殷 皓 周衛(wèi)東 韓菲菲 俞 蕾 費(fèi) 捷 崔玉寶

(南京醫(yī)科大學(xué)附屬無錫人民醫(yī)院醫(yī)學(xué)檢驗(yàn)科，無錫214023)

嗜酸性粒細(xì)胞(Eosinophils，EOS)浸潤(rùn)是支氣管哮喘的主要病理特征之一。活化的嗜酸性粒細(xì)胞釋放嗜酸性粒細(xì)胞源性神經(jīng)毒素(Eosinophil derived neurotoxin，EDN)、嗜酸性粒細(xì)胞陽離子蛋白(Eosinophil cationic protein，ECP)、主要堿性蛋白(Major basic protein，MBP)、嗜酸性粒細(xì)胞過氧化物酶(Eosinophil peroxidase,EPO)，參與支氣管收縮、上皮損傷與氣道高反應(yīng)性[1]。動(dòng)物試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)MBP和ECP對(duì)氣道上皮細(xì)胞具有細(xì)胞毒性，EDN與ECP一樣具有神經(jīng)毒性[2]。文獻(xiàn)報(bào)道支氣管哮喘患者血清ECP水平顯著升高，其與哮喘病情程度具有一定相關(guān)性，但是其與患者肺功能和支氣管高反應(yīng)性的相關(guān)性仍有爭(zhēng)議[3]。

迄今，兒童哮喘診斷、病情程度評(píng)價(jià)、治療過程仍缺乏客觀的實(shí)驗(yàn)室指標(biāo)[4]。EDN是一種新型的過敏反應(yīng)標(biāo)志物，本研究針對(duì)EDN診斷兒童呼吸道過敏反應(yīng)性疾病的價(jià)值及其與血清IgE(tIgE)的相關(guān)性進(jìn)行了研究，結(jié)果報(bào)道如下。

1 資料與方法

1.1資料

1.1.1一般資料 以2017年3月～2018年3月在我院就診、符合本研究納入標(biāo)準(zhǔn)過敏性哮喘或/和過敏性鼻炎的65例患兒作為病例組，22例健康兒童為對(duì)照組，兩組研究對(duì)象的監(jiān)護(hù)人均對(duì)本研究知情并簽署知情同意書，本研究方案經(jīng)醫(yī)院醫(yī)學(xué)倫理委員會(huì)審核通過(倫理審查號(hào)：KYLLH2018034)。

1.1.2診斷標(biāo)準(zhǔn) 過敏性鼻炎診斷參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)耳鼻咽喉科學(xué)分會(huì)制訂的《變應(yīng)性鼻炎診斷和治療指南(2015年，天津)》[5]，過敏性哮喘診斷參考中華醫(yī)學(xué)會(huì)兒科學(xué)分會(huì)呼吸學(xué)組制訂的《兒童支氣管哮喘診斷與防治指南(2016年版)》[6]。病例組患兒的血清tIgE水平均>100 kU/L。

1.1.3排除標(biāo)準(zhǔn) 合并有惡性腫瘤、血液疾病、自身免疫疾病、肝腎功能不全的患者；長(zhǎng)期應(yīng)用免疫抑制劑或糖皮質(zhì)激素的患者。

1.2方法 所有受試者均于清晨空腹采集外周靜脈血，于4℃下靜置2 h后以3 000 r/min的速度離心15 min，取血清檢測(cè)tIgE、EDN、嗜酸粒細(xì)胞陽離子蛋白(Eosinophil cationic protein,ECP)、血清高遷移率族蛋白B1(High mobility group protein,HMGB1)。血清總IgE和過敏原特異性IgE檢測(cè)采用免疫印跡法，試劑盒為AllergyScreen Test Kit，生產(chǎn)企業(yè)為德國(guó)Mediwiss Analytic GmbH。EDN檢測(cè)采用ELISA方法，試劑盒由MBL(Nagoya,Japan)公司生產(chǎn)(Code No.7630)。ECP檢測(cè)采用 ELISA方法，試劑盒由ImmunoWay Biotechnology Company(TX,USA)公司生產(chǎn)(Code No.KE1709)。HMGB1采用ELISA方法，試劑盒由arigo Biolaboratories (Taiwan)公司生產(chǎn)(Code No.ARG81351)。檢測(cè)過程均嚴(yán)格按照試劑盒使用說明書進(jìn)行操作。

2 結(jié)果

2.1一般資料 病例組和對(duì)照組的年齡、性別構(gòu)成、肺功能指標(biāo)等方面的差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具有可比性，具體見表1。

2.2血清tIgE、EDN、ECP、HMGB1水平檢測(cè)結(jié)果 根據(jù)血清tIgE水平將病例組分為A組(血清tIgE水平>200 kU/L)和B組(血清tIgE水平為100～200 kU/L)，比較A、B組和對(duì)照組血清ECP、EDN、HMGB1水平，結(jié)果顯示三組患兒的血清ECP水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，血清EDN和HMGB1水平的差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)。盡管A、B組患兒血清EDN和HMGB1水平的差異無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，但均高于對(duì)照組，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，見表2。

