鄒云蓮 胡 邊 張李琛 張進萍 朱學鍇 黃行許 嚴新民

(昆明理工大學醫(yī)學院，昆明650500)

細胞因子是調(diào)控機體免疫反應的重要因子。以細胞因子為基礎的腫瘤治療一直是人們關注的焦點。IL-12，由于其在誘導機體抗腫瘤免疫方面發(fā)揮的重要作用，成為科研工作者臨床轉(zhuǎn)化研究的重點研究對象[1,2]。

IL-12是由樹突狀細胞、巨噬細胞、中性粒細胞以及人類B淋巴母細胞等細胞受相應抗原刺激后產(chǎn)生，是刺激T細胞生長，促進CD8細胞記憶性，誘導CD4輔助細胞向Th1細胞轉(zhuǎn)化的重要介質(zhì)，這是其發(fā)揮抗腫瘤機制的重要基礎。此外，IL-12可通過誘導γ干擾素和腫瘤壞死因子-α的產(chǎn)生，降低IL-4對IFN-γ的抑制，負性調(diào)節(jié)IL-10,轉(zhuǎn)化生長因子β1，從而促進免疫細胞腫瘤浸潤，改善免疫抑制微環(huán)境[3,4]。然而，大量臨床所研究顯示大劑量IL-12蛋白的直接輸注給機體帶來的毒副作用嚴重限制其在臨床的應用。因此，如何安全有效地向機體導入IL-12使其揚長避短發(fā)揮抗腫瘤效應是使IL-12走向臨床所面臨的迫切問題[5,6]。本研究利用基因工程手段體外構(gòu)建人IL-12載體，通過非病毒轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將其導入T細胞中獲得穩(wěn)定表達，初步探討該方法的可行性。

1 材料與方法

1.1材料 實驗用的PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)由上?？萍即髮W生命科學與技術(shù)學院朱學鍇博士提供；人IL-12 cDNA免費索取于廈門大學韓家淮實驗室；高保真PCR擴增酶及T4 DNA連接酶均購自TaKaRa公司；內(nèi)切酶SpeⅠ和SalⅠ購自NBE公司；膠回收試劑盒及無內(nèi)毒素質(zhì)粒大抽試劑盒購自北京天根生物技術(shù)公司；分離PBMC所用的全血來自云南省第一人民醫(yī)院；淋巴細胞分離液購自北京索萊寶科技有限公司；IL-12 ELISA試劑盒,流式檢測用抗體CD3-FITC、CD4-PE、CD8-APC及同型對照購自Ebioscience公司；電轉(zhuǎn)試劑Amaxa Human T cells Nucleofector Kit 試劑盒購自lonza公司；細胞因子IL-2，單抗CD3、CD28均購自北京同立海源生物有限公司；過表達luciferin的神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251-Luc由上?？萍即髮W黃行許教授惠贈。

1.2方法

1.2.1IL-12過表達載體的構(gòu)建 人IL-12是由重鏈p40和輕鏈p35構(gòu)成的雙鏈結(jié)構(gòu)，兩條鏈通過二硫鍵共價連接形成功能蛋白發(fā)揮生理作用。為了構(gòu)建具有生理功能性IL-12，我們按照圖1的設計思路進行載體構(gòu)建。首先，從廈門大學韓家淮實驗室免費索取人IL-12基因克隆,利用高保真擴增酶通過表1引物擴增出p35和p40基因片段。在引物的設計過程中，考慮到載體多克隆位點，在引物兩端引入相應的酶切位點。同時，為了構(gòu)建具有功能的IL-12融合蛋白，我們選用目前最為常用的Huston設計的(GlySer)3作為p40與p35基因間的Linker。因此在引物設計時，我們在p40下游引物3′端加入Linker部分N端序列，在p35上游引物的5′端引入Linker的C端序列，并保證兩條引物的Linker有15個堿基的重疊，使后續(xù)PCR擴增中形成p40與p35連接的穩(wěn)定接頭。

圖1 IL-12過表達載體的設計Fig.1 Vector design carrying human IL-12 gene

1.2.2IL-12與PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)連接的克隆形成 我們將IL-12基因片段與PiggyBac表達載體同時用SpeⅠ和SalⅠ酶37℃水浴中雙酶切，回收載體片段和IL-12酶切片段，T4 DNA連接酶16℃連接過夜后取2 μl連接產(chǎn)物進行轉(zhuǎn)化，涂Amp+抗性LB平板，37℃恒溫箱中過夜生長。

1.2.3IL-12陽性克隆的鑒定 次日挑取生長的克隆于20 μl滅菌ddH2O充分振蕩混勻，取1 μl菌液用表1的IL-12B-FWD1和IL-12A-REV引物進行擴增，電泳檢測擴增結(jié)果。隨意挑取2個陽性擴增的克隆搖菌過夜，小提質(zhì)粒后測序進一步驗證。

