周星丞 張 帆③ 嚴(yán) 瑞 潘秀超 余 潔 潘洪獎 田平平 劉忠強(qiáng) 石明雋 郭 兵⑤

(貴州醫(yī)科大學(xué)病理生理學(xué)教研室,貴陽550025)

系統(tǒng)性紅斑狼瘡(Systemic lupus erythematosus,SLE)是一種發(fā)病機(jī)制復(fù)雜的自身免疫性疾病，以自身大量抗體形成、免疫復(fù)合物堆積、補(bǔ)體激活等表現(xiàn)為特征，常累及全身各組織和器官，其中以腎臟受累最為常見[1]。狼瘡腎炎(Lupus nephritis，LN) 是SLE最常見的并發(fā)癥，SLE患者臨床上約50%有腎臟受累表現(xiàn)，而腎活檢檢測腎臟受累幾乎為100%，是SLE 患者主要死亡原因之一[2]。LN的發(fā)病機(jī)制目前尚未十分明確，但公認(rèn)其是一種免疫復(fù)合物介導(dǎo)性腎炎，以腎小球、腎小管、腎血管損傷為主要特征，最終發(fā)展至腎纖維化[3]。與其他原發(fā)腎臟疾病相同，腎固有細(xì)胞及炎癥浸潤細(xì)胞等向肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)分化也是LN所致腎纖維化的共同途徑，其炎癥的嚴(yán)重程度與SLE的預(yù)后有關(guān)，約有20%患者最終進(jìn)展至終末期腎功能衰竭[4-7]。

血清淀粉樣蛋白A1(Serum amyloid A1,SAA1)，是急性時相反應(yīng)蛋白中重要的一種，當(dāng)機(jī)體存在炎癥時，血清中的SAA1水平升高，可被用作炎癥反應(yīng)的標(biāo)志[8]。研究發(fā)現(xiàn)，SAA1水平的改變與很多的病理狀態(tài)有關(guān)，尤其是慢性炎性疾病，如繼發(fā)性淀粉樣變性、動脈粥樣硬化，這些原本不表達(dá)SAA1的細(xì)胞也開始表達(dá)SAA1[9，10]。作為一種急性時相反應(yīng)蛋白，SAA1已應(yīng)用于臨床動脈硬化、腫瘤及急慢性炎癥類疾病的診斷[11]。但SAA1在狼瘡腎炎及其相關(guān)的腎臟纖維化中的作用卻鮮有報(bào)道。鑒于SAA1與炎癥的關(guān)系，我們認(rèn)為驗(yàn)證其在狼瘡腎炎組織中的表達(dá)以及探索其對于誘導(dǎo)的臟器纖維化的作用就顯得尤為重要。

1 材料與方法

1.1材料

1.1.1實(shí)驗(yàn)動物與細(xì)胞 實(shí)驗(yàn)所用自發(fā)性狼瘡腎炎小鼠MRL/MpJ-Faslpr小鼠(簡稱LN小鼠)與C57/BL小鼠(用于動物實(shí)驗(yàn)陰性對照)購于美國Jackson Laboratory。SPF級屏障環(huán)境中飼養(yǎng)，溫度控制在(22±2)℃，相對濕度50%～60%，自由飲食，光照周期為日夜各12 h。 LN小鼠于6周齡開始以Dipstick法檢測尿蛋白，每周一次。代謝籠收集6、12、18周齡小鼠尿液，測定尿白蛋白/肌酐。正常小鼠腎小管上皮細(xì)胞(mouse renal tubular epithelial cells,mRTEC)購自廣州 Jennio Biotech Co,Ltd，DMEM低糖型培養(yǎng)基置于細(xì)胞培養(yǎng)瓶中，于37℃、5%CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)。

