楊飛蕓 白潔 劉坤 王瑞剛

（1. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)生命科學(xué)學(xué)院 內(nèi)蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，呼和浩特 010011；2. 內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，呼和浩特 010018）

類黃酮（Flavonoids）是廣泛存在于植物中的次級(jí)代謝產(chǎn)物，泛指2個(gè)苯環(huán)通過脂肪族三碳鏈相互聯(lián)結(jié)而成的一系列低分子量酚類化合物［1］。迄今為止，已有10000多個(gè)類黃酮類化合物被分離鑒定［2］。類黃酮分布廣泛，在植物的生長、發(fā)育、開花、結(jié)果及耐鹽、抗旱、抵抗紫外線、抗菌、抗病等方面都起著重要作用［3-4］。類黃酮類物質(zhì)是具有多種生物學(xué)活性的一類植物次級(jí)代謝產(chǎn)物，具有重要的食用和藥用價(jià)值，一直以來都受到國內(nèi)外眾多研究者的高度重視［5-6］。近年來，類黃酮研究領(lǐng)域一直非?；钴S，并取得許多重要進(jìn)展［7］。目前已發(fā)現(xiàn)其在人體內(nèi)可以發(fā)揮抗氧化活性、保護(hù)肝臟活性、抗菌活性、抗炎活性及抗癌活性及抗病毒活性等［8-9］。

類黃酮是在胞漿多酶復(fù)合體的催化下，經(jīng)由苯丙烷代謝途徑合成的［10］。參與類黃酮生物合成途徑的酶主要包括：查爾酮合成酶（Chalcone synthase，CHS）、查爾酮異構(gòu)酶（Chalcone isomerase，CHI）和黃酮醇合成酶（Flavonol synthase，F(xiàn)LS）等［11］。查爾酮異構(gòu)酶（EC 5.5.1.6）是類黃酮合成途徑中的第二個(gè)關(guān)鍵酶，催化分子內(nèi)的環(huán)化反應(yīng)［12］。查爾酮異構(gòu)酶是一個(gè)多基因家族，但由于在進(jìn)化上源自共同的祖先，因此，不同基因的編碼區(qū)同源性很高，其結(jié)構(gòu)和催化機(jī)制也極其相似。但在不同物種中，其基因拷貝數(shù)和時(shí)空表達(dá)模式存在很大差異，并且受到多種因素的誘導(dǎo)［13］。查爾酮異構(gòu)酶是植物體內(nèi)花青素以及其他類黃酮合成的必需酶，通常以單體的形式存在于植物中，由于其蛋白三維折疊結(jié)構(gòu)的特異性，常作為植物特有的標(biāo)記基因［14］。作為類黃酮合成途徑上游的重要酶，查爾酮異構(gòu)酶對(duì)調(diào)控整個(gè)代謝途徑起著重要作用，直接影響下游各種類黃酮化合物，如異黃酮、花青素等的含量。近年來應(yīng)用外源CHI基因轉(zhuǎn)化植物的研究報(bào)道很多，主要集中在改變觀賞植物的花色和提高果蔬、藥用植物中類黃酮的含量等方面［15］。

中間錦雞兒（Caragana intermedia）是豆科錦雞兒屬植物，落葉灌木，具有廣泛的適應(yīng)性和很強(qiáng)的抗逆性，在長期抵御逆境的過程中，形成了一系列適應(yīng)在惡劣環(huán)境下生存的特有機(jī)制［16-17］。中間錦雞兒營養(yǎng)物質(zhì)含量豐富，還含有類黃酮、芪類、苯丙素和萜類等多種次級(jí)代謝產(chǎn)物，是傳統(tǒng)中、蒙藥藥材，其花、根、種子等部位均可入藥［18-19］。但對(duì)其抗逆機(jī)制、類黃酮代謝及其與抗逆性之間的關(guān)系鮮見報(bào)道。

本研究以豆科已知CHI基因的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡并引物，以中間錦雞兒cDNA為模板，克隆CiCHI的cDNA全長，并對(duì)其進(jìn)行了序列分析和系統(tǒng)進(jìn)化分析，通過轉(zhuǎn)基因擬南芥研究CiCHI的功能，為進(jìn)一步揭示中間錦雞兒的抗逆機(jī)制提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

中間錦雞兒種子采自內(nèi)蒙古自治區(qū)呼和浩特市和林格爾縣（111.82°E，40.38°N）。野生型擬南芥Columbia-0生態(tài)型（Col-0）、大腸桿菌DH5α、根癌農(nóng)桿菌GV3101和植物表達(dá)載體質(zhì)粒pCanG-HA由內(nèi)蒙古自治區(qū)植物逆境生理與分子生物學(xué)重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室保存。T載體pMD19-T Vector購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1CiCHI的克隆及分析 采用TRIzol法［20］提取中間錦雞兒和擬南芥總RNA。去除樣品中的DNA后，反轉(zhuǎn)錄合成cDNA第一鏈。