1.2.4人外周血PBMC的分離 人的原代T細胞從新鮮全血中分離得到。全血來自云南省第一人民醫(yī)院的健康獻血者。使用淋巴細胞分離液從新鮮的全血或白膜中分離得到外周血單個核細胞(Peripheral blood mononuclear cells，PBMCs)。新鮮分離的PBMC用無血清RPMI1640培養(yǎng)液(Gibco)按1×107ml-1細胞密度重懸接種于6孔板后于37℃細胞培養(yǎng)箱中貼板2 h。取出6孔板，輕吹細胞，收取未貼壁細胞(未貼壁的細胞是淋巴細胞，包含B和T細胞；貼壁的細胞有單核細胞、巨噬細胞和樹突狀細胞等)于離心管中以800 r/min離心5 min，棄培養(yǎng)液，無血清RPMI1640培養(yǎng)基重懸細胞后計數(shù)，用于后續(xù)電轉(zhuǎn)。

1.2.5PBMC的電轉(zhuǎn)及T細胞的體外擴增 配制電轉(zhuǎn)體系，分別為:①對照組：PiggyBac空載體和轉(zhuǎn)座子酶載體(兩者的量分別為10 μg 和5 μg)；②IL-12過表達組： PB-IL-12過表達載體和轉(zhuǎn)座子酶載體(兩者的量分別為10 μg和5 μg)，兩個電轉(zhuǎn)體系中都加入0.5 μg pEGFP-N2質(zhì)粒作為電轉(zhuǎn)效率初步判斷指標。具體步驟為：按maxa Human T cells Nucl-eofector Kit 試劑盒要求配制電轉(zhuǎn)液并與(1.5～2)×107淋巴細胞充分混勻，在混合液中加入對應質(zhì)粒，充分混合后輕柔加入電極杯，避免氣泡產(chǎn)生，使用Lonza Nucleo-fector 2B電轉(zhuǎn)儀U-014程序電轉(zhuǎn)。電轉(zhuǎn)12 h后流式檢測轉(zhuǎn)染效率。收集細胞，離心并計數(shù)，以1×106ml-1細胞密度培養(yǎng)，培養(yǎng)液中加入100 U/ml 的IL-2，CD3和CD28單抗各200 ng/ml刺激細胞生長3 d改用300 U/ml的IL-2維持培養(yǎng)至14 d。

表1 IL-12載體構(gòu)建中的引物序列

Tab.1 Primers used for construction of IL-12OE plasmid

PrimerSequence(5′-3′)Target siteIL-12B-FWD1CGGACTAGTATGTGTCACCAGCAGTTGGTCAT p40 Forward IL-12B-REVCGCCACCGCCGCTTCCTCCGCCTCCGCTTCCGCCTCCGCCCCTGCAGGGCACAGATGCCp40 ReverseIL-12A-FWD1GAAGCGGCGGTGGCGGCAGCAGAAACCTCCCCGTGGCCp35 ForwardIL-12A-REVGCGGTCGACTTAGGAAGCATTCAGATAGCTCATCp35 ReverseIL12-SEQ1GCTCTCCACGCTTTGCCTGACIL-12seq primerIL12-SEQ2GATGCCGTTCACAAGCTCAAGTATIL-12seq primerIL12-SEQ3CAAAGGCATTAAAGCAGCGTATCCIL-12seq primer

1.2.6IL-12在T細胞中的表達檢測 收集體外培養(yǎng)14 d的T細胞上清，用ELISA檢測上清中IL-12的表達水平。此外，為了探討IL-12過表達的T細胞在遇到腫瘤細胞時是否有更高水平的表達，我們以1×105個/孔U251-luc鋪96孔板，設置3個復孔，次日每孔加入2×105IL-12過表達及對照T細胞于CO2培養(yǎng)箱共孵育24 h后取上清行ELISA檢測IL-12水平。

1.2.7T細胞表型分析 流式檢測IL-12過表達及對照組T細胞的表型。具體方法為：在流式管中加入5×105個T細胞，用含1%FBS的PBS進行清洗一遍，100 μl PBS重懸細胞，分別加入3 μl抗體4℃孵育15 min，取出細胞，PBS清洗兩遍后加入400 μl PBS流式檢測。

