馬鴻程 熊顯榮 穆松銀 海卓 秦文昌 李鍵

（1. 西南民族大學(xué)生命科學(xué)與技術(shù)學(xué)院，成都 610041；2. 青藏高原動(dòng)物遺傳資源保護(hù)與利用國(guó)家教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，成都6100041）

牦牛（Bos grunniens）是起源于中國(guó)的原始物種，主要分布于青藏高原及其周?chē)０?000 m以上的高原地區(qū)，其適應(yīng)高寒、低氧能力強(qiáng)，被譽(yù)為“高原之舟”，是當(dāng)?shù)啬撩瘾@取肉、奶、皮毛、役力、燃料等生產(chǎn)生活資料的重要來(lái)源。然而牦牛較普通牛種繁殖性能低下，多為兩年一胎或三年兩胎，因此極大限制了牦牛產(chǎn)業(yè)發(fā)展［1］。卵泡發(fā)育、卵母細(xì)胞成熟以及排卵等過(guò)程受各種因子及卵泡內(nèi)外環(huán)境共同調(diào)控［2-4］。腫瘤壞死因子α誘導(dǎo)蛋白（Tumor necrosis factor-alpha induced protein，TNFAIP）由腫瘤壞死因子（Tumor necrosis factorα，TNFα）誘導(dǎo)產(chǎn)生。該家族的成員包括TNFAIP（1-9）［5］。TNFAIP6又被稱(chēng)為T(mén)NF刺激基因 6（TNF-stimulated gene-6，TSG-6），之前普遍認(rèn)為該基因由機(jī)體對(duì)炎癥信號(hào)做出反應(yīng)而表達(dá)［6］，但隨著研究進(jìn)展發(fā)現(xiàn)促黃體素（LH）也能夠誘導(dǎo)卵巢卵丘細(xì)胞（Cumulus cells，CCs）表達(dá)TNFAIP6基因［7-8］。研究表明TNFAIP6正向調(diào)控CCs擴(kuò)散過(guò)程，在卵泡發(fā)育、排卵、黃體化及胚胎發(fā)育中起著非常關(guān)鍵的作用［9-10］。因此，進(jìn)行牦牛卵巢TNFAIP6基因研究對(duì)進(jìn)一步探索其在牦牛生殖中的作用機(jī)制具有重要意義。

TNFAIP6蛋白包含Link和CUB兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中Link結(jié)構(gòu)域介導(dǎo)該蛋白與透明質(zhì)酸（Hyaluronic acid，HA）及 α-胰蛋白酶抑制劑（Inter-α trypsin inhibitor，IαI）共價(jià)結(jié)合，形成穩(wěn)定的三元復(fù)合物存在于包括卵丘卵母細(xì)胞復(fù)合體（COCs）在內(nèi)的多種生物系統(tǒng)中，參與細(xì)胞附著、增殖、分化和凋亡等生物學(xué)過(guò)程［11-13］。早期對(duì)TNFAIP6基因的研究較多是在癌癥機(jī)制方面，如乳腺癌［14］、直腸癌［15］等。另外TNFAIP6基因參與炎癥過(guò)程，在關(guān)節(jié)炎患者的關(guān)節(jié)滑液中檢測(cè)到該基因有表達(dá)［16］，其還通過(guò)調(diào)控肺部嗜酸性粒細(xì)胞的細(xì)胞周期而影響小鼠的哮喘進(jìn)程［17］。隨著研究深入，發(fā)現(xiàn)TNFAIP6基因在生殖中具有重要作用。LH能夠誘導(dǎo)小鼠顆粒細(xì)胞中TNFAIP6基因表達(dá)，并且該基因在靠近卵母細(xì)胞的內(nèi)層顆粒細(xì)胞中表達(dá)顯著高于外層顆粒細(xì)胞［7-8］。研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP6基因在發(fā)情周期受損的小鼠卵巢中低表達(dá)，引起生殖激素分泌紊亂，導(dǎo)致卵母細(xì)胞功能不全并影響排卵［18-19］。豬卵母細(xì)胞體外成熟24 h時(shí)TNFAIP6表達(dá)量達(dá)到最高，這有利于減數(shù)分裂進(jìn)程以及胚胎發(fā)育，但TNFAIP6持續(xù)高表達(dá)會(huì)影響卵母細(xì)胞減數(shù)分裂成熟和后續(xù)的胚胎發(fā)育［20］。Ochsner等［7］研究表明，TNFAIP6由cAMP/PKA信號(hào)通路誘導(dǎo)產(chǎn)生，抑制該信號(hào)通路后TNFAIP6表達(dá)缺失。TNFAIP6缺失后，TNFAIP6/HA復(fù)合物形成受到抑制，卵丘擴(kuò)散受損而導(dǎo)致小鼠不孕［21］。

