謝海娟 范希德 葉廣繼，2 周云，2 王艦，2 楊永智，2

（1. 青海大學(xué)，西寧 810016；2. 青海省農(nóng)林科學(xué)院青海大學(xué)省部共建三江源生態(tài)與高原農(nóng)牧業(yè)國家重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青藏高原生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 青海省馬鈴薯育種重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，西寧 810016）

馬鈴薯（Solanum tuberosum）是繼小麥、水稻、玉米之后全球第四大糧食作物，深受人們喜愛［1］。隨著經(jīng)濟(jì)發(fā)展，逐步機(jī)械化是收獲馬鈴薯的發(fā)展方向，但在馬鈴薯收獲、裝運(yùn)和貯藏等一系列過程中造成薯塊不同程度的機(jī)械損傷，使薯塊的腐爛速度加快，為貯藏帶來不便。因此，增加薯塊的機(jī)械強(qiáng)度及其受損后的愈合能力顯得尤為重要［2］。

4-香豆素輔酶A連接酶（4CL）是苯丙氨酸類化合物合成中不可缺少的酶，它能夠活化香豆酸及其衍生物生成相應(yīng)的硫代酯，這些酯類化合物是合成黃酮類化合物、異黃酮類化合物、木質(zhì)素類化合物、花青素類化合物、香豆素化合物、二苯乙烯類化合物的中間體［3-5］。其中，木質(zhì)素是植物組織的重要結(jié)構(gòu)成分，它賦予植物機(jī)械強(qiáng)度，并保護(hù)植物免受各種致病菌的侵害［6］。

目前，4CL已在許多植物中被克隆，存在于一個(gè)小的基因家族中，有2-5名成員［7］。擬南芥中4CL有4個(gè)成員，均在苯丙氨酸代謝途徑中具有重疊而獨(dú)特的作用，其中，At4CL1和At4CL2是植物正常生長所必需的［8］。4CL在水稻中有5個(gè)成員，其中Os4CL2在花藥中特異表達(dá)并在紫外光照射下被強(qiáng)烈激活，可能參與黃酮類化合物的形成［9］。楊樹中的Pt4CL1主要參與木質(zhì)部組織中木質(zhì)素的生物合成，而Pt4CL2與其他類苯丙烷的形成有關(guān)［10］。木質(zhì)素含量與植物莖稈的抗倒伏有關(guān)，過表達(dá)Mu4CL15的香蕉中木質(zhì)素含量高于野生型，并且轉(zhuǎn)基因植株莖桿的物理強(qiáng)度顯著增強(qiáng)［11］。

目前，馬鈴薯4CL的研究主要集中在苯丙氨酸類化合物合成方面，尚不清楚苯丙氨酸類化合物在馬鈴薯抗晚疫病中的作用，對馬鈴薯St4CL開展深入研究，有助于我們進(jìn)一步了解其作用機(jī)理。本研究采用同源克隆方法，以青海省主栽品種青薯9號(hào)為材料，克隆St4CL，進(jìn)行生物信息學(xué)分析，通過熒光定量分析St4CL在馬鈴薯青薯9號(hào)不同組織和不同品種中的表達(dá)情況，以期為St4CL的功能驗(yàn)證奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

馬鈴薯品種L1192-4、青薯2號(hào)、青薯9號(hào)、青薯10號(hào)、青薯11號(hào)、下寨65、隴薯6號(hào)、隴薯7號(hào)均由青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所提供，其特性見表1。

RNA prep Pure多糖多酚植物總RNA提取試劑盒、反轉(zhuǎn)錄試劑盒、克隆載體PLB以及DNA凝膠回收試劑盒等購自天根公司；大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α、高保真聚合酶以及熒光定量檢測試劑盒等購自TaKaRa公司。