根據(jù)豆科已知CHI基因的保守結(jié)構(gòu)域設(shè)計(jì)簡并引物（表1），以中間錦雞兒cDNA為模板，使用Clontech公司的RACE試劑盒獲得3'-和5'-末端序列。通過分析、比對(duì)、拼接后得到CiCHI的全長序列。PCR引物合成及產(chǎn)物測序由上海生工生物公司完成。

將CiCHI的 ORF（Open reading frame） 序 列在NCBI上進(jìn)行Blast比對(duì)，篩選出與其相似度最高的序列進(jìn)行系統(tǒng)進(jìn)化分析。利用Mega 5.0軟件，采用Neighbour-Joining算法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹［21］。不同物種的CHI基因序列分別從NCBI數(shù)據(jù)庫（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/）、TAIR 數(shù) 據(jù) 庫（http：//www.arabidopsis.org/）和植物基因組數(shù)據(jù)庫（https：//phytozome.jgi.doe.gov/pz/portal.html）中獲得。

1.2.2 中間錦雞兒的處理方法 選取植物培養(yǎng)室（溫度22℃，16 h光照/8 h黑暗）生長一個(gè)月左右、長勢一致的中間錦雞兒幼苗進(jìn)行脅迫處理，檢測CiCHI的表達(dá)量變化。每個(gè)樣品均為3株幼苗地上部分的混合樣品。紫外（UV-C）輻照處理（紫外光強(qiáng)度為120.5 lx，紫外燈照射距離為1 m）、NaCl和脫落酸（Abscisic acid，ABA）脅迫處理（NaCl濃度200 mmol/L，ABA濃度200 μmol/L）的取樣時(shí)間為0、0.5、1、3、6、9、12和24 h。進(jìn)行3次生物學(xué)重復(fù)。提取脅迫處理樣品的總RNA，以CkEF1α（KC679842）作為內(nèi)參基因，利用qRT-PCR在Light Cycler 480實(shí)時(shí)熒光定量PCR儀（Roche公司）上對(duì)CiCHI的表達(dá)量進(jìn)行檢測?；虮磉_(dá)量以2-ΔCT法計(jì)算。

1.2.3 pCanG-CiCHI植物表達(dá)載體的構(gòu)建 獲得CiCHI編碼區(qū)（ORF），并插入克隆載體pEASY-Blunt Simple中（北京全式金生物公司），將測序驗(yàn)證后的序列用In-Fusion酶連入由CaMV35S啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)的植物表達(dá)載體pCanG-HA中，進(jìn)行菌落PCR及雙酶切驗(yàn)證，將驗(yàn)證正確的重組質(zhì)粒電轉(zhuǎn)化農(nóng)桿菌GV3101感受態(tài)細(xì)胞，進(jìn)行菌落PCR鑒定。

表1 引物序列

1.2.4 擬南芥遺傳轉(zhuǎn)化及純合體篩選 采用浸花法將重組植物表達(dá)載體pCanG-CiCHI轉(zhuǎn)入野生型擬南芥（Col-0）［22］，收取成熟的種子種在含有 25 μg/mL卡那霉素的1/2 MS平板培養(yǎng)基上篩選陽性植株。提取T3代轉(zhuǎn)基因植株總RNA，反轉(zhuǎn)錄成cDNA，利用特異引物CiCHI-F-5'和CiCHI-F-3'進(jìn)行PCR鑒定。利用qRT-PCR對(duì)CiCHI在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)量進(jìn)行檢測。反應(yīng)體系為SYBR Premix ExTaq（TaKaRa公司）10 μL、稀釋的cDNA模板5 μL、上、下游引物各 0.8 μL（10 μmol/L）和 DEPC 水 3.4 μL。反應(yīng)程序?yàn)?95℃ 30 s；95℃ 5 s，60℃ 30 s，72℃ 15 s，40個(gè)循環(huán)。AtEF1α（AT5G60390）作為內(nèi)參基因，基因表達(dá)量以2-ΔCT法計(jì)算，選取4株表達(dá)水平較高的不同轉(zhuǎn)化株系進(jìn)行后續(xù)表型試驗(yàn)。