目前關(guān)于TNFAIP6基因的研究主要集中在腫瘤等疾病及其他動(dòng)物生殖方面，而在牦牛生殖作用中研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本研究以牦牛為對(duì)象，克隆獲得TNFAIP6基因序列并對(duì)其進(jìn)行生物信息學(xué)及蛋白功能結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)分析；半定量PCR法檢測(cè)TNFAIP6基因在牦牛各組織中的表達(dá)情況；采用蛋白免疫印跡（Western blot，WB）和實(shí)時(shí)熒光定量PCR（Quantitative real-time PCR，qRT-PCR）法分別檢測(cè)TNFAIP6在不同發(fā)情期牦牛卵巢中的蛋白和mRNA表達(dá)水平。為深入研究牦牛TNFAIP6基因及其在促進(jìn)牦牛卵巢發(fā)育和排卵等方面的作用機(jī)制提供基礎(chǔ)資料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 樣品采集 本試驗(yàn)所有樣本均采自四川省廣漢市屠宰場(chǎng)。3-5歲健康的空懷期雌性牦牛（n=9），屠宰后無(wú)菌采集心臟、肺臟、脾臟、腎臟、肝臟、子宮、小腸、胃、肌肉和處于不同活動(dòng)時(shí)期（卵泡期、紅體期、黃體期）的卵巢組織，采集后用無(wú)菌生理鹽水清洗，剪成約1 cm3大小后裝入凍存管，投入液氮罐2-3 h內(nèi)帶回實(shí)驗(yàn)室保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 主要材料與試劑 TRIzol提取試劑從Invitrogen公司購(gòu)入；PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒、Premix TapTMDNA聚合酶、pMD-19T載體、DNA Marker及SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒均從TaKaRa公司購(gòu)入；抗體從Abcam公司購(gòu)入；感受態(tài)細(xì)胞DH5α購(gòu)于天根生化科技有限公司；BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒、DNA膠回收試劑盒從Beyotime公司購(gòu)入；所有引物均由南京金瑞斯生物科技有限公司合成。其他未作說(shuō)明的化學(xué)試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.2 方法

1.2.1 組織總RNA和總蛋白提取

1.2.1.1 各組織總RNA的提取和反轉(zhuǎn)錄 嚴(yán)格按照Trizol法說(shuō)明書(shū)步驟提取組織總RNA。核酸濃度測(cè)定儀測(cè)定其純度，選擇范圍為1.8-2.0的RNA作為模板。按照TaKaRa公司的PrimeScriptTMRT Reagent Kit反轉(zhuǎn)錄試劑盒說(shuō)明書(shū)合成cDNA，-20℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.1.2 不同發(fā)情時(shí)期卵巢組織總蛋白的提取 卵巢組織剪部分稱(chēng)重后分別置于提前預(yù)冷標(biāo)號(hào)的EP管中，再將根據(jù)RIPA裂解液說(shuō)明書(shū)混勻后的裂解液按照0.1 g組織/0.6 mL的比例加入EP管中，利用超聲破碎儀將組織打碎，待勻漿即EP管中無(wú)明顯組織碎塊后加入緩沖液（總體積的1/3），水浴鍋中97℃煮5 min，再將EP管放入離心機(jī)中16000 r/min，15 min后取上清液置于新的EP管中。根據(jù)BCA蛋白濃度測(cè)定試劑盒說(shuō)明書(shū)測(cè)定蛋白濃度。

