余中節(jié) 趙 潔 宋宇琴 孫志宏 張和平

（內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)乳品生物技術(shù)與工程教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 農(nóng)業(yè)部奶制品加工重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室內(nèi)蒙古自治區(qū)乳品生物技術(shù)與工程重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室 呼和浩特 010018）

乳酸菌是指糖發(fā)酵能產(chǎn)生50%以上乳酸的一類無芽孢、不運(yùn)動、過氧化氫酶反應(yīng)陰性、革蘭氏染色陽性細(xì)菌的總稱[1]。乳酸菌是重要的工業(yè)用微生物之一，其能夠使食品酸化，產(chǎn)生酒精，改善食品風(fēng)味，維持腸道微生態(tài)，抑制病原菌生長，從而緩解乳糖不耐、腹瀉、胃潰瘍等病癥，被廣泛用于食品和生物醫(yī)藥行業(yè)。在青貯飼料發(fā)酵過程中，乳酸菌能夠調(diào)節(jié)飼料內(nèi)的生物區(qū)系，促進(jìn)多糖與粗纖維轉(zhuǎn)換，提高飼料轉(zhuǎn)化率，促進(jìn)反芻動物瘤胃發(fā)育；乳酸菌分泌的有機(jī)酸可以溶解土壤中的梨酸鹽并通過螯合作用釋放磷元素有助于植物生長。然而，傳統(tǒng)的分析技術(shù)存在分辨率低，重復(fù)性差等缺點(diǎn)，未能全面解析乳酸菌的進(jìn)化過程和遺傳背景，在很大程度上限制了高生產(chǎn)性能和優(yōu)良益生特性乳酸菌的應(yīng)用領(lǐng)域和自身價值的發(fā)揮。

全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS）的出現(xiàn)為乳酸菌的分離篩選以及溯源、進(jìn)化研究提供了更為可靠的證據(jù)和新的思路。GWAS技術(shù)在細(xì)菌的基因-性狀關(guān)聯(lián)分析方面的應(yīng)用已經(jīng)漸趨成熟，這方面的研究也已成為細(xì)菌分子生物學(xué)的熱門領(lǐng)域。本文綜述GWAS在細(xì)菌中應(yīng)用的現(xiàn)狀，并分析了將GWAS分析技術(shù)應(yīng)用于乳酸菌基因組研究及分離篩選的可行性，意在推動和倡導(dǎo)在我國加快對該項(xiàng)技術(shù)的應(yīng)用研究。

1 乳酸菌分子生物學(xué)研究進(jìn)展

人類對乳酸菌的應(yīng)用有著長遠(yuǎn)的歷史，根據(jù)《圣經(jīng)·舊約》的記載，公元前 4000年，人類已經(jīng)開始食用發(fā)酵肉制品及蔬菜腌漬物。1873年李斯特（Lister）利用稀釋法，從酸乳中分離純化出乳桿菌（Bacterium lactis），也就是目前的乳酸乳球菌（Lactococcus lactis），這是乳酸菌最早被分離出來的紀(jì)錄[2]。目前在自然界發(fā)現(xiàn)的乳酸菌主要包括乳酸桿菌屬（Lactobacillus）、乳球菌屬（Lactococcus）、明串珠球菌屬（Leuconostoc）、奇異菌屬（Atopobium）等43個屬373個種及亞種[3]。

據(jù)新思界產(chǎn)業(yè)研究發(fā)布的《2016-2019年中國乳酸菌市場深度分析報告》顯示，在2015年我國乳酸菌的市場規(guī)模達(dá)到了660億元，并且每年保持15%～18%以上的增速，而我國大部分乳酸菌市場被外資和合資企業(yè)所壟斷，這是一種極不正常的現(xiàn)象，乳酸菌呈現(xiàn)出較強(qiáng)的地域性，特定地區(qū)的人群因其飲食習(xí)慣及腸道消化系統(tǒng)的差異，更適合本地區(qū)的乳酸菌，也就是習(xí)慣上所說的國民益生菌。然而，我國本土益生菌產(chǎn)品缺失，主要原因是對乳酸菌分離鑒定的基礎(chǔ)研究和應(yīng)用研究缺失，因而快速分離篩選出具有自主知識產(chǎn)權(quán)且生產(chǎn)、益生性能良好的乳酸菌，以及闡明乳酸菌的分離學(xué)地位、進(jìn)化過程和遺傳背景，對發(fā)展民族乳酸菌產(chǎn)業(yè)非常重要。