1.2.5 轉(zhuǎn)基因擬南芥總黃酮含量檢測 剪取正常生長條件下（22℃，16 h光照/8 h黑暗）40日齡的擬南芥植株地上部分，每個(gè)株系取3株植物，用液氮研磨成粉末。采用硝酸鋁比色法進(jìn)行總黃酮含量的測定［23］，3次生物學(xué)重復(fù)。

2 結(jié)果

2.1 CiCHI的克隆與序列分析

據(jù)豆科已知CHI基因的保守序列設(shè)計(jì)簡并引物，擴(kuò)增得到509 bp的單一條帶（圖1-A），經(jīng)測序后比對(duì)，發(fā)現(xiàn)該片段與蒺藜苜蓿CHI基因相似度最高（84%）。利用RACE技術(shù)克隆其缺失的cDNA序列，分別得到248 bp的5'-端和473 bp的3'-端cDNA序列（圖1-B）。

圖1 CiCHI的克隆

經(jīng)測序分析正確后，利用Vector NTI 10將克隆到的序列片段進(jìn)行拼接，得到CiCHI的cDNA全長序列。以中間錦雞兒cDNA為模板，使用特異引物擴(kuò)增其cDNA序列（圖1-C），連接克隆載體驗(yàn)證后，確定拼接結(jié)果正確。得到CiCHI的cDNA全長為1005 bp， 其 中 ORF為 678 bp，5'-UTR 為 110 bp，3'-UTR為217 bp，編碼225個(gè)氨基酸。

2.2 CiCHI蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

為進(jìn)一步了解CiCHI與其他物種該類基因之間的進(jìn)化關(guān)系，將CiCHI蛋白序列與其他已知物種中相似度最高的CHI蛋白序列進(jìn)行比對(duì)，并構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹（圖2）。結(jié)果表明，CiCHI與蒺藜苜蓿的CHI最為相似，二者與其他豆科植物的CHI構(gòu)成一個(gè)大分支；而同為蕓香科的蜜桔、柚子和甜橙構(gòu)成一個(gè)分支。說明CiCHI與豆科植物的CHI功能最相近。進(jìn)化樹中使用的序列都是NCBI中注釋為Chalcone isomerase（CHI）的基因，即查爾酮異構(gòu)酶基因家族的成員，因此可以確定CiCHI為該基因家族的成員。

圖2 CiCHI與其他物種來源的CHI構(gòu)建的系統(tǒng)進(jìn)化樹

2.3 CiCHI脅迫處理下的表達(dá)分析

查爾酮異構(gòu)酶催化類黃酮的生成，起到抵抗氧化脅迫的作用。通過檢測CiCHI在紫外、NaCl和ABA等脅迫處理下的表達(dá)模式（圖3）發(fā)現(xiàn)紫外照射處理下，CiCHI表達(dá)量呈先升高后降低的趨勢，在6 h時(shí)表達(dá)量最高（圖3-A）。NaCl處理下，CiCHI表達(dá)量同樣先升高后降低，在1 h時(shí)表達(dá)量最高（圖3-B）。ABA處理下，CiCHI的表達(dá)受到抑制，在1 h表達(dá)量最低（圖3-C）。

2.4 CiCHI的組織特異性分析

通過對(duì)30日齡中間錦雞兒根、莖、葉中CiCHI進(jìn)行qRT-PCR分析（圖4）發(fā)現(xiàn)，CiCHI在所有被檢測的組織中都有不同程度的表達(dá)。在室內(nèi)種植的葉中表達(dá)量最高，莖中相對(duì)較高，根中最少。在野外采摘的花中表達(dá)量高，種子中表達(dá)量低。

2.5 pCanG-CiCHI植物表達(dá)載體的構(gòu)建及轉(zhuǎn)基因純合體植株的鑒定

對(duì)重組質(zhì)粒進(jìn)行雙酶切鑒定，可以獲得目的片段，表明載體構(gòu)建成功。

通過農(nóng)桿菌介導(dǎo)的浸花法獲得具有卡那霉素抗性的來自不同轉(zhuǎn)化的陽性植株10株，提取這些株系的總RNA并合成cDNA，利用qRT-PCR檢測CiCHI在轉(zhuǎn)基因株系中的表達(dá)水平（圖5），選取表達(dá)量較高的4個(gè)株系OE-13、OE-32、OE-37和OE-46進(jìn)行后續(xù)表型檢測試驗(yàn)。

2.6 轉(zhuǎn)基因擬南芥總黃酮含量的變化

按照硝酸鋁比色法的具體步驟繪制蘆丁標(biāo)準(zhǔn)曲線（圖6-A）。蘆丁質(zhì)量濃度X和吸光值Y的關(guān)系為：Y=1.081X-0.004，R2=0.999，表明在蘆丁濃度0-0.96 mg/mL中，該標(biāo)準(zhǔn)曲線線性良好。按此方法進(jìn)行轉(zhuǎn)基因擬南芥總黃酮含量的測定（圖6-B）。結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因各株系總黃酮的含量均高于野生型，且達(dá)到顯著水平。說明過表達(dá)CiCHI可以使擬南芥中總黃酮含量明顯增加。