1.2 方法

1.2.1St4CL的克隆 提取馬鈴薯青薯9號(hào)塊莖總RNA，并進(jìn)行反轉(zhuǎn)錄。以青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所轉(zhuǎn)錄組數(shù)據(jù)中差異基因4CL序列為參考，設(shè)計(jì)引物St4CL-F和St4CL-R（表2），進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR 反應(yīng)體系為 2×FastTaq PCR Master Mix 10 μL、引物 各 0.5 μL、cDNA 2 μL 和 ddH2O 7 μL。PCR 擴(kuò)增程序?yàn)?95℃ 3 min ；95℃ 20 s，71℃ 20 s，72℃1min，共35個(gè)循環(huán)；72℃ 5 min；4℃保存。PCR產(chǎn)物經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，回收目的條帶，與PLB載體重組，轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞DH5α中，涂板于含有氨芐（Amp）的LB培養(yǎng)基上，37℃過夜。挑取單克隆篩選陽性，送上海生工公司測序。

表1 馬鈴薯品種特性

1.2.2St4CL的生物信息學(xué)分析 采用DNAMAN軟件拼接St4CL測序序列，利用ExPAsy-ProtParam（http：//web.expasy.org/protparam）和 SOPMA（https：//npsa_sopma.html）等在線工具對蛋白質(zhì)的理化性質(zhì)和二級(jí)結(jié)構(gòu)進(jìn)行預(yù)測。采用Psort prediction（http：//psort1.hgc.jp/form.html）和 PlantCARE（http：//bioinformatics.psb.ugent.be/webtools/plantcare/html/）在線工具預(yù)測亞細(xì)胞定位和分析啟動(dòng)子。采用NCBI數(shù)據(jù)庫以及DNA MAN軟件分析氨基酸序列，利用MEGA6.0軟件采用鄰近法構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹。

1.2.3 青薯9號(hào)不同組織中St4CL的表達(dá) 待青薯9號(hào)長出塊莖后，分別取其根、莖、葉、花、匍匐莖、塊莖，提取RNA并進(jìn)行熒光定量分析，3個(gè)重復(fù)，將反轉(zhuǎn)錄cDNA濃度稀釋至200 ng/μL。熒光反應(yīng)體系為 10 μL TB Green Premix Ex Taq Ⅱ、0.4 μL qPCR4CL-F、0.4 μL qPCR4CL-R、2 μL cDNA 和 7.2μL ddH2O。反應(yīng)程序?yàn)閮刹椒ǎ?5℃ 30 s；95℃ 10 s，60℃ 32 s，共40個(gè)循環(huán)。每個(gè)組織反應(yīng)重復(fù)3次，采用2-ΔΔCT法進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

1.2.4 不同馬鈴薯品種中St4CL的表達(dá)分析 分別將L1192-4（紫色）、青薯2號(hào)、青薯9號(hào)、青薯10號(hào)、青薯11號(hào)、下寨65、隴薯6號(hào)、隴薯7號(hào)種于花盆中，各3盆，待其出苗1個(gè)月，取其嫩葉，參照1.2.3進(jìn)行熒光定量PCR分析。

表2 試驗(yàn)所用引物名稱和序列

2 結(jié)果

2.1 青薯9號(hào)中St4CL的克隆

以馬鈴薯青薯9號(hào)塊莖的cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，經(jīng)2%瓊脂糖凝膠電泳檢測后，獲得一條大小為1800 bp左右的條帶（圖1），與預(yù)期大小一致。經(jīng)測序發(fā)現(xiàn)，St4CL的CDS長度為1710 bp，編碼569個(gè)氨基酸。

2.2 St4CL的生物信息學(xué)分析

2.2.1 St4CL蛋白的理化性質(zhì)St4CL的CDS長度為1710 bp，編碼569個(gè)氨基酸，其蛋白分子質(zhì)量約為61.83 kD，等電點(diǎn)為5.53，分子式為C2782H4430N726O825S18，其中含量最高為丙氨酸（Ala），占8.6%，含量最低為色氨酸（Trp），占0.2%，不含吡咯賴氨酸（Pyl）和硒半胱氨酸（Sec）。該蛋白的平均疏水性（GEAVY）為0.068，蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為34.68，屬于穩(wěn)定的疏水性蛋白。