1.2.2 引物設(shè)計(jì)及合成 根據(jù)NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中GenBank所公布野牦牛（Bos mutus）TNFAIP6基因的mRNA序列（GenBank登錄號(hào)：XM_005894773.2）和GAPDH基因的mRNA序列（GenBank登錄號(hào)：AC_000162.1），利用Premier 5.0軟件分別設(shè)計(jì)目的基因的PCR擴(kuò)增引物和熒光定量引物，將設(shè)計(jì)的引 物用NCBI中Primer-BLAST在線(xiàn)比對(duì)工具進(jìn)行質(zhì)量檢測(cè)。引物序列見(jiàn)表1。

表1 引物序列及PCR反應(yīng)條件

1.2.3 牦牛TNFAIP6基因克隆測(cè)序 以牦牛卵巢cDNA為模板進(jìn)行擴(kuò)增。TNFAIP6基因擴(kuò)增體系25μL：2×LA Taq Master Mix 12.5 μL，上游、下游引物各 1 μL，cDNA 模板 1 μL，ddH2O 9.5 μL。反應(yīng)條件：94℃預(yù)變性4 min，94℃變性45 s，61℃退火45 s，72℃延伸1 min，35個(gè)循環(huán)，72℃再延伸7 min，最后4℃保存。用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，按照膠回收試劑盒說(shuō)明書(shū)純化回收目的DNA。將膠回收產(chǎn)物連接轉(zhuǎn)化后，篩選3個(gè)陽(yáng)性克隆。樣品送生工生物工程有限公司進(jìn)行測(cè)定。

1.2.4 牦牛TNFAIP6基因生物信息學(xué)分析 利用NCBI中BLAST和ConservedDomin程序?qū)y(cè)序所得牦牛TNFAIP6核苷酸序列分別進(jìn)行同源性分析和結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)；ProtParam預(yù)測(cè)牦牛TNFAIP6蛋白的基本理化性；MEGA5.0和ClustalX1.83構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)。PredictProtein和SWISS-MODEL預(yù)測(cè)TNFAIP6的二級(jí)結(jié)構(gòu)和三級(jí)結(jié)構(gòu)。

1.2.5 牦牛TNFAIP6基因組織表達(dá)譜分析 以?xún)?nèi)參基因GAPDH作為參照，采用半定量PCR檢測(cè)TNFAIP6基因在牦牛心臟、肺臟、脾臟、腎臟、肝臟、子宮、小腸、胃、肌肉和卵巢中的表達(dá)情況，并檢測(cè)條帶灰度值確定相對(duì)表達(dá)量。為使比較更加明顯，將各組織cDNA模板濃度進(jìn)行檢測(cè)后一致調(diào)整為40ng/μL。反應(yīng)條件同1.2.3。1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果。

1.2.6TNFAIP6在牦牛發(fā)情周期卵巢活動(dòng)中的時(shí)序表達(dá)分析

1.2.6.1 Western blot法檢測(cè)TNFAIP6蛋白表達(dá)水平 提取蛋白后加入5×蛋白Loading Buffer，混勻后100℃水浴10 min使蛋白變性，水浴結(jié)束后12000 r/min離心1 min。將離心好的蛋白質(zhì)進(jìn)行SDS-聚丙烯酰胺凝膠電泳，當(dāng)溴酚藍(lán)移至凝膠下緣時(shí)停止電泳，剝下凝膠后放入PVBD膜上并與之完全貼合。用封閉液將PVBD膜完全浸沒(méi)后置于搖床上40 r/min搖動(dòng)封閉1 h。將PVBD膜與TNFAIP6兔抗人多克隆抗體（1∶1000稀釋?zhuān)┓庠谒苣z薄膜中，放于40 r/min搖床后4℃過(guò)夜孵育。次日取出PVBD膜后用TBST洗膜，重復(fù)洗3次，每次10 min。將洗后的PVBD膜與辣根過(guò)氧化物酶（HRP）標(biāo)記的羊抗兔二抗（1∶2000稀釋?zhuān)┓庠谒苣z薄膜中，放于40 r/min搖床，室溫?fù)u動(dòng)1 h孵育。孵育結(jié)束用TBST洗膜，重復(fù)洗3次，每次10 min。GAPDH作為內(nèi)參照，洗膜后曝光顯影。