1.1.2主要儀器與試劑 超低溫冰箱(Sanyo)；高速低溫離心機(jī)(Beckman)；Bayer1650全自動生化分析儀(Beckman)；電泳系統(tǒng)及電轉(zhuǎn)移裝置(Amersh-am)；凝膠成像系統(tǒng)(Bio-Rad)；熒光定量PCR儀(Bio-Rad)；DP72 顯微鏡(Olypums)；兩步法免疫組化檢測試劑、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗兔IgG、辣根過氧化物酶標(biāo)記羊抗小鼠 IgG和DAB顯色試劑盒(中杉金橋生物技術(shù)有限公司)；F-12培養(yǎng)基(Hyclone)；胰蛋白酶(Biological Industries)；BCA(Bicinchoninic acid)蛋白濃度測定試劑盒，ECL 顯色劑(北京碧云天生物研究所)；蛋白質(zhì) Marker 和總RNA 提取試劑盒(北京天根公司);Real-time PCR試劑(廣州銳博生物公司);β-tublin抗體、fibronectin(FN)抗體、alpha smooth muscle actin(α-SMA)抗體、E-cadherin(E-ca)抗體、SAA1抗體(Proteintech公司);Masson三色染色試劑盒(Solario公司)；Si-SAA1購自genepharma公司。

1.2方法

1.2.1Masson染色與免疫組織化學(xué) Masson染色參照文獻(xiàn)[12]，具體為：石蠟切片常規(guī)脫蠟至水，用配置好的Weigert鐵蘇木素染色8 min，酸性乙醇分化液分化10 s，水洗3次，Masson藍(lán)化液返藍(lán)3 min，蒸餾水洗1 min，麗春品紅染色液染色5 min，弱酸工作液洗1 min，磷鉬酸溶液1.5 min，弱酸工作液洗1 min，直接放入苯胺藍(lán)染色液中染色1 min，弱酸工作液洗1 min，95%乙醇迅速脫水，無水乙醇脫水3次，每次15 s，二甲苯透明3次，每次2 min，中性樹脂封固。免疫組織化學(xué)步驟參照文獻(xiàn)[13]：具體方法為：取新鮮腎組織用福爾馬林固定，進(jìn)行石蠟包埋、切片(約為0.2 μm)、貼片、按濃度梯度進(jìn)行脫蠟水化，置于0.01 mol/L檸檬酸鹽修復(fù)液中進(jìn)行抗原修復(fù)(高壓修復(fù))5 min，滴加內(nèi)源性過氧化物酶阻斷劑(3%過氧化氫)室溫孵育15 min，PBS洗3遍，一抗孵育過夜，二抗孵育室溫1 h，PBS洗3遍，滴加DAB顯色劑(1∶20比例)于顯微鏡下觀察，洗凈后放入蘇木素復(fù)染細(xì)胞核2 min，5%鹽酸乙醇分化5 s，自來水內(nèi)返藍(lán)15 min，按照由低到高的乙醇梯度進(jìn)行脫水，置于二甲苯內(nèi)透明2次，各2 min，風(fēng)干后中性樹脂封片，顯微鏡下觀察。

1.2.2Real-time PCR 檢測目標(biāo)mRNA的表達(dá):按天根公司試劑盒說明書，用 Trizol 法提取各組小鼠腎組織的總 RNA;以 20 μl 反應(yīng)體系反轉(zhuǎn)錄-聚合酶鏈反應(yīng)合成 cDNA，應(yīng)用引物軟件設(shè)計(jì)SAA1 qPCR引物(表1)，由Invitrogen公司合成，Bio-Rad CFX 96TM 熒光定量PCR分析系統(tǒng)行 RT-qPCR。

1.2.3免疫蛋白印跡法(Western blot)檢測腎臟組織中的蛋白表達(dá) Western blot方法參照文獻(xiàn)[13]，>具體步驟為：提取新鮮小鼠腎臟的全蛋白，用BCA法檢測蛋白濃度。采用10%聚丙烯酰胺凝膠電泳，轉(zhuǎn)膜至PVDF膜，封閉液(0.1%緩血酸銨緩沖液配制0.5%的脫脂牛奶)室溫封閉1 h，加特異性抗體4℃，0.1%緩血酸銨緩沖液洗膜3次后加辣根過氧化物標(biāo)記的IgG室溫孵育1 h，洗膜3次后，化學(xué)發(fā)光凝膠成像儀自動曝光顯影后使用Image Lab軟件分析灰度，結(jié)果以目的蛋白/β-tublin灰度值比值表示蛋白質(zhì)的相對表達(dá)水平。