圖1 馬鈴薯St4CL的檢測

2.2.2 St4CL蛋白的亞細(xì)胞定位與二級(jí)結(jié)構(gòu)分析 亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果顯示，該蛋白定位在葉綠體的類囊體膜上。St4CL蛋白的二級(jí)結(jié)構(gòu)主要由4種構(gòu)象組成，分別為無規(guī)則卷曲（Cc）、α-螺旋（Hh）、延伸連（Ee）、β-折疊（Tt），其中，無規(guī)則卷曲占比例最高為43.76%，含有249個(gè)氨基酸，β-折疊占比例最低為7.56%，含有43個(gè)氨基酸。

2.2.3St4CL的啟動(dòng)子順式作用元件的分析 使用Plant Care對St4CL基因起始密碼子上游1500 bp處的啟動(dòng)子序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)（表3），除了包含轉(zhuǎn)錄相關(guān)的基本元件之外，還含有多種與逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，如脫落酸響應(yīng)元件、厭氧誘導(dǎo)元件、赤霉素響應(yīng)元件以及與干旱和黃酮類生物合成相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)。

2.2.4 St4CL蛋白的序列比對以及系統(tǒng)進(jìn)化樹的構(gòu)建 使用DNAMAN軟件對St4CL、番茄、甜辣椒以及煙草的4CL蛋白進(jìn)行比對（圖2），發(fā)現(xiàn)St4CL蛋白與番茄（NP_001333794.1）、甜辣椒（XP_016564135.1）、 煙 草（XP_019244483.1） 的4CL蛋白相似性分別達(dá)到97%、93%和90.67%，并具有2個(gè)高度保守基序BoxⅠ（SSGTTGLPKGV）和BoxⅡ（GEICIRG）。使用MEGA6.0采用鄰近法對St4CL蛋白及其他不同植物中的同源序列構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育樹（圖3），結(jié)果表明，St4CL蛋白和番茄、甜辣椒、煙草聚在一個(gè)分支，其中馬鈴薯與番茄的親緣關(guān)系最近，與棉花、柑橘的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。

表3 St4CL的啟動(dòng)子順式作用元件的分析

2.3 St4CL基因的RNA-seq數(shù)據(jù)分析

經(jīng)分析青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所RNA-seq數(shù)據(jù)（圖4）發(fā)現(xiàn)，當(dāng)青薯9號(hào)受到晚疫病侵染時(shí)，St4CL的表達(dá)呈下降-上升-下降的趨勢，但整體呈下降趨勢，說明該基因可能響應(yīng)晚疫病菌的脅迫。

2.4 青薯9號(hào)不同組織中St4CL的表達(dá)

通過對青薯9號(hào)不同組織中St4CL的表達(dá)進(jìn)行qRT-PCR分析（圖5）發(fā)現(xiàn)，該基因在青薯9號(hào)各組織中均有不同程度的表達(dá)，具有明顯的組織特異性，其中，葉片中的表達(dá)量最高，花次之，而根中的表達(dá)量最低。

2.5 不同馬鈴薯品種中St4CL的表達(dá)

為進(jìn)一步了解St4CL在不同馬鈴薯品種中的表達(dá)情況，對其進(jìn)行qRT-PCR分析（圖6），發(fā)現(xiàn)St4CL在青薯10號(hào)中表達(dá)量最高，L1192-4次之，青薯2號(hào)與下寨65表達(dá)量最低。