1.2.8T細胞殺傷能力檢測 將2×105腫瘤細胞U251-luc鋪于96孔板，次日按1∶1、4∶1、16∶1的效靶比加入T細胞，T細胞的體積為100 μl，每個效靶比設置3個復孔。4 h后，吸出所有液體及細胞，以800 r/min離心5 min后，棄所有上清。以100 μl PBS重懸細胞后移入不透明的96孔板中，再加入100 μl 1 mg/ml的D-luciferin。立即使用酶標儀讀取Luminal 560 nm的發(fā)射光讀數(shù)。將只含有PBS和D-luciferin的孔內(nèi)讀數(shù)N0定義為零，將未加入T細胞，只含有靶細胞的孔內(nèi)讀數(shù)N定義為100，假設某孔讀數(shù)為n ，則該孔內(nèi)的細胞殺傷效率為：1-n/(N-N0)×100%。

為進行鏡下直觀觀察，接種100 μl細胞數(shù)為1×105U251-luc于96孔板。次日，加入等體積等細胞數(shù)T細胞，放置CO2培養(yǎng)箱24 h后于倒置顯微鏡下觀察T細胞的殺傷能力及刺激情況。

2 結(jié)果

2.1IL-12載體的成功構(gòu)建 取5 μl擴增的p35、p40以及兩者為模塊擴增的IL-12全基因PCR產(chǎn)物進行1.5%瓊脂糖凝膠電泳。從圖2A中可以看出，3個片段分別在對應區(qū)域出現(xiàn)單一條帶，其中p35大小為584 bp，p40為984 bp，IL-12全基因片段大小為1 622 bp。

在對克隆陽性篩選中，結(jié)果如圖2B顯示，在隨機挑取的16個克隆快速擴增后有14個在對應的區(qū)域出現(xiàn)相應大小的特異條帶，初步判斷這些克隆為潛在的陽性克隆。為了進一步驗證克隆序列的準確性，我們隨機挑取2個克隆搖菌后提取質(zhì)粒，測序結(jié)果證實所插入的序列為正確的基因序列。

2.2構(gòu)建的IL-12可在T細胞中形成具有生物學活性的IL-12蛋白 為了探討構(gòu)建的IL-12是否具有完整的生物學活性，我們將IL-12通過電轉(zhuǎn)方式導入T細胞。細胞電轉(zhuǎn)12 h后流式檢測質(zhì)粒的電轉(zhuǎn)效率，結(jié)果如圖3A顯示，對照組GFP表達率為46.1%，IL-12OE組為49.2%，因此本實驗中使用的電轉(zhuǎn)程序具有較高的電轉(zhuǎn)效率。

為了檢測構(gòu)建的IL-12是否具有生物學活性及在腫瘤刺激下是否能進一步刺激IL-12的表達，我們用ELISA方法檢測了培養(yǎng)14 d的細胞培養(yǎng)上清以及T細胞與神經(jīng)膠質(zhì)瘤U251共同作用24 h后上清中IL-12的水平。結(jié)果如圖3B顯示，在體外培養(yǎng)14 d時過表達IL-12 T細胞上清中有較高水平的IL-12蛋白[(122.55±13.8)pg/ml]，而在對照中幾乎檢測不到相應蛋白[(0.3±0.23)pg/ml]；當T細胞與腫瘤細胞混合(圖3C)，非特異性腫瘤細胞對T細胞IL-12均有一定刺激作用,尤其對IL-12過表達T細胞能促使更高水平分泌IL-12[Control T cells刺激前后:(2.77±1.53)pg/ml vs (18.15±5.85)pg/ml；IL-12OE T cells刺激前后：(320.55±10.85)pg/ml vs (610.05±59.7)pg/ml]。

圖2 IL-12基因的擴增及陽性克隆PCR的初步鑒定Fig.2 Amplification of IL-12 gene and positive clone screening with PCR array

圖3 IL-12在T細胞中的轉(zhuǎn)導效率及IL-12蛋白檢測Fig.3 Transduction efficiency of IL-12 in T cells and IL-12 protein detection

圖4 IL-12過表達T細胞與對照T細胞表型分析Fig.4 Phenotype analysis of IL-12OE T cells and control T cells

圖5 T細胞殺傷實驗Fig.5 Cell killing assay of T cells

2.3T細胞表型分析 流式檢測體外擴增14 d T細胞CD3、CD4、CD8的表達水平。結(jié)果如圖4所示，IL-12OE組與對照組CD4、CD8陽性T細胞數(shù)量之和均在98%以上，但 IL-12過表達T細胞組中CD4陽性細胞明顯高于對照組(20.8% vs 5.25%)。

2.4IL-12分泌可促進T細胞的殺傷能力 T細胞殺傷實驗結(jié)果如圖5所示，雖然制備的T細胞沒有靶向特異性，但在一定程度上仍具有非特異殺傷神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞U251的能力。其中過表達IL-12的T細胞較對照T細胞具有更強的殺瘤效果。顯微鏡下，IL-12的分泌能顯著提高神經(jīng)膠質(zhì)瘤細胞對T細胞的刺激強度和增殖活性并形成大量T細胞克隆團(圖5B)。

