孫 廣 候貽莉 吳 輝 王 萍

(安順市人民醫(yī)院，安順561000)

類風(fēng)濕性關(guān)節(jié)炎(Rheumatoid arthritis，RA)是一種以滑膜關(guān)節(jié)受累為主要臨床表現(xiàn)的系統(tǒng)疾病，多發(fā)生于雙手關(guān)節(jié)、膝關(guān)節(jié)及足關(guān)節(jié)等[1]。流行病學(xué)研究表明，中國(guó)RA疾病發(fā)生率為0.32%～0.40%，隨著人口老齡化的增加，RA患病人數(shù)逐年增加，是導(dǎo)致殘疾的主要關(guān)節(jié)疾病之一[2]。目前臨床主要以延緩疾病進(jìn)展，減輕關(guān)節(jié)炎癥為主，尚無(wú)根治RA疾病的治療策略。因此，盡早診斷出RA疾病有利于及時(shí)干預(yù)，減緩疾病發(fā)展，減少致殘情況的發(fā)生。研究表明，免疫細(xì)胞活性失衡、炎癥反應(yīng)、自身抗體生成等在RA疾病發(fā)生中具有重要作用[3]。既往研究表明，多種微小RNAs(Micro RNAs，miRNAs)對(duì)以上生物過(guò)程具有一定調(diào)控作用[4]。另外研究表明，外泌體攜帶的miRNA在一定程度上可反映其產(chǎn)生細(xì)胞的病理狀態(tài)，如在胰腺炎大鼠模型中，來(lái)自胰腺泡細(xì)胞的外泌體中包含大量調(diào)節(jié)炎癥反應(yīng)的miRNAs，參與激活肺泡巨噬細(xì)胞，引起炎癥反應(yīng)[5]。因此，本研究通過(guò)檢測(cè)RA患者血清外泌體中miR-223、miR-155表達(dá)情況，并分析二者與RA患者臨床特征和炎癥因子水平的相關(guān)性，旨在揭示血清外泌體miR-223、miR-155表達(dá)在RA疾病發(fā)生發(fā)展中作用。

1 資料與方法

1.1一般資料 納入2015年4月～2017年8月在本院初診的RA患者77例為研究對(duì)象，其中男23例，女54例，年齡26～80歲，平均(50.23±9.85)歲，所有患者均進(jìn)行28關(guān)節(jié)疾病活動(dòng)性評(píng)分(Disease activity score in 28 joints，DAS28)，根據(jù)2010年歐洲抗風(fēng)濕聯(lián)盟和美國(guó)風(fēng)濕協(xié)會(huì)修訂的RA診斷標(biāo)準(zhǔn)[6]進(jìn)行診斷，納入標(biāo)準(zhǔn)：①均符合上述RA診斷標(biāo)準(zhǔn)；②年齡26～80歲；③入院治療前未進(jìn)行抗風(fēng)濕藥物治療；④知悉本研究?jī)?nèi)容并自愿加入；⑤依從性良好。排除標(biāo)準(zhǔn)：①排除合并其他自身免疫性疾病患者；②排除患有感染性疾病患者；③排除其他可能引起炎癥反應(yīng)疾病患者；④排除患有高血壓、糖尿病、肝腎疾病等患者。另選取同期在本院進(jìn)行體檢的健康者75例為對(duì)照，其中男19例，女56例，年齡28～80歲，平均(49.78±9.35)歲。兩組受試者年齡、性別比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)。

1.2方法

1.2.1資料采集 收集受試者年齡、性別一般資料和DAS28評(píng)分、抗環(huán)瓜氨酸多膚抗體(anti-cyclic peptide containing citrulline，anti-CCP)抗體、C反應(yīng)蛋白(Creaction protein，CRP)、紅細(xì)胞沉降率(Erythrocyte sedimentation rate，ESR)、類風(fēng)濕因子(Rheumatoid factor，RF)等實(shí)驗(yàn)室檢查指標(biāo)。

1.2.2標(biāo)本采集 分別于體檢當(dāng)日和入院12 h內(nèi)采集體檢者和RA患者肘靜脈血(6 ml/人)，置于抗凝真空管中，取2 ml離心后保存上清，待測(cè)；剩余4 ml 采用外泌體試劑盒(德國(guó)QIAGEN公司)提取收集血清外泌體。