早期對于乳酸菌的研究主要集中在利用其生理生化特性進(jìn)行分類鑒定，以及分離篩選，這種手段一是要通過大量的實(shí)驗(yàn)得出結(jié)論，時間成本和實(shí)驗(yàn)成本很高；二是生物的表型與其基因型并不完全對應(yīng)，因而該方法存在分辨率低，工作量大等諸多限制。分子生物學(xué)的發(fā)展使得乳酸菌的快速分離篩選，以及闡明乳酸菌的起源、進(jìn)化成為可能。由此產(chǎn)生的一系列新型技術(shù)，如以16S rRNA基因間隔區(qū)（Intergenic spacer region，ISR）序列分析技術(shù)為代表的DNA指紋圖譜技術(shù)，為乳酸菌的分離鑒定提供了豐富的方法。

基因芯片技術(shù)是上世紀(jì)90年代興起的一種對成百上千甚至上萬個基因同時進(jìn)行檢測的新技術(shù)，有高通量、并行化等特點(diǎn)。Frese等[4]利用比較基因組雜交（Comparative genomic hybridization，CGH）技術(shù)對57株分離自不同脊椎動物的羅伊氏乳桿菌（Lactobacillus reuteri）的基因組多態(tài)性進(jìn)行研究，發(fā)現(xiàn)分離自嚙齒動物的菌株在聚類分析中形成了單獨(dú)的分支，表明其與其它5個分離源的分離株在基因組上存在明顯差異。當(dāng)然該方法也存在一定的局限性，首先其只能將參考基因組中的有限基因用于設(shè)計(jì)基因陣列，其次低雜交率的基因?qū)⒉荒苡糜谘芯縖5]。

隨著逐步克隆法和全基因組鳥槍法等一代測序技術(shù)的出現(xiàn)，對乳酸菌基因組的研究進(jìn)入了測序時代。2014—2016年內(nèi)蒙古農(nóng)業(yè)大學(xué)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室“乳品生物技術(shù)與工程實(shí)驗(yàn)室”采用高分辨率的多位點(diǎn)序列分型技術(shù)（Multilocus sequence typing，MLST）對包括分離自中國、蒙古國和俄羅斯等地的多個乳酸菌進(jìn)行研究[6-13]，闡明菌株基因重組與變異對其進(jìn)化的貢獻(xiàn)，進(jìn)化與世系、分離地和分離源的關(guān)系，加深了對乳酸菌遺傳多樣性和群落結(jié)構(gòu)的理解，并對菌株分類學(xué)地位的劃分提供新的建議，為乳酸菌的溯源提供了新的理論依據(jù)。然而，在試驗(yàn)研究過程中，由于生物繁殖中不可避免的同源重組現(xiàn)象，使得菌株間垂直遺傳信號受到干擾，因此僅依靠幾個靶標(biāo)基因序列無法還原菌株真實(shí)的垂直進(jìn)化關(guān)系[14]；在菌株分離篩選層面，MLST技術(shù)也只能進(jìn)行推測，Song等[12]利用將與工業(yè)用菌株位于同一世系的分離株為依據(jù)來推測可能用于工業(yè)生產(chǎn)的新菌株，縮小了人工篩選的范圍，卻未能給出具體影響生產(chǎn)性能的基因。