3 討論

IL-12作為多效性細胞因子,是連接天然免疫與被動免疫的重要橋梁，是調(diào)動機體抗腫瘤免疫，改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境的重要介質(zhì)[7]。然而，大量臨床前及臨床實驗研究顯示IL-12大劑量直接輸注給機體帶來的毒副反應嚴重影響其臨床療效的評估及應用。如何安全高效向機體導入IL-12蛋白，充分發(fā)揮其免疫調(diào)控及抗瘤效應是推動IL-12臨床應用亟待解決的問題[4,8,9]。

T細胞是抗腫瘤免疫的主要效應細胞。腫瘤細胞通過免疫逃逸得以在體內(nèi)生長增殖。因此恢復T細胞對腫瘤抗原的識別和殺傷能力是抗腫瘤免疫的重要思路。近年以PD1/PD-L1免疫檢測點抑制劑及嵌合抗原受體T細胞(Chimeric antigen receptor T cells,CAR T)為代表的免疫療法在臨床，尤其血液系統(tǒng)腫瘤中取得的巨大成功充分驗證了該思路的正確性[10]。然而，面對實體腫瘤，目前免疫療法仍收效甚微，這與實體瘤瘤體的免疫抑制微環(huán)境密切相關。因此，改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境，充分調(diào)動T細胞抗腫瘤免疫是免疫細胞在實體瘤治療領域獲得突破的重要途徑[11]。

如前所述，IL-12無疑是改善腫瘤免疫抑制微環(huán)境的理想因子。因此，利用基因工程手段將IL-12引入腫瘤局部協(xié)同T細胞抗擊實體瘤其理論可行?；诖?，本研究我們利用基因工程手段構(gòu)建IL-12基因，并利用PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)，借助電轉(zhuǎn)導入T細胞后獲得持續(xù)穩(wěn)定的表達。IL-12分泌可進一步促進T細胞增殖，增強殺瘤活性。

以上結(jié)果顯示，非病毒PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)是外源基因?qū)隩細胞并獲得持續(xù)穩(wěn)定表達的有效工具。雖然目前在T細胞基因工程領域，病毒轉(zhuǎn)導系統(tǒng)仍是主流，但該轉(zhuǎn)導方式由于存在病毒復制、基因隨機插入，宿主抗病毒免疫反應，制備過程復雜，價格昂貴等問題，仍需作進一步改進和補充。非病毒轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)由于在以上方面顯示明顯優(yōu)勢，近年在該領域獲得迅速發(fā)展，我們的結(jié)果也表明該轉(zhuǎn)導系統(tǒng)的有效性。此外，T細胞可作為IL-12的有效攜帶載體。這主要表現(xiàn)為：①T細胞利用自身的調(diào)控體系使IL-12維持一定水平的表達。在腫瘤刺激下IL-12分泌水平顯著提高，這有利于在腫瘤局部形成高濃度IL-12；②IL-12的分泌可進一步促進T細胞增殖，提高CD4陽性細胞占比，這可能是該組細胞較對照組細胞有更好殺瘤效果的原因。在T細胞抗腫瘤免疫中，T細胞分化亞群是影響臨床療效的重要因素[12]。在此過程中CD8+細胞一直被認為是最重要的細胞亞群。然而，近年來愈來愈多的研究顯示，CD4+細胞群在其中扮演的角色越發(fā)重要[12-15]，這可能是因為CD4+T細胞提供的生長因子和其他信號是維持輸注的CTL功能和活性的重要保障[16-18]。對于攜載IL-12的T細胞亞群中CD4+T細胞顯著高于對照細胞，我們認為可能與IL-12細胞因子本身密切相關。如前所述，IL-12具有刺激淋巴細胞增殖的能力，因此攜載IL-12的T細胞可能通過其分泌至血清中的IL-12促進培養(yǎng)體系中CD4+T細胞亞群的大量擴增。此外，IL-12在T細胞內(nèi)部的表達亦可能影響T細胞內(nèi)部細胞因子調(diào)控網(wǎng)絡，從而對CD4+T的增殖產(chǎn)生影響。對該問題的回答仍需作進一步深入研究。

綜上所述，本試驗利用非病毒轉(zhuǎn)導系統(tǒng)——PiggyBac轉(zhuǎn)座子系統(tǒng)將IL-12高效導入T細胞并獲得持續(xù)穩(wěn)定的表達。初步顯示T細胞是攜載IL-12較為理想的工具。這將為后續(xù)開發(fā)靶向腫瘤抗原的CART細胞攜載IL-12治療實體瘤提供重要的技術(shù)及理論基礎。