1.2.6.2 qRT-PCR法檢測(cè)TNFAIP6mRNA表達(dá)水平 以TNFAIP6基因作為研究對(duì)象，內(nèi)參基因GAPDH作為參照，根據(jù)SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ試劑盒說(shuō)明書(shū)進(jìn)行qRT-PCR。反應(yīng)體系為15 μL：7.5 μL SYBR? Premix Ex TaqTMⅡ，0.5 μL 上游引物，0.5 μL 下游引物，1 μL 模板 cDNA，5.5 μL ddH2O。反應(yīng)條件為：95℃預(yù)變性3 min；95℃變性10 s，60℃退火30 s，72℃延伸30 s，40個(gè)循環(huán)；熔解曲線(xiàn)：從60℃以0.5℃/10 s的速度升至95℃。引物見(jiàn)表1，每個(gè)樣品重復(fù)3次。

1.2.7 數(shù)據(jù)分析 利用SPASS軟件進(jìn)行分析。熒光定量結(jié)果采用2-ΔΔCt進(jìn)行分析，ANOVA顯著性差異分析，P＞0.05表示差異不顯著，P＜0.01表示差異極顯著。

2 結(jié)果

2.1 牦牛TNFAIP6基因克隆和擴(kuò)增測(cè)序

采用RT-PCR法對(duì)TNFAIP6基因進(jìn)行擴(kuò)增，用1.5%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)PCR擴(kuò)增結(jié)果，得到與預(yù)期大小1082 bp基本一致的目的片段，如圖1所示。陽(yáng)性菌液經(jīng)公司測(cè)序驗(yàn)證獲得牦牛TNFAIP6基因核苷酸序列全長(zhǎng)1082 bp，其中編碼區(qū)為830 bp。

2.2 牦牛與野牦牛TNFAIP6基因核苷酸與氨基酸比對(duì)

利用NCBI在線(xiàn)比對(duì)程序?qū)﹃笈NFAIP6測(cè)定序列編碼區(qū)與設(shè)計(jì)引物所用野牦牛（Bos mutusGenBank登錄號(hào)：XM_005894773.2）的對(duì)應(yīng)序列進(jìn)行比對(duì)，結(jié)果顯示同源性為99.4%，且測(cè)序所得牦牛TNFAIP6基因序列編碼區(qū)共存在4處堿基突變，密碼子變化由TGT→TGC、CAG→AAG、GAG→GAA、ACA→AGA，第2、4個(gè)密碼子改變導(dǎo)致第28位、133位氨基酸變化由Q→K、T→R。

圖1 牦牛TNFAIP6基因PCR擴(kuò)增結(jié)果

2.3 TNFAIP6基因物種間的同源性比對(duì)

利用NCBI在線(xiàn)比對(duì)程序?qū)寺〉玫降年笈NFAIP6核苷酸序列與野牦牛（Bos mutusGenBank登錄號(hào)：XM_005894773.2）、黃牛（Bos taurusGenBank登錄號(hào)：NM_001007813.2）、馬（Equus caballusGenBank登錄號(hào)：NM_001081906.1）、人（Homo sapiensGenBank登錄號(hào)：NM_007115.4）、小鼠（Mus musculusGenBank登錄號(hào) ：NM_009398.2）、獼 猴（NemestrinaGenBank登錄號(hào) ：XM_011759906.1）、家兔（Oryctolagus cuniculusGenBank登錄號(hào)：NM_001082311.1）、黑猩猩（Pan paniscusGenBank登錄號(hào)：XM_003818305.1）、野豬（Sus scrofaGenBank登錄號(hào)：NM_001159607.1）和北極熊（Ursus maritimusGenBank登錄號(hào)：XM_008686978.1）的TNFAIP6核苷酸序列進(jìn)行同源性比對(duì)（圖2）。結(jié)果顯示，牦牛TNFAIP6基因序列與野牦牛和黃牛的同源性高達(dá)99.4%和99.3%；與馬、人、獼猴、家兔、黑猩猩、野豬和北極熊的同源性也較高。表明牦牛TNFAIP6基因在哺乳動(dòng)物長(zhǎng)期進(jìn)化的過(guò)程中保守性較強(qiáng)。

利用MEGA5.0軟件對(duì)11個(gè)物種TNFAIP6基因的CDS區(qū)進(jìn)行了遺傳進(jìn)化樹(shù)分析，結(jié)果如圖3所示，牦牛與黃牛及野牦牛的親緣關(guān)系最近；與人、馬、野豬、獼猴、黑猩猩、北極熊形成一個(gè)分支；與小鼠和家兔的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