之后隨著計(jì)算和生物技術(shù)的不斷發(fā)展，測序成本快速降低，通量不斷提高，對乳酸菌基因組的大規(guī)模測序得以實(shí)現(xiàn)。2001年Bolotin等[15]完成對第一株乳酸菌-乳酸乳球菌乳酸亞種（Lactococcus lactis ssp.lactis）IL1403的全基因組測序。2010年，Zhang等[16]完成了我國第一株乳酸菌——干酪乳桿菌 Zhang（Lactobacillus casei Zhang）的全基因組測序。Sun等[17]、Zhong等[18]分別對45株雙歧桿菌（Bifidobacterium）和37株腸球菌（Enterococcus）進(jìn)行了比較基因組學(xué)分析，找到了雙歧桿菌屬和腸球菌屬的祖先，闡明了雙歧桿菌和腸球菌的傳播過程。2015年，Sun等[19]完成了對213株乳桿菌（Lactobacilli）的重測序，并重構(gòu)了系統(tǒng)發(fā)育樹，建議將乳桿菌屬、片球菌屬（Pediococcus）、魏斯氏菌屬（Weissella）、明串珠菌屬（Leuconostoc）、嗜果糖乳酸菌屬（Fructobacillus）和酒球菌屬（Oenococcus）命名為乳桿菌屬復(fù)合體（Lactobacilli complex），并詳細(xì)闡述了蛋白代謝和糖代謝的基因，同時解析了CRISPR-Cas免疫系統(tǒng)，為將來對乳桿菌的基因編輯打下了基礎(chǔ)。全基因組序列雖然能夠更完整的表達(dá)乳酸菌的進(jìn)化過程，但其也僅能將基因存在/缺失的數(shù)據(jù)利用Phenolink等[20]、CFAS等[21]相關(guān)性分析工具找到具體某個基因的存在與缺失對特定表型的影響，忽略了基因結(jié)構(gòu)、拷貝數(shù)、基因間隔區(qū)、基因表達(dá)能力等差異對表型的影響。GWAS是在全基因組層面上開展大樣本、多中心、重復(fù)驗(yàn)證的技術(shù)，并對相關(guān)基因與復(fù)雜性狀進(jìn)行關(guān)聯(lián)研究，從而能夠全面揭示出乳酸菌生長速度、產(chǎn)酸量、耐高溫、耐酸、耐膽鹽等性狀的遺傳機(jī)制，同時也為乳酸菌的分離篩選提供更可靠的證據(jù)。

2 全基因組關(guān)聯(lián)分析（Genome-wide association study，GWAS）

從1865年Gregor Johann Mendel“顆粒遺傳”概念的提出到1953年WatsonCrick提出DNA分子的雙螺旋結(jié)構(gòu)模型；從20世紀(jì)70年代Fred Sanger及其同事發(fā)明第一代DNA測序技術(shù)到2005年以 Solexa、ABI SOLiD為代表的第二代DNA測序技術(shù)的研發(fā)與應(yīng)用，從1977年Fred Sanger完成對全長為5 375 bp的PhiX174噬菌體基因組的測定到2003年人基因組計(jì)劃（Human genome project，HGP）的完成，人類完成了對遺傳物質(zhì)從認(rèn)識到結(jié)構(gòu)解析再到精準(zhǔn)測序的演變。隨著人類基因組計(jì)劃的完成、基因芯片和第二代基因組測序技術(shù)的大規(guī)模應(yīng)用，標(biāo)志著人類正式進(jìn)入后基因組時代，全基因組關(guān)聯(lián)分析應(yīng)運(yùn)而生。

2.1 GWAS的概述

全基因組關(guān)聯(lián)分析最初應(yīng)用于人類基因組，其原理是應(yīng)用基因組中數(shù)以萬計(jì)的單核苷酸多態(tài)性（Single nucleotide phlymophism，SNP）、插入和缺失（Insertions and deletions，InDels）或拷貝數(shù)變異（Copy number variations，CNV）進(jìn)行病例-對照的關(guān)聯(lián)分析，以發(fā)現(xiàn)影響疾病發(fā)生的遺傳特征[22]，之后隨著高通量測序技術(shù)的發(fā)展，也逐漸應(yīng)用于其它模式和非模式的動植物中，甚至是一些經(jīng)典的原核生物中。第一篇在人類中成功應(yīng)用GWAS的文獻(xiàn)于2005年在Science上發(fā)表[23]。Klein等[24]在96個老年性黃斑病變的病例和50個同樣來自非西班牙裔的白人作為對照組的研究中共找到116 204個SNPs位點(diǎn)，發(fā)現(xiàn)其中位于補(bǔ)體因子H的內(nèi)含子中的SNP rs3380390和rs1329428與疾病顯著相關(guān)。雖然對于GWAS方法的某些方面仍然存在爭議，但截止到2013年National human genome research institute（NHGRI）已經(jīng)有 1 751篇GWAS文章被出版，共找到11 912個SNPs與疾病相關(guān)[25]。