表1 qRT-PCR 引物序列

Tab.1 qRT-PCR primer sequences

Sense(5′-3′)Antisense(5′-3′)Negative controlUUCUCCGAACGUGUCACGUTTCCAGAGAUUCUUUGCCCAUTTSAA1-homo-472ACGUGACACGUUCGGAGAATTAUGGCCAAAGAAUCUCUGGTT

1.2.4細(xì)胞轉(zhuǎn)染 選定用于轉(zhuǎn)染的mRTEC細(xì)胞株，轉(zhuǎn)染前將細(xì)胞按(0.5～1)×106個/孔接種于6孔板中，鋪板12～24 h，待細(xì)胞融合約70%～80%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染，吸去舊的培養(yǎng)基，PBS清洗，每孔加入1.5 ml新培養(yǎng)基。配置A、B液：A液：250 μl空培+2.5 μl siRNA；B液：250 μl空培+5 μl PEI，混勻，室溫放置5 min，然后將A、B液混合并混勻，室溫孵育20 min，混合液加入6孔板中，十字晃動輕輕混勻，37℃、5%CO2細(xì)胞培養(yǎng)箱中孵育4～6 h，之后吸去轉(zhuǎn)染復(fù)合物的培養(yǎng)基，更換新鮮完全培養(yǎng)基。轉(zhuǎn)染24～36 h后，收集細(xì)胞，提取細(xì)胞RNA進(jìn)行熒光定量PCR和Western blot檢測，驗(yàn)證干擾效率。

1.2.5免疫熒光共聚焦 細(xì)胞長至合適濃度，計(jì)數(shù)后調(diào)整濃度為2×104個/ml，接種于激光共聚焦小皿，長至50%進(jìn)行實(shí)驗(yàn)。吸凈培養(yǎng)基，無血清培養(yǎng)基洗一遍，加入LPS刺激，37℃處理(分組如下)細(xì)胞分為4組：第一組NC組，無特殊處理；第二組：LPS(10 μg/ml，24 h)組；第三組：LPS+Si-NC;第四組：LPS+Si-SAA1。 處理好后加入預(yù)冷 PBS洗3遍,4%多聚甲醛常溫固定 30 min,PBS 洗3遍,1%Triton 室溫破膜 15 min,PBS 洗3遍,3% BSA常溫封閉30 min,孵育一抗,4℃過夜,PBS洗3遍,熒光二抗室溫孵育2 h,滴加 DAPI 染核 5 min,PBS 洗3遍,熒光顯微鏡觀察。

圖1 LN小鼠腎臟纖維化情況Fig.1 Kidney fibrosis in LN miceNote: Masson staining indicate，compared with the normal group,the LN group had more staining and the fibrosis level was significantly higher.

2 結(jié)果

2.1小鼠腎臟組織鏡下結(jié)果分析 Masson染色結(jié)果顯示，與正常小鼠陰性對照(NC)組相比，LN組小鼠腎組織可見腎小管腔部分有擴(kuò)張，腎小管排列不規(guī)則，上皮細(xì)胞發(fā)生玻璃樣變性，呈空泡狀，且LN組膠原表達(dá)明顯升高(見圖1)；免疫組化結(jié)果顯示，與正常小鼠陰性對照(NC)組相比，LN組小鼠的SAA1及α-SMA蛋白表達(dá)明顯升高，而E-Ca表達(dá)減少(見圖2、3)。

2.2小鼠腎組織中SAA1的mRNA與蛋白表達(dá)水平 熒光定量PCR結(jié)果顯示：與NC組相比，LN組小鼠腎組織 SAA1 mRNA 表達(dá)顯著上調(diào)(P<0.05)，(見圖4)；同時Western blot結(jié)果也顯示LN小鼠腎臟中SAA1的蛋白水平升高(P<0.05，見圖4、5)。