圖2 牦牛TNFAIP6基因與其他物種的同源性比對(duì)

圖3 牦牛TNFAIP6基因與其他物種的系統(tǒng)進(jìn)化樹(shù)

2.4 牦牛TNFAIP6蛋白結(jié)構(gòu)和功能預(yù)測(cè)

牦牛TNFAIP6蛋白的理化性質(zhì)結(jié)果顯示，該蛋白原子總數(shù)為4396，分子量為32 kD，分子式為C1438H2168N378O404S12。脂肪族指數(shù)81.79，預(yù)計(jì)半衰期為30 h，理論等電點(diǎn)為6.31，不穩(wěn)定指數(shù)為36.26，親水性平均值為-0.237，可推測(cè)TNFAIP6蛋白為穩(wěn)定的親水酸性蛋白。TNFAIP6蛋白共包含20種氨基酸，出現(xiàn)頻率較高的有Gly（10.0%）、Leu（7.9%）、Ala（7.2%）、Ile（6.5%）、Tyr（6.5%）、Val（6.5%），無(wú)Pyl和Sec。帶負(fù)電荷的殘基總數(shù)（Asp+Glu）為33個(gè)，帶正電荷的殘基總數(shù)（Arg+Lys）為30個(gè)，因此該蛋白整體上帶負(fù)電。

ProtScale工具進(jìn)行親水性預(yù)測(cè)分析，牦牛TNFAIP6蛋白親水性在第6位最大為3.400，第120位最小為-2.433，且大多數(shù)氨基酸殘基親水性分值小于零，即具有親水性，這與該蛋白的理化性質(zhì)分析結(jié)果一致?？缒そY(jié)構(gòu)域和信號(hào)肽分析結(jié)果表明，牦牛TNFAIP6蛋白無(wú)跨膜結(jié)構(gòu)，在第17-18位氨基酸存在信號(hào)肽。NCBI中CDD分析該蛋白結(jié)構(gòu)域，結(jié)果顯示該蛋白共包含2個(gè)結(jié)構(gòu)域，其中第36-128位氨基酸為L(zhǎng)ink（透明質(zhì)酸結(jié)合域）結(jié)構(gòu)域，第135-244位氨基酸為CUB結(jié)構(gòu)域（圖4）。編碼區(qū)蛋白修飾磷酸化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，該蛋白具有36個(gè)磷酸化位點(diǎn)，其中絲氨酸（Ser）位點(diǎn)17個(gè)、酪氨酸（Tyr）位點(diǎn)12個(gè)、蘇氨酸（Thr）位點(diǎn)7個(gè)；糖基化位點(diǎn)預(yù)測(cè)顯示，該蛋白具有N-糖基化位點(diǎn)和O-糖基化位點(diǎn)各1個(gè)，且閾值均在0.5以上。牦牛TNFAIP6蛋白二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)顯示，該蛋白含114個(gè)無(wú)規(guī)卷曲占40.86%，83個(gè)α-螺旋占29.75%，58個(gè)延伸鏈占20.79%，24個(gè)β-折疊占8.60%，可推測(cè)該蛋白的主要組成元件為無(wú)規(guī)卷曲和α-螺旋，與該蛋白三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)結(jié)果一致（圖5）。

2.5 牦牛TNFAIP6基因組織表達(dá)譜分析

半定量PCR檢測(cè)TNFAIP6基因在牦牛各組織中的表達(dá)，電泳圖（圖6-A）及灰度分析（圖6-B）結(jié)果顯示，TNFAIP6基因在牦牛各組織中均有表達(dá)，但存在一定的差異。其中，卵巢、子宮、脾臟和肌肉組織中表達(dá)量顯著高于其他組織，心臟次之，肺臟、腎臟、肝臟、小腸、胃中表達(dá)相對(duì)較少。

圖4 牦牛TNFAIP6蛋白結(jié)構(gòu)域預(yù)測(cè)

圖5 牦牛TNFAIP6蛋白的三級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測(cè)

圖6 牦牛TNFAIP6基因組織表達(dá)（A）及灰度分析（B）

2.6 牦牛TNFAIP6在發(fā)情周期卵巢活動(dòng)中的時(shí)序表達(dá)