表1 兩組患者臨床資料的比較

Tab.1 Comparison of clinical data between case and control groups

Clinical dataCase group(n=65)Control group(n=22)t value/χ2 valueP valueAges (yrs)4.62±1.744.14±2.460.8460.405Gender(male/female)42/2311/221.4750.225FEV1(%,pred)82.65±12.2683.48±14.050.2640.897FEV1/FVC(%)75.56±3.7576.26±3.810.7540.568

Index Group A(n=42)Group B(n=23)Control group(n=22)F valuesP valuestIgE(kU/L)280.20±56.792)3)150.58±28.471)3)51.31±29.031)2)200.393<0.001ECP(pg/ml)1 862.74±387.89 1 860.00±381.95 1 911.93±496.89 0.1200.887EDN(ng/ml)251.75±116.753) 237.90±97.563) 94.84±57.651)2)19.177<0.001HMGB1(ng/ml)0.24±0.293) 0.38±0.383) 0.14±0.241)2)3.5620.033

Note：1)vs Group A，P<0.05；2)vs Group B，P<0.05；3)vs Control group，P<0.05.

表3 血清EDN、ECP、HMGB1水平對(duì)兒童呼吸道過敏性疾病的診斷價(jià)值分析

Tab.3 Diagnostic values of sera EDN,ECP and HMGB1 in respiratory allergic diseases

IndexAUCStandard errorP values95%CI of AUCLowUpperECP0.4900.0780.8840.3360.643EDN0.8940.0380.0000.8200.967HMGB10.6300.0640.0690.5050.755

圖1 血清EDN、ECP、HMGB1水平診斷兒童呼吸道過敏性疾病的ROC曲線Fig.1 ROC curves of EDN,ECP and HMGB1 in diagnosis of children with respiratory allergic diseases

2.3血清EDN、ECP、HMGB1水平診斷兒童呼吸道過敏反應(yīng)性疾病的價(jià)值分析 ROC曲線分析結(jié)果顯示，血清EDN水平診斷兒童呼吸道過敏反應(yīng)性疾病的AUC具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P<0.05)，AUC值為0.894，而血清ECP、HMBG1水平診斷兒童呼吸道過敏性疾病的AUC無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)，具體見表3和圖1。

2.4患兒血清EDN、ECP、HMGB1水平與tIgE水平的相關(guān)性 剔除對(duì)照組后，以病例組患兒血清tIgE水平為因變量， 以血清EDN、ECP、HMGB1為自變量，進(jìn)行相關(guān)性分析，直線相關(guān)分析結(jié)果顯示，患兒血清EDN水平與血清tIgE水平具有相關(guān)性(P<0.05)，見表4和圖2。多元線性回歸分析結(jié)果顯示，患兒血清EDN水平與血清sIgE水平具有相關(guān)性(P<0.05)，見表5。

表4 患兒血清EDN、ECP、HMGB1水平與sIgE水平的直線相關(guān)分析

Tab.4 Linear correlation analysis between levels of EDN,ECP and HMGB1 and sIgE

Index r valuesP valuesECP0.0410.703EDN0.405<0.001HMGB10.1030.340

圖2 呼吸道過敏性疾病患兒血清EDN、ECP、HMGB1水平與sIgE水平的相關(guān)性Fig.2 Linear correlation analysis between levels of EDN,ECP and HMGB1 and sIgE

表5 患兒血清EDN、ECP、HMGB1水平與tIgE水平的多元線性回歸分析

Tab.5 Multivariate linear regression analysis of levels of EDN,ECP and HMGB1 and sIgE

Variable Uncalibrated regression coefficientβStandard errorStandardized regression coefficient Betat valuesP valuesβ (95% CI)LowUpperConstant 145.81552.106-2.7980.00642.177249.452ECP-0.0170.026-0.068-0.6760.501-0.0690.034EDN0.3780.0950.4243.975<0.0010.1890.567HMGB1-14.92936.047-0.044-0.4140.680-86.62556.766

Note："-".no data.