2.3沉默SAA1對LPS刺激下小鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT的影響 細(xì)胞轉(zhuǎn)染后一共分為四組：LPS空白對照組為1組；LPS(10 μg/ml)處理組為2組；LPS(10 μg/ml)+Si-NC為3組；LPS(10 μg/ml)+Si-SAA1為4組。24 h后收集細(xì)胞，提取蛋白，應(yīng)用Western blot方法檢測細(xì)胞內(nèi)SAA1、α-SMA、E-Ca和FN蛋白水平。結(jié)果顯示：相對于1組、2組中細(xì)胞的SAA1、α-SMA和FN蛋白水平明顯高升高，而E-Ca水平明顯下降(P<0.05)；相對于3組，第4組細(xì)胞中的SAA1、α-SMA、FN蛋白水平明顯下降，而E-Ca表達(dá)上升(P<0.05)(見圖6)；同時免疫熒光共聚焦的結(jié)果，均支持以上Western blot結(jié)果(P<0.05)(見圖7)。

圖2 免疫組化檢測SAA1表達(dá)Fig.2 Detection of SAA1 expression by IHCNote: The level of SAA1 in the LN group was significantly increased in LN mice.

圖3 免疫組化檢測α-SMA及E-Ca表達(dá)Fig.3 Detection of α-SMA and E-Ca expression by IHCNote: Compared with the normal group,the expression of α-SMA was increased and the expression of E-Ca was decreased in the LN group.

圖4 LN小鼠腎臟中SAA1 mRNA的表達(dá)Fig.4 Expression of SAA1 mRNA in kidney of LN miceNote: Compared with the NC group，*.P<0.05.

圖5 Western blot檢測SAA1在腎組織中的表達(dá)Fig.5 Expression of SAA1 protein in kidney by Western blotNote: Compared with the NC group，*.P<0.05 .

圖6 SAA1對腎臟纖維化的影響Fig.6 Effect of SAA1 on renal fibrosisNote: After LPS stimulation,the expression of α-SMA and FN in mRTECs was significantly increased,and the level of E-Ca was decreased.After Si-SAA1 was added,the above situation was offs.

圖7 免疫熒光檢測α-SMA和FN的表達(dá)Fig.7 Immunofluorescence detection of α-SMA and FN expressionNote: After LPS stimulation,the brightness of α-SMA and FN increased; adding Si-SAA1,the brightness was weakened.

3 討論

LN是SLE的主要并發(fā)癥之一，其主要臨床表現(xiàn)為蛋白尿、血尿，在腎臟損害累及腎臟的各個部分，包括腎小球、腎小管、間質(zhì)及血管[5，14]。有文獻(xiàn)報(bào)道，LN腎小管間質(zhì)損傷的發(fā)生率可高達(dá)51%，腎小管間質(zhì)損傷不僅僅是腎小球病變的伴隨表現(xiàn)，也有可能是LN獨(dú)立的、重要的參與者，且可影響患者的預(yù)后[15]。另有研究顯示，LN腎小管間質(zhì)損傷能誘導(dǎo)腎小管上皮細(xì)胞間充質(zhì)轉(zhuǎn)分化(Epithelial-mesenchymal transition，EMT)，促進(jìn)腎臟纖維化的發(fā)生，進(jìn)而導(dǎo)致終末期腎病，引起腎衰竭[16]。EMT是上皮細(xì)胞通過特定程序轉(zhuǎn)化為具有間質(zhì)表型細(xì)胞的生物學(xué)過程。在胚胎發(fā)育、慢性炎癥、組織重建、癌癥轉(zhuǎn)移和多種纖維化疾病中發(fā)揮了重要作用，常具有E-Ca蛋白表達(dá)的減少、α-SMA和FN蛋白增多等特征[17]。因此本文對這些指標(biāo)進(jìn)行檢測就是為了反映相關(guān)細(xì)胞的EMT進(jìn)程。

本實(shí)驗(yàn)Masson染色的結(jié)果中，NC組小鼠腎小管輪廓清晰，各部分結(jié)構(gòu)無明顯異常；而LN組小鼠的腎組織中可見明顯的炎癥與纖維化病變，且有大量膠原沉積，由此推測SLE狼瘡腎炎小鼠模型是成功的。免疫組化EMT相關(guān)指標(biāo)的結(jié)果也進(jìn)一步驗(yàn)證了模型的可靠性。