2.2 GWAS的原理及分析流程

GWAS分析的主要原理是在群體中選擇病例組和對照組或連續(xù)分布的數(shù)量性狀，比較全基因組范圍內(nèi)所有遺傳標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因或基因型頻率在病例組和對照組之間的差異，若某個遺傳標(biāo)記位點(diǎn)的等位基因或基因型在病例中出現(xiàn)的頻率明顯高于或低于對照組，則認(rèn)為該位點(diǎn)與性狀存在關(guān)聯(lián)，之后根據(jù)該位點(diǎn)在基因組中的位置和連鎖不平衡關(guān)系推測與性狀相關(guān)的基因。全基因組關(guān)聯(lián)分析的主要流程包括樣品采集、表型數(shù)據(jù)的測量、全基因組測序、基因組拼接、SNP、idnel、CNV等分子標(biāo)記檢測、群體遺傳分析、連鎖不平衡分析、性狀關(guān)聯(lián)分析和目標(biāo)性狀相關(guān)區(qū)域基因功能注釋。

2.3 GWAS的優(yōu)勢

相關(guān)性分析總體上可以分為“自下而上”和“自上而下”兩種方法。“自下而上”，即以基因組為基礎(chǔ)方法，以DNA序列為基礎(chǔ)，檢測其對表型的影響，該方法已被廣泛應(yīng)用，然而存在諸多限制，例如：其工作量較大，無法應(yīng)用在共生細(xì)菌中，只能判斷基因的存在與缺失對表型的影響，而無法判斷基因的調(diào)控或蛋白質(zhì)的多態(tài)性對表型的影響?！白陨隙隆?，即從表型開始，檢測特定的基因組區(qū)域與表型的不同聯(lián)系，也就是GWAS[26]。GWAS是以自然群體為研究對象，以長期重組后保留的基因間的連鎖不平衡（Linkage disequilibrium，LD）為基礎(chǔ)，將目標(biāo)性狀表型的多態(tài)性與基因的多態(tài)性相結(jié)合，共同分析，能夠直接鑒定出與表型密切相關(guān)且具有特定功能的基因位點(diǎn)，擴(kuò)大了相關(guān)性分析的應(yīng)用范圍，同時實(shí)現(xiàn)了在提高相關(guān)性信號分辨率的基礎(chǔ)上減小試驗(yàn)工作量。

2.4 GWAS的應(yīng)用條件

無論將GWAS方法應(yīng)用在人類或是細(xì)菌中，其都必須滿足以下3個先決條件，即可測的表型和可測的基因型，以及足夠樣品數(shù)量來保證統(tǒng)計(jì)學(xué)效力，并在此前提下選擇正確的統(tǒng)計(jì)分析方法。眾所周知，更多樣品的統(tǒng)計(jì)學(xué)可靠性更好，所以為了保證基因組的異質(zhì)性以及數(shù)據(jù)的正態(tài)性，應(yīng)保證樣品數(shù)不少于30個[27]。