3 討論

類黃酮是錦雞兒中迄今為止被發(fā)現(xiàn)的最重要的活性成分，在植物-環(huán)境相互作用中發(fā)揮著極其重要的功能。類黃酮在植物體內(nèi)的生物合成幾乎完全是由氧化脅迫引起的，是植物組織在不同脅迫下的抗氧化防御系統(tǒng)。它們可以吸收最具能量的太陽光（UV），抑制活性氧的產(chǎn)生，一旦活性氧過量形成可以將其及時(shí)清除；類黃酮可以調(diào)節(jié)生長素的運(yùn)輸和代謝作用，對(duì)植物在脅迫誘導(dǎo)下形態(tài)的發(fā)生具有重要價(jià)值［24］。本研究檢測了轉(zhuǎn)基因擬南芥中總黃酮的含量，由于CiCHI的大量表達(dá)，4個(gè)轉(zhuǎn)基因株系的總黃酮含量均顯著高于野生型，說明CiCHI參與了擬南芥的類黃酮代謝，為研究植物類黃酮代謝提供了新的基因源。

圖3 不同脅迫處理下CiCHI的表達(dá)分析

圖4 CiCHI的組織特異性表達(dá)分析

圖5 轉(zhuǎn)基因株系CiCHI表達(dá)水平檢測

圖6 野生型和轉(zhuǎn)基因擬南芥總黃酮含量比較

查爾酮異構(gòu)酶是類黃酮生物合成途徑的第二個(gè)限速酶，是植物體內(nèi)類黃酮合成的必需酶，對(duì)調(diào)控整個(gè)代謝途徑起著重要作用，可使反應(yīng)速率提高107倍，直接影響下游各種類黃酮化合物的生成［13］。系統(tǒng)進(jìn)化分析顯示，CHI在整個(gè)進(jìn)化過程中相對(duì)保守，序列相似性達(dá)51%-94%［14］。經(jīng)過比對(duì)分析發(fā)現(xiàn)本研究獲得的CiCHI與蒺藜苜蓿的CHI基因相似度最高，達(dá)84%，可以確定其為查爾酮異構(gòu)酶。

查爾酮異構(gòu)酶基因家族不同成員的表達(dá)具有明顯的組織特異性［13］。本研究檢測了CiCHI在不同部位的表達(dá)量發(fā)現(xiàn)，其表達(dá)量存在很大差異。結(jié)果顯示CiCHI在室內(nèi)種植的葉中表達(dá)量最高；莖中相對(duì)較高；根中最少。在野外采摘的花中表達(dá)量高，種子中表達(dá)量低，與已報(bào)道的研究結(jié)果一致［25-26］。由于根、莖、葉采自室內(nèi)幼苗，花和種子采自野外自然生長的植物。因此，其生長條件、生長時(shí)間等各方面因素均不相同，使其表達(dá)量無法比較。

查爾酮異構(gòu)酶家族基因受不同脅迫處理誘導(dǎo)，如UV、干旱、損傷和NaCl等，從而引起類黃酮含量的增加，使其抗氧化等抵御逆境的能力提高［15，27］。本研究發(fā)現(xiàn)中間錦雞兒CiCHI受到紫外、NaCl和ABA等處理的誘導(dǎo)，不同處理方式下該基因的表達(dá)模式不同。在受到紫外和NaCl脅迫時(shí)表達(dá)模式基本一致，開始受到脅迫影響時(shí)，表達(dá)量升高，生成大量類黃酮以幫助機(jī)體抵抗氧化脅迫的影響。但隨著脅迫壓力的增加，其表達(dá)量開始降低，可能其產(chǎn)物水平已經(jīng)達(dá)到一定量并不再大量增加，此時(shí)機(jī)體也可能已經(jīng)啟動(dòng)了其他的脅迫響應(yīng)機(jī)制。ABA處理使CiCHI的表達(dá)受到抑制。

4 結(jié)論

克隆得到中間錦雞兒CiCHI，其開放閱讀框678 bp，編碼225個(gè)氨基酸。CiCHI受到紫外、NaCl、ABA等脅迫誘導(dǎo)。在葉中表達(dá)量最高，莖中相對(duì)較高，根中最少；花中表達(dá)量高，種子中低。擬南芥中超表達(dá)CiCHI可使其總黃酮含量增加。