內(nèi)參基因GAPDH作為參照，采用qRT-PCR法檢測(cè)發(fā)情周期牦牛卵巢TNFAIP6基因的表達(dá)水平，并用Western blot法檢測(cè)發(fā)情周期牦牛卵巢TNFAIP6蛋白的表達(dá)量。Western blot結(jié)果顯示，卵泡期TNFAIP6蛋白水平最高，其次為黃體期（圖7-A）。qRT-PCR結(jié)果顯示TNFAIP6基因在牦牛不同發(fā)情期的卵巢中均有表達(dá)，其中卵泡期表達(dá)水平極顯著高于其他兩個(gè)時(shí)期（P＜0.01），而紅體期與黃體期表達(dá)水平差異不顯著（P＞0.05）（圖7-B）。不同時(shí)期卵巢中TNFAIP6蛋白水平與轉(zhuǎn)錄水平基本一致。

圖7 牦牛發(fā)情周期卵巢組織中TNFAIP6蛋白（A）和mRNA（B）的表達(dá)

3 討論

TNFAIP6是一類(lèi)分泌蛋白，介導(dǎo)多種免疫調(diào)節(jié)和修復(fù)，直接或間接參與細(xì)胞黏附、生長(zhǎng)分化、遷移等生物學(xué)過(guò)程［22-23］。有研究表明，TNFAIP6基因在卵丘細(xì)胞外基質(zhì)中具有結(jié)構(gòu)作用，或增強(qiáng)IαI的抗保護(hù)作用，以保護(hù)細(xì)胞外基質(zhì)不被降解，對(duì)排卵過(guò)程至關(guān)重要［24］。目前，國(guó)內(nèi)外關(guān)于TNFAIP6基因在牦牛上的研究尚未見(jiàn)報(bào)道。本試驗(yàn)首次以牦牛卵巢為模板克隆得到TNFAIP6基因序列，其中包含完整的CDS區(qū)。與設(shè)計(jì)引物所用的野牦牛序列進(jìn)行比對(duì)，發(fā)現(xiàn)編碼區(qū)序列有4處堿基突變，導(dǎo)致部分氨基酸序列發(fā)生改變，但這種改變是否會(huì)造成該基因?qū)ι彻δ艿挠绊懹写M(jìn)一步驗(yàn)證。結(jié)構(gòu)域分析表明該蛋白具有Link和CUB兩個(gè)結(jié)構(gòu)域，Briggs等［25］研究發(fā)現(xiàn)TNFAIP6蛋白的Link結(jié)構(gòu)域具有HA特異性結(jié)合位點(diǎn)，能夠調(diào)節(jié)HA活性。同源性分析發(fā)現(xiàn)，該基因與野牦牛、黃牛的同源性最高，與進(jìn)化樹(shù)親緣關(guān)系分析結(jié)果相符，提示牦牛TNFAIP6基因在長(zhǎng)期進(jìn)化過(guò)程中具有較高的保守性。

組織表達(dá)譜研究發(fā)現(xiàn)，TNFAIP6基因在牦牛各組織和器官中均有表達(dá)，但表達(dá)量存在差異，其中在卵巢、子宮和脾臟組織中表達(dá)水平較高，這與已有研究結(jié)果相近［26-27］。TNFAIP6作為抗炎癥因子［28］，其在結(jié)腸炎［29］、胰腺炎［30］等炎癥及癌癥［31］中發(fā)揮重要作用，脾臟是機(jī)體最大的免疫器官，TNFAIP6基因在其內(nèi)的高表達(dá)說(shuō)明該基因的抗炎抑癌作用可能與機(jī)體的免疫系統(tǒng)相關(guān)，此問(wèn)題有待進(jìn)一步驗(yàn)證。同時(shí)該基因在卵巢和子宮組織中的高表達(dá)提示其可能對(duì)牦牛生殖調(diào)控具有一定作用。