1.2.3檢測(cè)方法 采用ELX800自動(dòng)酶標(biāo)儀(美國(guó)BioTech公司)通過(guò)人腫瘤壞死因子(Tumor necrosis factor，TNF)-α酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(貨號(hào)：ab181421，美國(guó)ABCam公司)、人白介素(Interleu-kin-6，IL-6)酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(貨號(hào)：ab46027，美國(guó)ABCam公司)、人IL-17酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(貨號(hào)：ab119535，美國(guó)ABCam公司)、人IL-1β酶聯(lián)免疫吸附試劑盒(貨號(hào)：ab197447，美國(guó)ABCam公司)測(cè)定各受試者血清中TNF-α、IL-6、IL-17和IL-1β水平；采用外泌體RNA提取試劑盒(美國(guó)Life公司)提取血清外泌體總RNA，試劑盒富集miRNAs，以U6作為內(nèi)參，采用實(shí)時(shí)熒光定量(real-time fluorescence quantitative，qRT)-PCR技術(shù)檢測(cè)并分析血清外泌體中miR-223、miR-155表達(dá)。

2 結(jié)果

2.1兩組受試者臨床特征比較 RA組患者的性別、年齡與對(duì)照組比較，差異無(wú)統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P>0.05)；RA組患者的DAS28評(píng)分、抗CCP抗體水平、血清CRP水平、紅細(xì)胞沉降率、類風(fēng)濕因子水平，見(jiàn)表1。

2.2血清外泌體miR-223、miR-155水平的比較 RA組患者血清外泌體miR-223、miR-155相對(duì)表達(dá)量均明顯高于對(duì)照組健康者(P<0.05)，見(jiàn)表2。

2.3血清外泌體miR-223、miR-155水平對(duì)RA疾病的診斷價(jià)值 ROC結(jié)果顯示，miR-223對(duì)RA疾病診斷的AUC為0.842(95%CI：0.754～0.931，P<0.05)，miR-223/U6≥3.53診斷RA疾病的敏感度為82.51%，特異度為78.56%，詳見(jiàn)圖1A；miR-155對(duì)RA疾病診斷的AUC為0.764(95%CI： 0.635～0.857，P<0.05)，miR-155/U6≥4.15診斷RA疾病的敏感度為61.83%，特異度為76.58%，詳見(jiàn)圖1B。

表1 兩組受試者臨床特征比較

Tab.1 Comparison of clinical characteristics between two groups of subjects

CharacteristicsRA groupControl groupt/χ2PGender(Male/Female)23/5419/560.3910.532Age(Year)50.23±9.8549.78±9.350.2890.773DAS28(Point)5.97±1.12046.1580.000Anti-CCP antibody(U/ml)213.59±42.57043.4480.000CRP(mg/L)16.37±3.450.34±0.0540.2310.000ESR(mm/h)36.75±9.7811.81±2.1421.5850.000RF(U/ml)437.27±73.56051.4760.000

表2 血清外泌體miR-223、miR-155表達(dá)的比較

Tab.2 Comparison of serum exosomes miR-223 and miR-155 expression

GroupsnmiR-223/U6miR-155/U6Control751.01±0.161.07±0.23RA773.46±0.734.08±0.79t-28.40631.711P-0.0000.000

圖1 血清外泌體miR-223、miR-155水平診斷RA疾病的價(jià)值Fig.1 Value of serum exosomes miR-223 and miR-155 in diagnosis of RA disease

表3 血清炎癥因子水平的比較

Tab.3 Comparison of serum inflammatory factors levels

GroupsnTNF-α(pg/L)IL-6(ng/L)IL-17(ng/L)IL-1β(ng/L)Control756.87±1.371.46±0.2914.75±2.761.53±0.31RA7716.23±3.2513.48±2.5838.64±7.3920.18±3.94t-23.24240.62326.53341.409P-0.0000.0000.0000.000

表4 血清外泌體miR-223、miR-155水平與RA患者臨床特征的相關(guān)性分析

Tab.4 Correlation between serum exosome miR-223 and miR-155 levels and clinical features of RA patients

FactorsmiR-223rPmiR-155rPDAS280.5090.0000.5150.000Anti-CCP antibody0.5930.0000.5940.000CRP0.6020.0000.4970.000ESR0.6150.0000.6030.000RF0.5760.0000.5430.000

2.4兩組受試者血清炎癥因子水平的比較 檢測(cè)結(jié)果顯示，RA患者血清TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β水平均明顯高于對(duì)照組健康者(P<0.05)，見(jiàn)表3。