3 討論

4CL是苯丙烷類代謝途徑中的關(guān)鍵酶，廣泛存在于各種植物中，主要是與調(diào)控木質(zhì)素的合成有關(guān)［12］。本研究采用同源克隆方法獲得了馬鈴薯青薯9號(hào)4CL同源基因的CDS序列，命名為St4CL，其CDS長度為1710 bp，編碼569個(gè)氨基酸。利用生物信息學(xué)對所獲得的St4CL氨基酸序列進(jìn)行分析發(fā)現(xiàn)，該蛋白的平均疏水性（GEAVY）為0.068，蛋白不穩(wěn)定指數(shù)為34.68，屬于穩(wěn)定的疏水性蛋白。亞細(xì)胞定位表明，該蛋白位于葉綠體的類囊體膜上，但可信度為80.7%，后續(xù)需要進(jìn)一步進(jìn)行驗(yàn)證。多序列比對發(fā)現(xiàn)，該蛋白含有植物中4CL蛋白所共有的2個(gè)肽基序BoxⅠ和BoxⅡ，其中BoxⅠ是4CL催化反應(yīng)中能夠與AMP結(jié)合的功能域，而BoxⅡ中心的Cys殘基被認(rèn)為直接參與催化反應(yīng)［13］。系統(tǒng)進(jìn)化分析表明，St4CL蛋白與番茄、甜辣椒、煙草等茄科植物的親緣關(guān)系較近，與柑橘、棉花、毛白楊等非茄科的親緣關(guān)系較遠(yuǎn)。Alberstein等［14］發(fā)現(xiàn)，番茄中的4CL蛋白與木質(zhì)素合成有關(guān)，當(dāng)其與查爾酮合成酶結(jié)合時(shí)能夠生成柚皮素。4CL在被炭疽病菌侵染的未成熟甜辣椒果實(shí)中的表達(dá)上調(diào)，從而來誘導(dǎo)果實(shí)中咖啡基-5-羥色胺的合成［15］。茉莉酸甲酯和創(chuàng)傷能夠誘導(dǎo)煙草中Nt4CL表達(dá)，從而調(diào)節(jié)植株發(fā)育過程［16］。不同發(fā)育階段中棉花的Gh4CL1表達(dá)量不同，在開花后15 d和20 d的表達(dá)量較高，說明該基因調(diào)控棉花纖維細(xì)胞伸長［17］。啟動(dòng)子分析表明，St4CL啟動(dòng)子區(qū)域含有多種與逆境響應(yīng)相關(guān)的順式作用元件，如脫落酸響應(yīng)元件、赤霉素響應(yīng)元件以及與干旱和黃酮類生物合成相關(guān)的MYB結(jié)合位點(diǎn)，說明該啟動(dòng)子元件具有多樣性，可以為進(jìn)一步研究St4CL的表達(dá)特點(diǎn)提供基礎(chǔ)。李萌等［18］研究白樺4CL啟動(dòng)子的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，經(jīng)過瞬時(shí)侵染的白樺莖段被染成藍(lán)色，說明其可能參與白樺木質(zhì)部的發(fā)育。

圖2 4CL氨基酸多重序列比對

圖3 St4CL與相關(guān)植物4CL同源蛋白的系統(tǒng)進(jìn)化分析

圖4 St4CL的RNA-seq數(shù)據(jù)分析

圖5 St4CL在青薯9號(hào)不同組織中的表達(dá)

圖6 St4CL在不同品種中的表達(dá)

眾多研究表明，4CL表達(dá)具有組織特異性，如柑橘中的Cit4CL1在幼果中的表達(dá)最高，根中最低，Cit4CL2在幼莖中表達(dá)最高，根中最低，而Cit4CL3卻在根中表達(dá)最高，幼莖與幼果中最低［19］，桂花中的4CL在花瓣中的表達(dá)量最高，并且不同花期該基因的表達(dá)量不同，導(dǎo)致花青素含量也不同［20］，維管束植物卷柏中的Sm4CL1和Sm4CL2均在根中的表達(dá)最高，其中Sm4CL2參與對羥基苯基和愈瘡木脂素亞基的生物合成［21］。陳夏曄等［22］研究發(fā)現(xiàn)，Nt4CL在煙草葉片中高表達(dá)，而研究煙草葉片中高表達(dá)基因?qū)档蜔熑~木質(zhì)素含量和煙草危害性具有重要意義。賈彩虹等［23］研究表明，將反義4CL基因轉(zhuǎn)入毛白楊中并測定木質(zhì)素含量，轉(zhuǎn)基因株系的木質(zhì)素含量低于對照41.37%。將刺槐GRP1.8啟動(dòng)子與從毛白楊中克隆的反義4CL連接構(gòu)建融合基因并轉(zhuǎn)入煙草發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草中木質(zhì)素的含量較野生型平均降低了13.7%［24］。為確定St4CL在青薯9號(hào)中的組織表達(dá)特性，本研究采用實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)檢測其在各組織中的表達(dá)情況。結(jié)果顯示St4CL在葉片和紫花中的表達(dá)量最高，在根中的表達(dá)較低，且系統(tǒng)進(jìn)化樹分析表明St4CL與煙草4CL親緣關(guān)系較近，推測該基因不僅花青素的合成有關(guān)，可能還與木質(zhì)素的合成有關(guān)。