哺乳動(dòng)物性成熟后其卵巢會(huì)進(jìn)行周期性排卵活動(dòng)，即突出于卵巢表面的成熟卵泡發(fā)生破裂，COCs隨基質(zhì)排出［32］，這個(gè)過(guò)程受卵丘細(xì)胞（Cumulus cells，CCs）擴(kuò)散等生物學(xué)過(guò)程的調(diào)節(jié)［33］。有研究表明CCs的增殖擴(kuò)散對(duì)卵泡生長(zhǎng)、排卵以及黃體化過(guò)程具有重要的作用［10］。Mukhopadhyay等［8］免疫組織化學(xué)法檢測(cè)排卵前卵泡發(fā)現(xiàn)，TNFAIP6蛋白與HA共同分布在CCs周?chē)幕|(zhì)中。同時(shí)Assidi等［9］指出TNFAIP6參與卵泡發(fā)育及卵丘擴(kuò)散等生物學(xué)過(guò)程的調(diào)控。為了進(jìn)一步探索TNFAIP6在牦牛生殖過(guò)程中的作用，本試驗(yàn)通過(guò)Western blot和qRTPCR法檢測(cè)該蛋白在牦牛發(fā)情周期卵巢活動(dòng)中的表達(dá)規(guī)律。結(jié)果顯示，隨著發(fā)情周期卵巢活動(dòng)變化，TNFAIP6的蛋白表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄水平均存在規(guī)律性變化，且二者表達(dá)規(guī)律基本一致，其中卵泡期表達(dá)水平極顯著的高于紅體期和黃體期。有研究表明，TNFAIP6主要在卵泡內(nèi)層顆粒細(xì)胞中表達(dá)，而外層顆粒細(xì)胞基本不表達(dá)，卵泡發(fā)育過(guò)程中卵泡腔逐漸形成，外層和內(nèi)層顆粒細(xì)胞也分別分化形成壁顆粒細(xì)胞和 CCs［7，10］。隨著卵泡不斷生長(zhǎng)發(fā)育，CCs 中TNFAIP6表達(dá)量增加，并且發(fā)育至排卵前卵泡時(shí)，CCs及其周?chē)幕|(zhì)中TNFAIP6mRNA表達(dá)量達(dá)到最高［8］。另外，LH能促進(jìn) TNFAIP6蛋白表達(dá)［7］，排卵前LH激增，高表達(dá)的TNFAIP6蛋白與HA和IαI結(jié)合形成三元復(fù)合物共同調(diào)節(jié)細(xì)胞基質(zhì)形成并積聚在CCs之間［12］。最終引起基質(zhì)膨脹以及卵丘細(xì)胞擴(kuò)散［34］。因此，排卵前（卵泡期）TNFAIP6的高表達(dá)可歸于該基因?qū)β雅萜诼亚鸺?xì)胞擴(kuò)散的調(diào)控作用。排卵后卵巢進(jìn)入紅體期，此時(shí)由于成熟卵泡中富含TNFAIP6的基質(zhì)以及CCs隨卵母細(xì)胞排出卵泡腔［32］，導(dǎo)致TNFAIP6表達(dá)量下降。之后卵巢進(jìn)入黃體期，牛卵巢發(fā)情周期中存在2個(gè)卵泡波，當(dāng)?shù)?個(gè)卵泡波的優(yōu)勢(shì)卵泡進(jìn)行排卵后，卵巢又進(jìn)入第1個(gè)卵泡波，開(kāi)始發(fā)育新的卵泡［35］，同時(shí)內(nèi)層顆粒細(xì)胞也向CCs分化，CCs中的TNFAIP6表達(dá)量也隨之上升，參與到基質(zhì)形成中，所以黃體期TNFAIP6的表達(dá)顯著低于卵泡期而稍高于紅體期。以上結(jié)果表明，TNFAIP6基因參與牦牛卵巢活動(dòng)的調(diào)控，在牦牛繁殖中起著重要的作用。

4 結(jié)論

本試驗(yàn)成功克隆牦牛TNFAIP6基因。該基因編碼區(qū)長(zhǎng)830 bp，在生物進(jìn)化過(guò)程中具有很強(qiáng)的保守性。牦牛TNFAIP6mRNA在各組織中廣泛表達(dá)，其中在卵巢、子宮、脾臟和肌肉組織中表達(dá)較高。牦牛不同發(fā)情期卵巢中TNFAIP6蛋白表達(dá)水平與轉(zhuǎn)錄水平基本一致，且卵泡期表達(dá)量均顯著高于紅體期和黃體期，提示該基因參與了牦牛卵泡的發(fā)育，具體作用機(jī)制有待進(jìn)一步研究。