2.5血清外泌體miR-223、miR-155水平與RA患者臨床特征的相關(guān)性 Pearson檢驗(yàn)顯示，血清外泌體miR-223、miR-155水平與RA患者DAS28評(píng)分、血清抗CCP抗體、CRP、ESR、RF水平正相關(guān)(P<0.05)，見(jiàn)表4。

2.6血清外泌體miR-223、miR-155水平與RA患者血清炎癥因子水平的相關(guān)性 Pearson檢驗(yàn)顯示，血清外泌體miR-223、miR-155水平均與RA患者血清TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β水平正相關(guān)(P<0.05)。

表5 血清外泌體miR-223、miR-155水平與RA患者炎癥因子水平的相關(guān)性分析

Tab.5 Correlation analysis between serum exosome miR-223 and miR-155 levels and inflammatory factor levels in RA patients

FactorsmiR-223rPmiR-155rPTNF-α0.5090.0000.5980.000IL-60.5860.0000.6110.000IL-170.6210.0000.6710.000IL-1β0.5540.0000.5840.000

3 討論

RA早期主要表現(xiàn)為滑膜炎，是關(guān)節(jié)病變的基礎(chǔ)，進(jìn)一步發(fā)展可導(dǎo)致患者軟骨或骨組織損傷，甚至造成關(guān)節(jié)功能喪失，導(dǎo)致殘疾，嚴(yán)重影響患者身體健康和生活質(zhì)量。RA疾病早期表現(xiàn)為細(xì)胞浸潤(rùn)性和滲出性，滑膜組織間質(zhì)出現(xiàn)炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)，炎癥因子水平增加[7]。RA患者以30歲以上女性為主，涉及各個(gè)年齡段，隨著我國(guó)人口老齡化水平增加，RA發(fā)病率隨之逐年增加[8]。RA疾病發(fā)生時(shí)，患者關(guān)節(jié)已經(jīng)出現(xiàn)一定程度損傷，是導(dǎo)致殘疾的關(guān)節(jié)疾病之一，但其發(fā)病機(jī)制尚不明確。在疾病早期，采用非甾類抗炎藥或糖皮質(zhì)激素等抗風(fēng)濕類藥物處理可延緩疾病進(jìn)展，改善患者癥狀，因此探究RA疾病發(fā)生機(jī)制，尋找合適生物指標(biāo)，對(duì)RA疾病早期診斷和盡早治療具有重要意義。

外泌體是一類含有核酸、脂類、蛋白質(zhì)等物質(zhì)，由多種細(xì)胞產(chǎn)生，分泌進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)的膜性囊泡結(jié)構(gòu)，其中包含有miRNA、長(zhǎng)鏈非編碼RNA等核酸類物質(zhì)，具有在細(xì)胞間傳遞信號(hào)的作用[9]。miRNAs可與目標(biāo)基因mRNA 3′非編碼區(qū)進(jìn)行特異結(jié)合，啟動(dòng)目標(biāo)基因mRNA降解或抑制目標(biāo)基因轉(zhuǎn)錄翻譯，進(jìn)而調(diào)控免疫反應(yīng)和炎癥反應(yīng)等生物學(xué)過(guò)程。隨著研究的深入，學(xué)者們發(fā)現(xiàn)miRNA參與自身免疫性疾病、呼吸系統(tǒng)疾病、腫瘤等多種疾病的發(fā)生[10]。另外，被包裹在外泌體中的miRNAs可有效避免血清中RNA酶降解，可被完整傳遞給受體細(xì)胞，參與調(diào)解生理過(guò)程[11]。Gao等[12]研究發(fā)現(xiàn)，來(lái)源自樹(shù)突狀細(xì)胞的外泌體可作用于受體細(xì)胞膜TNF-α，激活NF-κB通路，增加動(dòng)脈血管內(nèi)皮的炎癥程度，加重動(dòng)脈粥樣硬化程度。近期研究表明，外泌體與RA疾病發(fā)病過(guò)程相關(guān)，通過(guò)將核酸等生物分子從供體細(xì)胞轉(zhuǎn)移至受體細(xì)胞，參與調(diào)控受體細(xì)胞內(nèi)信號(hào)通路并影響其功能[13]?；谝陨涎芯拷Y(jié)果，推測(cè)血清外泌體中miRNA表達(dá)可能作為潛在標(biāo)志物用于RA疾病診斷。然而，目前關(guān)于RA患者血清外泌體miRNA表達(dá)模式的研究相對(duì)較少。