2.5 GWAS在細(xì)菌中的應(yīng)用現(xiàn)狀

GWAS是基因組分析的重要工具，并且近幾年已經(jīng)成功應(yīng)用到細(xì)菌基因組分析上（表1）。早期的細(xì)菌基因組主要基于PCR技術(shù)或比較基因組雜交技術(shù)，通過與表型結(jié)合，以尋找基因組中特定基因的存在或缺失與表型的關(guān)系，然而因?yàn)槌杀竞推脚_的限制，以及某些細(xì)菌自身的核苷酸多樣性較低，如炭疽桿菌（Bacillus anthracis）[28]，使得其無法在細(xì)菌基因組中大規(guī)模應(yīng)用。2013年Sheppard等[29]首次實(shí)現(xiàn)GWAS在細(xì)菌中的應(yīng)用，將192株分離自牛和雞腸道的彎曲桿菌（Campylobacter）的DNA序列劃分成30 bp長的“word”來尋找菌株與特定宿主定殖能力方面的相關(guān)性，共檢測到7 307個“word”與彎曲桿菌在牛腸道中的特異性定殖有關(guān)，注釋到3個與維生素B5生物合成相關(guān)基因，因而認(rèn)為彎曲桿菌自身能否合成維生素B5是其能否在牛腸道定殖的關(guān)鍵。之后Chewapreecha等[30]的研究首次使GWAS在細(xì)菌中的研究達(dá)到了人類遺傳學(xué)研究的規(guī)模，他們總共分析了收集自緬甸和泰國邊境的3 085株和收集自美國馬薩諸塞州的616株肺炎鏈球菌（Streptococcus pneumoniae）用于檢測β-內(nèi)酰胺抗性相關(guān)的基因組變異。

結(jié)核分枝桿菌（Mycobacterium tuberculosis），俗稱結(jié)核桿菌，是引起結(jié)核病的病原菌。Farhat等[31]利用基于進(jìn)化收斂性的方法找到123株結(jié)合分枝桿菌的獨(dú)立突變位點(diǎn)，并以卡內(nèi)蒂分枝桿菌（Mycobacterium canettii）作為外群構(gòu)建系統(tǒng)進(jìn)化樹，驗(yàn)證了全部前人研究發(fā)現(xiàn)的抗性基因并且發(fā)現(xiàn)39個主要編碼細(xì)胞壁生物合成、轉(zhuǎn)錄調(diào)控和DNA修復(fù)通路的基因與分枝結(jié)核桿菌的抗性有關(guān)。D-環(huán)絲氨酸是治療結(jié)核病的高毒性二線藥物，Christopher等[32]通過對498株結(jié)核分枝桿菌的相關(guān)性分析，找到21個基因的功能缺失突變與常用于治療結(jié)核病9種藥物的耐藥性有關(guān)，其中編碼L-丙氨酸脫氫酶的ald基因擁有11種不同的功能缺失突變與D-環(huán)絲氨酸的抗藥性有關(guān)，通過基因敲除試驗(yàn)驗(yàn)證了相關(guān)性分析結(jié)果。

金黃色葡萄球菌（Staphylococcus aureus，S.aureus）是人體皮膚和鼻腔的常見定殖菌。Laabei等[33]通過對收集的90株耐甲氧西林金黃色葡萄球 菌（Methicillin-resistant S.aureus，MRSA）的GWAS分析，發(fā)現(xiàn)了121個基因座位與分離株的不同毒性有關(guān)。同樣，Alam等[34]在49株萬古霉素敏感金黃色葡萄球菌（Vancomycin-sensitive S.aureus）和26株萬古霉素中度敏感金黃色葡萄球菌（Vancomycin-intermediate S.aureus）中檢測到55 977個SNPs，發(fā)現(xiàn)編碼RNA聚合酶的rpoB基因第481位密碼子的非同義替換與金黃色葡萄球菌的萬古霉素抗性顯著相關(guān)。

由上述研究可知，GWAS已經(jīng)有在細(xì)菌中成功應(yīng)用的先例，成功的定位彎曲桿菌、肺炎鏈球菌、結(jié)核分枝桿菌和金黃色葡萄球菌等細(xì)菌的毒力基因和抗性基因，因而GWAS技術(shù)在定位乳酸產(chǎn)酸量、產(chǎn)酸速度等與生產(chǎn)特性相關(guān)的基因，以及闡明分離源、分離地等選擇壓力對乳酸菌進(jìn)化的影響充滿了希望，然而同時也面臨著挑戰(zhàn)。