SAA是由多基因家族編碼的蛋白質(zhì)，進(jìn)化上高度保守。在小鼠中，SAA家族的所有四個基因SAA1、SAA2、SAA3、SAA4都聚集在7號染色體上，并主要在肝臟中表達(dá)[18,19]。但近年來相關(guān)研究發(fā)現(xiàn)SAA蛋白在小鼠肝外組織中也有表達(dá)，主要為上皮細(xì)胞和巨噬細(xì)胞；此外，人們發(fā)現(xiàn)在腫瘤細(xì)胞、淋巴細(xì)胞、上皮細(xì)胞及類風(fēng)濕關(guān)節(jié)炎患者的滑膜細(xì)胞中均發(fā)現(xiàn)SAA蛋白或mRNA的表達(dá)[20]。在大量引起全身急性炎癥反應(yīng)的疾病發(fā)病過程中，此類細(xì)胞作為SAA蛋白表達(dá)的潛在來源，在局部疾病的發(fā)生發(fā)展中起著重要作用，甚至成為影響疾病預(yù)后的關(guān)鍵環(huán)節(jié)，因此探尋SAA的這些局部作用必將為某些疾病防治提供有效靶點(diǎn)。SAA1作為血清淀粉樣蛋白A家族的最主要組成成分，是家族中表達(dá)最廣泛、活性最強(qiáng)、反應(yīng)最敏感的亞型[21]。在各種疾病如外傷、腫瘤、感染及炎癥發(fā)病過程中升高可達(dá)到數(shù)千倍以上[22]。相關(guān)研究表明，SAA在臟器纖維化病變的發(fā)生發(fā)展中也發(fā)揮著重要作用，Piotti等[23]發(fā)現(xiàn)SAA在早期臟器纖維化中表達(dá)明顯增加。本文在小鼠腎臟切片中檢測，相對于正常組而言，狼瘡腎炎小鼠SAA1表達(dá)明顯升高，提示其可能與腎臟纖維化的發(fā)生過程相關(guān)，組織的mRNA和蛋白水平檢測也發(fā)現(xiàn)SAA1的表達(dá)有明顯升高，與本次實(shí)驗(yàn)預(yù)期結(jié)果一致。

在體外實(shí)驗(yàn)中，大量相關(guān)研究均利用脂多糖(Lipopolysaccharide，LPS)刺激細(xì)胞模擬LN細(xì)胞環(huán)境[24]，并且考慮其與炎癥的相關(guān)性，因此本實(shí)驗(yàn)利用LPS體外處理小鼠腎小管上皮細(xì)胞模擬狼瘡腎炎的炎癥反應(yīng)，運(yùn)用Westren blot和免疫熒光共聚焦觀察EMT相關(guān)蛋白E-Ca、α-SMA及FN的變化，經(jīng)LPS刺激后，α-SMA及FN表達(dá)明顯升高，E-Ca表達(dá)明顯下調(diào)；沉默SAA1后能有效抑制LPS促進(jìn)EMT的作用，這說明SAA1參與腎臟纖維化疾病過程，且在其中扮演著促纖維化角色，與動物實(shí)驗(yàn)結(jié)果一致。至此，我們認(rèn)為急性炎癥反應(yīng)能夠刺激SAA1的迅速大量生成，趨化炎性細(xì)胞浸潤，激活下游通路促進(jìn)腎小管上皮細(xì)胞EMT的發(fā)生，從而促進(jìn)腎臟纖維化的發(fā)生發(fā)展。同時，進(jìn)一步驗(yàn)證SAA1誘導(dǎo)小鼠腎小管上皮細(xì)胞EMT進(jìn)程的分子機(jī)制以及探討SAA1的上游轉(zhuǎn)錄因子對其在LN腎臟組織中異常表達(dá)的誘導(dǎo)機(jī)制是接下來的研究方向，以期未來能研發(fā)相關(guān)藥物及為臨床提供有效治療靶點(diǎn)。