晚疫病是導(dǎo)致馬鈴薯產(chǎn)量下降的重要原因之一，該病是由致病疫霉菌侵染引起，F(xiàn)ritzemeier等［25］發(fā)現(xiàn)，用致病疫霉菌Pi1和Pi4分別侵染含有抗晚疫病Pi1的馬鈴薯葉片發(fā)現(xiàn)，兩組葉片中4CL表達(dá)量急劇增加后又急劇下降，但受Pi1感染的葉片中4CL表達(dá)量急劇下降后又開始增加，而受Pi4感染的葉片中4CL表達(dá)下降后趨于穩(wěn)定。通過對青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所前期RNA-Seq數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)，4CL為晚疫病差異基因，當(dāng)其受到晚疫病脅迫后，該基因的表達(dá)先下降后上升再下降，這可能是由于本實(shí)驗(yàn)選擇的材料本身對晚疫病具有一定的抗病性。通過實(shí)時(shí)熒光定量PCR技術(shù)對St4CL在不同馬鈴薯品種中的表達(dá)量進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，該基因在L1192-4中表達(dá)較高，由于L1192-4品種馬鈴薯為紫色，該基因與花青素合成相關(guān)而使其表達(dá)量升高。張蕾等［26］采用RNAi技術(shù)將草莓果實(shí)中Fa4CL沉默后對果實(shí)中的花色素苷進(jìn)行測定發(fā)現(xiàn)，花色素苷含量明顯降低。St4CL在高抗晚疫病品種青薯10號(hào)中表達(dá)最高，在感病品種下寨65中的表達(dá)量最低，從尹軍良［27］與青海省農(nóng)林科學(xué)院生物技術(shù)研究所晚疫病抗性試驗(yàn)結(jié)果中發(fā)現(xiàn)，馬鈴薯晚疫病田間抗性青薯10號(hào)＞隴薯7號(hào)＞青薯9號(hào)＞隴薯6號(hào)＞青薯11號(hào)＞青薯2號(hào)＞下寨65。而且4CL參與香豆素合成途徑，與其他苯丙烷類代謝物質(zhì)一樣，具有許多生物學(xué)功能，能夠抵御多種病原菌對植物的侵害，增強(qiáng)植物抗病性，棉花中Gh4CL參與了棉花對鏈格孢菌的抗性反應(yīng)［28］。推測4CL不僅與苯丙氨酸類化合物合成相關(guān)而且與晚疫病菌的抗性相關(guān)。目前在茄科植物中關(guān)于4CL的研究主要在煙草上，對馬鈴薯中4CL相關(guān)報(bào)道較少，克隆St4CL可以進(jìn)一步為研究馬鈴薯中苯丙烷代謝與晚疫病抗性研究等過程提供幫助。目前，已構(gòu)建St4CL的表達(dá)載體，為明確St4CL在馬鈴薯中的功能和作用機(jī)制提供基礎(chǔ)。

4 結(jié)論

成功克隆了馬鈴薯St4CL的CDS區(qū)，St4CL是穩(wěn)定的疏水性蛋白，主要分布在葉綠體的類囊體膜上，啟動(dòng)子中含有許多逆境響應(yīng)元件。推測St4CL不僅參與木質(zhì)素和花青素合成，還可能參與馬鈴薯抗晚疫病。