表1 近幾年全基因組關(guān)聯(lián)分析在細(xì)菌中應(yīng)用的文獻(xiàn)Table1 Genome-wide association study application in bacteria in recent years

2.6 GWAS在細(xì)菌基因組中應(yīng)用存在的限制

2005年二代測序技術(shù)的出現(xiàn)使得對細(xì)菌基因組的大規(guī)模測序得以實(shí)現(xiàn)，而GWAS并未立即應(yīng)用于細(xì)菌基因組分析。究其原因，主要是由于原核細(xì)胞與真核細(xì)胞在組成上存在差異，細(xì)菌是單倍體生物，缺乏著絲粒與紡錘體結(jié)構(gòu)，雙鏈環(huán)形DNA隨著細(xì)胞的伸長采用二分裂的方式分開，因而使其無法像真核細(xì)胞在減數(shù)分裂四分體時期非姐妹染色單體之間發(fā)生同源重組，從而導(dǎo)致細(xì)菌基因組出現(xiàn)嚴(yán)重的種群分層和較高的連鎖不平衡現(xiàn)象，也就使得在人類基因組中廣泛應(yīng)用的GWAS分析無法直接套用于細(xì)菌基因組中。

2.7 GWAS在細(xì)菌中應(yīng)用所面臨困難的解決方法

群體分層的問題不僅在細(xì)菌的GWAS研究中出現(xiàn)，同樣也出現(xiàn)在人類的GWAS研究中，即在病例對照的研究中，如果某遺傳標(biāo)記的等位基因的頻率在病例和對照組中出現(xiàn)顯著差異，而該遺傳標(biāo)記并不與表型相關(guān)，則認(rèn)為該研究中存在群體分層現(xiàn)象[35]，簡單來講就是等位基因在亞群中非隨機(jī)分布。因?yàn)榧?xì)菌特殊的克隆繁殖方式使得其群落高度相關(guān)，導(dǎo)致細(xì)菌的GWAS研究受到群體分層的嚴(yán)重干擾，可是這往往被研究者所忽視，相關(guān)性結(jié)果的出現(xiàn)是因?yàn)檫z傳的相關(guān)性而不是基因組的變異，從而使得相關(guān)性檢驗(yàn)的P值膨脹，與表型相關(guān)的和不相關(guān)的突變同時關(guān)聯(lián)到同一個連鎖區(qū)域內(nèi)，從而出現(xiàn)假陽性的結(jié)果，使得研究結(jié)果難以重復(fù)。解決群體分層的方法可以通過有選擇性的采樣，采集隔離或來自同一家系的不同表型的群體樣品，Maury等[36]通過該方法收集了104株單核細(xì)胞增生性李斯特氏菌（Listeria monocytogenes），通過GWAS分析發(fā)現(xiàn)內(nèi)化蛋白基因InlA的截短是低毒性李斯特菌的主要變異特征，而一個由6個基因構(gòu)成的磷酸轉(zhuǎn)移酶系統(tǒng)（Phosphotransferase system，PTS）是高毒性李斯特菌的主要毒力因子。另外，可以通過使用線性混合模型（Linear mixed model，LMM）來消除不同祖先或有相關(guān)性的樣品造成的有偏倚的相關(guān)性。Earle等[37]使用該方法用于查找來自4個不同種的3 363株致病菌在17種藥物中的潛在的抗性基因。還可通過使用重建系統(tǒng)發(fā)育樹[31，34]，或聚類后進(jìn)行大量置換檢驗(yàn)的方法[33]以及基因組控制[38]等方法來消除。