3 討論

IgE是介導(dǎo)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的抗體，因此檢測(cè)血清IgE對(duì)Ⅰ型變態(tài)反應(yīng)的診斷和過敏原的確定很有價(jià)值[7]?？侷gE(total IgE,tIgE)檢測(cè)是判定機(jī)體過敏體質(zhì)的一種檢測(cè)手段，是過敏的一個(gè)重要標(biāo)志。當(dāng)tIgE增高，又沒有寄生蟲感染，表明患者正處于過敏狀態(tài)。正常情況下血清IgE的水平很低，用常規(guī)測(cè)定IgG或IgM的凝膠擴(kuò)散法檢測(cè)不出IgE，必須用高度敏感的放射免疫測(cè)定法、酶聯(lián)免疫測(cè)定法及間接血凝試驗(yàn)進(jìn)行檢測(cè)。本研究采用德國(guó)敏篩過敏原定量檢測(cè)系統(tǒng)，原理為免疫印跡法，結(jié)果發(fā)現(xiàn)EDN與tIgE水平具有相關(guān)性，認(rèn)為EDN在兒童呼吸道過敏性疾病診斷具有一定的價(jià)值。

嗜酸粒細(xì)胞在過敏性疾病的病理過程中發(fā)揮著重要的作用，可分泌ECP、MBP、EDN、EPO、嗜酸粒細(xì)胞蛋白X(EPX)等強(qiáng)堿性蛋白，這些蛋白均被視為嗜酸粒細(xì)胞活化和轉(zhuǎn)歸的生物學(xué)標(biāo)志物[8]。相關(guān)研究已證實(shí)了ECP與變應(yīng)性鼻炎及氣道高反應(yīng)疾病的發(fā)病、進(jìn)展及治療療效具有顯著的相關(guān)性[9]，發(fā)作期過敏性哮喘患兒的總IgE水平與ECP水平存在正相關(guān)關(guān)系，能反映過敏性哮喘患者的氣道炎癥程度和嗜酸細(xì)胞的免疫功能狀態(tài)。但是支氣管哮喘急性發(fā)作患者中過敏原的陽性種類數(shù)與ECP無顯著關(guān)聯(lián)，說明ECP不能反映患者的總體過敏狀態(tài)[10]。本次研究結(jié)果，血清ECP水平與tIgE水平不具有相關(guān)性。

HMGB1是一類具有較強(qiáng)促炎效用的核內(nèi)非組蛋白。在本研究結(jié)果中，呼吸道過敏性疾病患兒雖然也出現(xiàn)了血清HMGB1水平的升高，但其水平與sIgE水平無相關(guān)性，因此HMGB1診斷呼吸道過敏性疾病中的價(jià)值有待進(jìn)一步研究。筆者認(rèn)為，原因可能在于兩方面，第一，呼吸道過敏性疾病的變態(tài)反應(yīng)主要發(fā)生于呼吸道局部，可能對(duì)于血清HMGB1水平的影響較小。第二，血清HMGB1水平可能只是隨全身炎癥反應(yīng)的產(chǎn)生和加劇而產(chǎn)生變化，但與過敏性疾病的發(fā)生無相關(guān)性。在進(jìn)一步的研究中，應(yīng)對(duì)不同病因患兒的呼吸道局部分泌物中的HMGB1表達(dá)水平進(jìn)行檢測(cè)和比較，以探討HMGB1與過敏性疾病的相關(guān)關(guān)系。

EDN是與ECP同類的由嗜酸性粒細(xì)胞分泌的特異性蛋白。本次研究結(jié)果證實(shí)了ECP和EDN均可反映哮喘癥狀嚴(yán)重程度，但EDN在評(píng)價(jià)過敏性疾病程度和臨床診斷中的敏感度要優(yōu)于ECP。有文獻(xiàn)報(bào)道，哮喘患兒血清EDN水平與哮喘癥狀嚴(yán)重程度呈正相關(guān)關(guān)系，可將其用于哮喘患者的早期診斷、治療和病情監(jiān)測(cè)，對(duì)那些年齡太小、不能進(jìn)行肺功能測(cè)試的哮喘患兒更加適用[11]。而針對(duì)成年哮喘患者的研究結(jié)果顯示，雖然患者的血清EDN水平與肺功能及癥狀積分之間缺乏相關(guān)關(guān)系，但血清EDN水平與塵螨sIgE抗體陽性患者的1秒用力呼氣量呈負(fù)相關(guān)關(guān)系，而在塵螨sIgE抗體陰性患者中則無此相關(guān)性，在接受治療后，血清EDN水平從基線的下降幅度與肺功能改善之間具有相關(guān)性，這提示了血清EDN水平也可作為監(jiān)測(cè)塵螨sIgE抗體陽性成年哮喘患者的持續(xù)氣流受限的重要指標(biāo)[12]?？傊鳛橐环N新型過敏反應(yīng)標(biāo)志物，EDN具有優(yōu)于ECP等指標(biāo)的優(yōu)勢(shì)，但相關(guān)研究仍處于起步階段，許多相關(guān)問題還需要進(jìn)一步的研究予以討論和證實(shí)。

綜上所述，相對(duì)于ECP和HMBG1，血清END對(duì)兒童呼吸道塵螨過敏性疾病的價(jià)值更高，其表達(dá)水平與螨蟲sIgE水平具有顯著相關(guān)性，能夠在一定程度上反映機(jī)體的過敏反應(yīng)程度，有望作為兒童呼吸道過敏反應(yīng)性疾病的輔助診斷和病情評(píng)價(jià)的新型生物學(xué)指標(biāo)。