miR-223是一類哺乳動(dòng)物常見(jiàn)的miRNA之一，存在于多種細(xì)胞、組織中，參與炎癥反應(yīng)等過(guò)程。Li等[14]研究發(fā)現(xiàn)，miR-223在RA患者血清中表達(dá)上調(diào)，參與破骨形成過(guò)程，動(dòng)物實(shí)驗(yàn)表明，抑制miR-223表達(dá)可有效降低關(guān)節(jié)炎小鼠的關(guān)節(jié)炎評(píng)分、組織學(xué)評(píng)分及骨組織侵蝕，表明抑制miR-223活性可能作為治療RA的策略。Shibuya等[15]發(fā)現(xiàn)，miR-223在RA患者滑膜組織中高表達(dá)，細(xì)胞實(shí)驗(yàn)表明，過(guò)表達(dá)miR-223可顯著促進(jìn)破骨細(xì)胞生成，破骨細(xì)胞增多是RA疾病發(fā)生的原因之一，提示miR-223可能作為治療RA潛在靶點(diǎn)。以上研究表明，miR-223在RA患者血清及滑膜組織中均表達(dá)上調(diào)，參與RA疾病發(fā)生，但是關(guān)于RA患者血清外泌體中研究較少。本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清外泌體中miR-223水平顯著高于對(duì)照者，與Filková等[16]在RA患者血清中發(fā)現(xiàn)一致，表明miR-223在RA患者血清外泌體及血清中均呈高表達(dá)，可能參與RA疾病發(fā)生。ROC分析發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-223對(duì)RA疾病診斷的AUC為0.842，表明檢測(cè)血清外泌體miR-223水平可有效區(qū)分RA患者和健康者。另外，Elmesmari等[17]研究發(fā)現(xiàn)，miR-155在RA患者外周血、單核細(xì)胞中表達(dá)均顯著高于對(duì)照組，可通過(guò)調(diào)節(jié)趨化因子和促炎癥趨化因子受體表達(dá)促進(jìn)炎癥細(xì)胞聚集在關(guān)節(jié)滑膜，引發(fā)疾病。Alivernini等[18]發(fā)現(xiàn)，miR-155在RA患者外周血B細(xì)胞中高表達(dá)，可促進(jìn)滑膜組織中IL-21等炎癥因子表達(dá)，與滑膜組織炎癥嚴(yán)重程度有關(guān)，表明miR-155在RA疾病中是激活B細(xì)胞的重要調(diào)控因子。本研究發(fā)現(xiàn)，RA患者血清外泌體miR-155水平顯著高于對(duì)照者，與Rajasekhar等[19]在RA患者單核細(xì)胞和滑膜液中發(fā)現(xiàn)一致，表明血清外泌體miR-155表達(dá)上調(diào)可能參與RA疾病發(fā)生。ROC分析發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-155對(duì)RA疾病診斷的AUC為0.764，表明檢測(cè)血清外泌體miR-155水平可有效區(qū)分RA患者和健康者。

進(jìn)一步分析發(fā)現(xiàn)，血清外泌體miR-223、miR-155水平與RA患者DAS28評(píng)分、血清抗CCP抗體、CRP、ESR、RF水平正相關(guān)，提示血清外泌體miR-223、miR-155與RA疾病進(jìn)展有關(guān)。RA疾病是一種自身免疫性疾病，早期主要表現(xiàn)為病理性滑膜炎，研究發(fā)現(xiàn)，RA患者的滑膜組織中聚集有大量巨噬細(xì)胞等，產(chǎn)生并分泌大量TNF-α、IL-6等炎癥因子進(jìn)入循環(huán)系統(tǒng)，在RA疾病發(fā)生發(fā)展中具有重要作用[20]。與前人研究一致，本研究所納入RA患者血清TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β水平亦明顯高于對(duì)照者。進(jìn)一步研究提示，血清外泌體miR-223、miR-155水平與RA患者血清TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β水平正相關(guān)，提示血清外泌體miR-223、miR-155可能通過(guò)調(diào)控TNF-α、IL-6、IL-17、IL-1β表達(dá)，參與RA疾病進(jìn)展過(guò)程，這為進(jìn)一步研究血清外泌體如何參與調(diào)節(jié)RA疾病發(fā)生和進(jìn)展提供了一定思路。

綜上所述，本研究發(fā)現(xiàn)miR-223、miR146a在RA患者血清外泌體中高表達(dá)，與患者疾病嚴(yán)重程度和血清炎癥因子水平有關(guān)，提示血清外泌體miR-223、miR146a高表達(dá)參與RA疾病發(fā)生。