測序驗(yàn)證，確定構(gòu)建成功后，分別命名為PCS-sgRNA1-PCS-sgRNA11。利用UCATMCRISPR/Cas9快速構(gòu)建及活性檢測試劑盒檢測PCS-sgRNA活性，經(jīng)數(shù)據(jù)分析，在5'端和3'端選擇最佳PCS-sgRNA質(zhì)粒用于下一步實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 打靶載體構(gòu)建 基于同源重組修復(fù)機(jī)制敲除目標(biāo)基因的原理，打靶載體由位于靶位點(diǎn)上游的左同源臂（L-arm，LR）和下游的右同源臂（R-arm，

RR）以及兩者之間的嘌呤霉素抗性基因PuroR構(gòu)成。因此，分別在NODAL基因第二外顯子上游和下游設(shè)計(jì)引物克隆同源臂，設(shè)計(jì)克隆左同源臂的PCR引 物 F：5'-CGATGGTACCGAAGCTTCTGGGTGCA TGTGATTGC-3'，下劃線處為KpnⅠ酶切位點(diǎn)，R：5'-CGATGTCGACAGAGGTTGGAGTAGAGCATAAGG AGC-3'，下劃線處為SalⅠ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為1285 bp；右同源臂PCR引物F：5'-CGATA CGCGTTTGGAATCACACTGTTCCAGCCACAG-3'，下劃線處為MluⅠ酶切位點(diǎn)，R：5'-CGATGCGGCCGC CTACCTTTAGCTCTGTGCTTGTTTTGTG-3'，下劃線處為NotⅠ酶切位點(diǎn)，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為1491 bp。上述4條引物中5' CGAT均為添加的酶切保護(hù)堿基。采用相應(yīng)引物PCR擴(kuò)增，經(jīng)凝膠電泳鑒定后膠回收，利用AIOTMgene KO Cell Line Kit試劑盒將LR、RR、PuroR經(jīng)一步克隆一起連入LScKO-4G質(zhì)粒中，構(gòu)建LScKO-LR-RR質(zhì)粒。再利用HindⅢ+SalⅠ、XhoⅠ+BamHⅠ、EcoRⅠ+NotⅠ等限制性核酸內(nèi)切酶組合酶切鑒定打靶載體，最終通過測序確認(rèn)是否構(gòu)建成功。

1.2.3 電轉(zhuǎn)及篩選 以1350 V電壓將作用于5'端和3'端的PCS-sgRNA質(zhì)粒以及打靶載體質(zhì)粒按質(zhì)量比1∶1∶1轉(zhuǎn)染入MDA-MB-231細(xì)胞中。無CO2條件下培養(yǎng)至細(xì)胞達(dá)到80%及以上融合度時(shí)，加入2μg/mL嘌呤霉素進(jìn)行藥物篩選，直至無大量細(xì)胞死亡時(shí)，取部分細(xì)胞提取基因組DNA，然后進(jìn)行混合基因型PCR鑒定。

1.2.4 混合基因型PCR鑒定及單細(xì)胞克隆挑選 如果電轉(zhuǎn)后在靶位點(diǎn)發(fā)生了同源重組，打靶載體提供的外源PuroR基因DNA會(huì)與靶位點(diǎn)DNA整合。因此，可在左同源臂上設(shè)計(jì)一條引物HR-F：5'-TGGTTGTCTTGGGTGTGTGGAACAG-3'，在PuroR外源基因靠近左同源臂端設(shè)計(jì)一條引物HR-P-F：5'-CTCGACTGTGCCTTCTAGTTGCCAG-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為1782 bp。同理，在右同源臂上設(shè)計(jì)一條引物HR-R：5'-CAGAGGCCACTTGTGTAGCG-3'，在PuroR外源基因靠近右同源臂端設(shè)計(jì)一條引物HRP-R：5'-CAATTCACATCCTAGATGGGCAGGTC-3'，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為1780 bp（圖2）。取部分經(jīng)電轉(zhuǎn)且嘌呤霉素篩選后存活的細(xì)胞，提取基因組DNA作為模板，如果這兩對(duì)引物能夠擴(kuò)增出預(yù)期大小的條帶，說明電轉(zhuǎn)后有細(xì)胞發(fā)生了同源重組，可進(jìn)行單細(xì)胞克隆挑選。

圖2 等位基因同源重組PCR基因型鑒定引物位置示意圖

1.2.5 單細(xì)胞克隆基因型鑒定

1.2.5.1 等位基因同源重組PCR鑒定 等位基因同源重組PCR鑒定同步驟1.2.4，差別僅在于此處是鑒定單細(xì)胞克隆的基因型（圖2）。

1.2.5.2 等位基因移碼突變PCR鑒定 本研究共設(shè)計(jì)兩個(gè)Cas9/sgRNA酶切作用位點(diǎn)，在靠近左同源臂的作用位點(diǎn)兩端設(shè)計(jì)一對(duì)引物FS-F：5'-GCTGCTTAGAGCGGTTTCAGATGGA-3'和FS-R：5'-GTCGGATGAAACTCCTCCCCAACAG-3'，野生型基因擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為493 bp，如果發(fā)生了移碼突變，擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小非常相似，只能通過測序判斷基因型（圖3）。

圖3 等位基因移碼突變PCR鑒定引物位置示意圖

1.2.5.3 等位基因大片段缺失PCR鑒定 在設(shè)計(jì)的兩個(gè)Cas9/sgRNA酶切作用位點(diǎn)的兩端，設(shè)計(jì)一對(duì)引物，Del-F：5'-TTGTCCCAGGTCACCTTTTCCTTGG-3'和 Del-R：5'-TTCTTCCTCCACCACCTCCTAGACC-3'，野生型基因擴(kuò)增產(chǎn)物片段大小為1462 bp，發(fā)生同源重組的基因擴(kuò)增產(chǎn)物大小為3151 bp，如果是發(fā)生了大片段缺失的片段大小約為620 bp（圖4）。最終通過測序確定單細(xì)胞克隆是否發(fā)生等位基因大片段缺失。

圖4 等位基因大片段缺失PCR鑒定引物位置示意圖

1.2.6 NODAL蛋白水平鑒定 將基因型鑒定為陽性的單細(xì)胞克隆擴(kuò)大培養(yǎng)，提取細(xì)胞總蛋白，經(jīng)SDSPAGE電泳并轉(zhuǎn)至PVDF膜，用5%脫脂奶粉封閉1 h，分別用NODAL一抗（Abcam，Cat# ab55676，1∶1000）和 β-actin一抗（1∶10000）4℃孵育過夜，1×TBST清洗后，用山羊抗鼠（1∶5000）、山羊抗兔（1∶5000）二抗溶液中室溫孵育1 h，1×TBST再次清洗后，用化學(xué)發(fā)光儀檢測NODAL蛋白表達(dá)情況。

1.2.7 統(tǒng)計(jì)分析 Cas9/sgRNA質(zhì)粒的活性檢測，利用SPSS 19.0軟件將五次重復(fù)所得到的數(shù)據(jù)通過方差檢驗(yàn)計(jì)算每組的平均值±標(biāo)準(zhǔn)誤差，并以Con組為1作為標(biāo)準(zhǔn)，計(jì)算各組相對(duì)sgRNA活性。

2 結(jié)果

2.1 Cas9/sgRNA質(zhì)粒構(gòu)建及活性鑒定

基于sgRNA的設(shè)計(jì)原則，5'端設(shè)計(jì)了7條sgRNA，3'端設(shè)計(jì)了4條sgRNA，分別與CRISPR載體質(zhì)粒PCS連接，經(jīng)測序確認(rèn)成功構(gòu)建11個(gè)作用于NODAL基因靶序列的 Cas9/sgRNA質(zhì)粒。使用SSA reporter assay檢測sgRNA活性，各PCS-sgRNA質(zhì)粒顯示出不同程度的活性。根據(jù)質(zhì)?；钚圆⒔Y(jié)合sgRNA設(shè)計(jì)網(wǎng)站顯示這幾條sgRNA的不同特異性等因素綜合考慮，最終5'端選擇PCS-sgRNA1（圖5-A），3'端選擇PCS-sgRNA8（圖5-B）兩種Cas9/sgRNA質(zhì)粒進(jìn)行后續(xù)基因敲除實(shí)驗(yàn)。

圖5 Cas9/sgRNA質(zhì)粒活性檢測

2.2 打靶載體構(gòu)建

以MDA-MB-231乳腺癌細(xì)胞基因組DNA為模板，用設(shè)計(jì)的PCR引物分別擴(kuò)增左、右同源臂，電泳結(jié)果（圖6-A）顯示片段大小與預(yù)期相符。將左、右同源臂與試劑盒中的PuroR基因一起克隆至LScKO-4G質(zhì)粒中，構(gòu)建LScKO-LR-RR質(zhì)粒，然后使用限制性核酸內(nèi)切酶酶切驗(yàn)證打靶載體。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如果用Hind Ⅲ+SalⅠ雙酶切打靶載體質(zhì)粒，電泳后應(yīng)觀察到3條帶，大小應(yīng)分別為1264 bp、2727 bp和4059 bp；如果用XhoⅠ+BamHⅠ雙酶切打靶載體質(zhì)粒，電泳后也應(yīng)觀察到3條帶，條帶大小分別為386 bp、2228 bp和5436 bp；而如果用EcoRⅠ+NotⅠ雙酶切打靶載體質(zhì)粒，電泳后也應(yīng)觀察到3條帶，條帶大小分別為768 bp、2754 bp和4528 bp。應(yīng)用這3種組合酶酶切打靶質(zhì)粒的瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果顯示片段大小與預(yù)期一致（圖6-B）。只是XhoⅠ+BamHⅠ雙酶切后產(chǎn)生的386 bp和EcoRⅠ+NotⅠ雙酶切產(chǎn)生的768 bp兩條帶均由于DNA片段小，結(jié)合EB染料少，觀察到的條帶弱，在本圖中未能清晰展示（圖6-B）。最終經(jīng)測序確認(rèn)，打靶載體構(gòu)建成功。

2.3 基因型鑒定

2.3.1 混合基因型鑒定 以電轉(zhuǎn)并經(jīng)嘌呤霉素篩選后存活的部分細(xì)胞提取基因組DNA作為模板，采用鑒定基因重組的引物擴(kuò)增DNA片段。根據(jù)實(shí)驗(yàn)設(shè)計(jì)，如果外源的PuroR基因與NODAL基因第二外顯子靶位點(diǎn)發(fā)生重組，利用外源基因5'端位置附近設(shè)計(jì)的PCR引物擴(kuò)增的產(chǎn)物大小為1782 bp，外源基因3'端位置附近設(shè)計(jì)的PCR引物擴(kuò)增的產(chǎn)物大小為1780 bp。這兩對(duì)引物的PCR產(chǎn)物瓊脂糖凝膠電泳結(jié)果與預(yù)期大小均一致（圖7），說明至少在部分細(xì)胞中PuroR基因與NODAL基因靶位點(diǎn)發(fā)生了同源重組，可挑取單細(xì)胞克隆進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.3.2 等位基因同源重組基因型鑒定 單細(xì)胞克隆等位基因同源重組基因型鑒定與混合基因型鑒定原理一樣，不同之處在于本鑒定是以單細(xì)胞克隆中提取的DNA作為PCR擴(kuò)增的模板。PCR產(chǎn)物預(yù)期大小也是5'端為1782 bp，3'端為1780 bp。將挑取的15個(gè)單細(xì)胞克隆的基因組DNA作為模板，PCR產(chǎn)物電泳結(jié)果顯示，在15個(gè)單細(xì)胞克隆中，僅有C1單細(xì)胞克隆的5'端PCR產(chǎn)物條帶較弱，其余單細(xì)胞克隆條帶強(qiáng)，且與預(yù)期大小相符（圖8-A）；而在15個(gè)單細(xì)胞克隆的3'端PCR產(chǎn)物中，C1單細(xì)胞克隆未觀察到與預(yù)期大小一致的條帶，B6單細(xì)胞克隆的目標(biāo)條帶較弱，其余單細(xì)胞克隆均有與較強(qiáng)的目標(biāo)條帶（圖8-B）。最終選擇A4、B4、B6、C2、E4、F3、F4和H3共8個(gè)單細(xì)胞克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行測序，測序結(jié)果顯示這8個(gè)單細(xì)胞克隆的NODAL等位基因均發(fā)生了同源重組。

圖6 打靶載體構(gòu)建

2.3.3 等位基因移碼突變基因型鑒定 通過等位基因同源重組基因型鑒定陽性的單細(xì)胞克隆，僅能證明至少有一個(gè)NODAL基因的等位基因發(fā)生了重組替換。但是癌細(xì)胞至少有2個(gè)以上的等位基因。此外，當(dāng)Cas9/sgRNA復(fù)合體在靶位點(diǎn)剪斷DNA雙鏈后，細(xì)胞除可利用同源重組的修復(fù)機(jī)制外，還可利用非同源末端連接的修復(fù)機(jī)制修復(fù)DNA損傷，從而造成靶基因發(fā)生移碼突變，同樣可達(dá)到敲除基因的效果。因此，需進(jìn)行移碼突變基因型進(jìn)行鑒定。利用擴(kuò)增等位基因移碼突變的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，結(jié)果顯示：15個(gè)單細(xì)胞克隆中，除B4、C2、F4三個(gè)單細(xì)胞克隆外，其余12個(gè)單細(xì)胞克隆均擴(kuò)增出大小約為490 bp的條帶（圖9-A），將其中A4、B6、E4、F3和H3五個(gè)單細(xì)胞克隆的PCR產(chǎn)物進(jìn)行了全長測序。測序結(jié)果經(jīng)比對(duì)分析，發(fā)現(xiàn)B6、E4、F3和H3四個(gè)單細(xì)胞克隆擴(kuò)增產(chǎn)物是野生型片段（擴(kuò)增序列與NODAL基因參考序列完全一致，比對(duì)結(jié)果未展示），說明在這4個(gè)細(xì)胞克隆中，至少還有一個(gè)野生型NODAL基因拷貝。僅有A4單細(xì)胞克隆在NODAL基因mRNA序列的642位插入了一個(gè)T堿基（圖9-B），該插入T堿基位于PCR產(chǎn)物正向測序峰圖的191位，且峰形完整（圖9-C），反向測序峰圖在相應(yīng)位置也有完整峰形的該插入T堿基（結(jié)果未展示）。上述結(jié)果表明，A4單細(xì)胞克隆在第二外顯子區(qū)域插入非三的整倍體堿基，發(fā)生等位基因移碼突變。

圖7 混合克隆細(xì)胞基因型鑒定

圖8 等位基因同源重組PCR鑒定

圖9 等位基因移碼突變基因型鑒定

2.3.4 等位基因大片段缺失基因型鑒定 由于本研究采用雙位點(diǎn)剪切靶序列，還可能發(fā)生基因大片段缺失的情況。利用檢測大片段缺失的引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增。結(jié)果（圖10-A）顯示，8個(gè)單細(xì)胞克隆僅E4、F3、F4和H3單細(xì)胞克隆能擴(kuò)增出的大小約為620 bp的條帶，說明這4個(gè)單細(xì)胞克隆可能發(fā)生了等位基因大片段缺失。將F3約620 bp的PCR產(chǎn)物克隆并測序的結(jié)果進(jìn)行基因組BLAST比對(duì)，結(jié)果（圖10-B）顯示在10號(hào)染色體上NODAL基因位置從編號(hào)70434736 bp到70435576 bp部分發(fā)生DNA片段缺失，大小為840 bp。同樣方法還分析了E4、F4和H3單細(xì)胞克隆的測序結(jié)果，結(jié)果與F3類似，其中E4缺失了848 bp基因組片段，F(xiàn)4缺失了840 bp基因組片段，H3缺失了840 bp基因組片段（基因組BLAST比對(duì)結(jié)果未展示）。

綜合分析等位基因同源重組、等位基因移碼突變和等位基因大片段缺失這3種PCR基因型鑒定及測序結(jié)果，總結(jié)為表2。結(jié)果顯示；A4，B4，C2 和F4四個(gè)單細(xì)胞克隆的NODAL基因均被敲除，B6，E4，F(xiàn)3和H3四個(gè)單細(xì)胞克隆的NODAL基因被部分敲除。

2.4 蛋白表達(dá)鑒定

將已進(jìn)行基因型鑒定的單細(xì)胞克隆全部擴(kuò)大培養(yǎng)，提取總蛋白進(jìn)行了NODAL蛋白表達(dá)檢測。結(jié)果顯示在8個(gè)單細(xì)胞克隆中，檢測到B4、E4、F3三個(gè)單細(xì)胞克隆的NODAL蛋白表達(dá)水平有不同程度降低，A4、B6兩個(gè)單細(xì)胞克隆檢測不到NODAL蛋白的表達(dá)，其他3個(gè)單細(xì)胞克隆NODAL蛋白表達(dá)變化不大（圖11）。說明A4、B6在蛋白水平鑒定為敲除NODAL基因的單細(xì)胞克隆。

圖10 等位基因大片段缺失基因型鑒定

3 討論

自1993年克隆NODAL基因以來，發(fā)現(xiàn)該基因主要在胚胎發(fā)育過程中有重要作用［14］。至2006年Hendrix實(shí)驗(yàn)室發(fā)現(xiàn)NODAL在黑色素瘤中有促腫瘤作用，后續(xù)研究發(fā)現(xiàn)在其它多種腫瘤中也有同樣作用［15-16］。檢索到關(guān)于NODAL在腫瘤細(xì)胞中功能的文獻(xiàn)均采用基因敲低技術(shù)抑制NDOAL的表達(dá)，未見敲除NDOAL基因細(xì)胞系的報(bào)道。本研究利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)在三陰性乳腺癌細(xì)胞MDA-MB-231中成功敲除NODAL基因。

CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)是繼ZFNs、TALENs技術(shù)之后的第三代基因編輯技術(shù)。該技術(shù)是在向?qū)NA的指導(dǎo)下，核酸內(nèi)切酶Cas9蛋白可將靶DNA在特定位點(diǎn)剪斷，造成DNA雙鏈斷裂的損傷，再借助細(xì)胞自身具有的非同源末端連接和同源重組修復(fù)的機(jī)制，引發(fā)剪切位點(diǎn)的DNA堿基插入或缺失以及DNA片段的替換，最終使靶基因被敲除［17］。為了提高敲除效率，本研究提供了有同源片段的打靶載體，通過同源重組機(jī)制達(dá)到敲除基因的目的。本實(shí)驗(yàn)利用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)精確剪切MDAMB-231乳腺癌細(xì)胞系NODAL基因第二外顯子5'端和3'端處兩個(gè)位點(diǎn)后，再通過同源重組機(jī)制將外源嘌呤霉素抗性基因替換NODAL基因的Exon2，從而達(dá)到敲除NODAL基因的目的。CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)具有操作簡單、實(shí)驗(yàn)周期短、成本較低等優(yōu)點(diǎn)，廣泛用于各種生物學(xué)、醫(yī)學(xué)研究［18］。

表2 基因型鑒定匯總

圖11 Western blot檢測NODAL蛋白表達(dá)

NODAL分子除TGF-β超家族成員所具有的信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)復(fù)雜性外，它還具有在mRNA和蛋白表達(dá)水平檢測的復(fù)雜性。mRNA表達(dá)水平不易檢測，存在較復(fù)雜的剪接異構(gòu)體，以及反義轉(zhuǎn)錄本和環(huán)狀轉(zhuǎn)錄本［19-20］。而NODAL蛋白表達(dá)雖然容易檢測，但是不同文獻(xiàn)報(bào)道的蛋白質(zhì)分子量差異較大［7］。已報(bào)道的NODAL前體蛋白的分子量范圍為35-48 kD，成熟肽的分子量范圍是13-17 kD，且不易在細(xì)胞裂解液中檢測到NODAL成熟肽。我們?cè)谘芯窟^程中也同樣面臨NODAL分子在mRNA和蛋白水平檢測的問題，以至于我們對(duì)NODAL抗體的特異性持懷疑態(tài)度，先后購買了5種NODAL抗體進(jìn)行檢測，檢測結(jié)果差別較大。由于基因敲除是驗(yàn)證抗體特異性的好方法，通過本研究對(duì)NODAL基因的敲除和驗(yàn)證，發(fā)現(xiàn)僅有Abcam（ab55676）和Santa Cruz（W65）兩種抗體的結(jié)果更可信。

鑒于NODAL研究的復(fù)雜性，本研究從等位基因的同源重組、移碼突變和大片段缺失3個(gè)方面鑒定單克隆細(xì)胞的基因型，以便于在基因組水平分析靶細(xì)胞的NODAL基因被敲除情況。結(jié)果發(fā)現(xiàn)B6單細(xì)胞克隆雖然還存在野生型的NODAL基因拷貝，但是卻檢測到NODAL蛋白不表達(dá)或很低表達(dá)，這說明即使有殘留NODAL基因拷貝但表達(dá)效率已很低。由于癌細(xì)胞的染色體是非整倍體，基因存在多個(gè)拷貝，完全敲除癌細(xì)胞的基因有一定難度。如果經(jīng)一輪敲除僅獲得部分基因拷貝敲除的細(xì)胞，可將此細(xì)胞再進(jìn)行一輪敲除，可提高成功率。本研究還發(fā)現(xiàn)雖然有的單細(xì)胞克隆鑒定為NODAL基因被部分或完全敲除，但是卻未影響NODAL蛋白的表達(dá)，甚至有蛋白表達(dá)增加的趨勢。這些問題還有待進(jìn)一步探究。此外，后續(xù)我們還將利用這些敲除細(xì)胞進(jìn)行體外和體內(nèi)實(shí)驗(yàn)，以研究NODAL基因在乳腺癌細(xì)胞增殖、遷移、侵襲、轉(zhuǎn)移和代謝等方面的作用。

4 結(jié)論

應(yīng)用CRISPR/Cas9基因編輯技術(shù)并利用DNA斷裂損傷后同源重組和非同源重組修復(fù)的機(jī)制，最終獲得基因型和蛋白表達(dá)鑒定為NODAL基因被敲除的單細(xì)胞克隆，為進(jìn)一步研究NODAL分子在乳腺癌細(xì)胞中的功能提供了重要支撐。本研究還發(fā)現(xiàn)有一些單細(xì)胞克隆雖然基因型鑒定為陽性，但是NODAL蛋白的表達(dá)并不降低，其原因還有待進(jìn)一步研究。