連鎖不平衡是指一個基因座位上的某些等位基因與同一個染色體上另一個基因座位上的某些等位基因同時出現(xiàn)的頻率大于單獨(dú)隨機(jī)出現(xiàn)的頻率，連鎖不平衡的程度可以用r2來衡量[39]。同樣由于細(xì)菌無性克隆的繁殖方式以及單倍體基因組結(jié)構(gòu)，使得其只能通過接合、轉(zhuǎn)化和轉(zhuǎn)導(dǎo)產(chǎn)生重組和交換遺傳信息，造成細(xì)菌基因組的高度連鎖不平衡，通過連鎖區(qū)域中其它連鎖位點(diǎn)使真正與特定表型有因果關(guān)系的變異位點(diǎn)變得模糊，從而限制經(jīng)典的基因組作圖工具，只能將有相關(guān)性的區(qū)域定位到較長連鎖片段，形成所謂的“馬賽克基因”，降低了相關(guān)性信號的分辨率。要解決連鎖不平衡最直接的辦法就加大樣本量，Chewapreecha等[30]使用了3 701株肺炎鏈球菌，為GWAS分析提供了足夠的重組事件。減少連鎖不平衡的不利影響第一步是要明確所研究細(xì)菌連鎖不平衡的水平，four-gamete test[40]或 D′measure[41]等工具可以評價細(xì)菌的連鎖不平衡水平，之后可以通過定義一個變異是否能夠引起表型功能上的改變，例如抗藥性、菌落總數(shù)等，來確定該變異是否為因連鎖不平衡造成的假陽性變異[42]。同時還可以結(jié)合細(xì)菌基因組具有顯著的正向選擇的特點(diǎn)，來提高GWAS的分辨率。

3 GWAS在乳酸菌中應(yīng)用的意義

GWAS利用廣泛分布于基因組中的SNP，In-Del，CNV等分子標(biāo)記，將目標(biāo)性狀表型的多態(tài)性與基因的多態(tài)性相結(jié)合，共同分析，相比于MLST技術(shù)、比較基因組學(xué)技術(shù)具有更高的分辨率，能夠在單核苷酸的水平解析乳酸菌生產(chǎn)性能的不同，為乳酸菌的分離篩選提供更可靠的證據(jù)。在遺傳進(jìn)化方面，不僅可以驗(yàn)證前人的研究結(jié)果，還能夠提供更多、更完善的信息，為乳酸菌的溯源、遺傳多樣性的研究提供新的思路。目前GWAS在細(xì)菌基因組中的應(yīng)用尚處于發(fā)展初期，而且已完成的研究也主要集中在致病菌中，在包括乳酸菌等工業(yè)用微生物中還鮮有報道[43]。目前我研究團(tuán)隊(duì)正在開展對于嗜熱鏈球菌（Streptococcus thermophilus）的GWAS研究，在已完成的研究中發(fā)現(xiàn)，以分離源和發(fā)酵特性分別做為表型，發(fā)現(xiàn)冷激蛋白（Cold-shock protein）和鈣轉(zhuǎn)移 P型 ATP酶（Calcium-translocating P-type ATPase）、胞壁質(zhì)水解酶調(diào)控酶lrgA（Murein hydrolase regulator LrgA）、膜蛋白（Membrane protein）分別與菌株的分離地的海拔和產(chǎn)酸量、產(chǎn)酸速率呈顯著相關(guān)關(guān)系。早期研究已經(jīng)證明GWAS不僅是一個尋找特定表型與其所關(guān)聯(lián)的基因型的可靠方法，而且是一個揭示復(fù)雜性狀表達(dá)水平的強(qiáng)有力的工具[44]，因而將GWAS應(yīng)用于乳酸菌等工業(yè)微生物的分離篩選、進(jìn)化以及溯源將具有開創(chuàng)性意義。

人類對于乳酸菌的應(yīng)用有著很長的歷史，對于乳酸菌的研究已經(jīng)深入到分子水平，GWAS技術(shù)可以使乳酸菌的基因組研究精確到核苷酸水平，為乳酸菌的分離篩選以及進(jìn)化溯源提供更可靠度證據(jù)和新的思路。我國立足于民族乳酸菌從收集、篩選、分離、鑒定等基礎(chǔ)和應(yīng)用研究起步較晚，且與發(fā)達(dá)國家存在較大差距，而GWAS技術(shù)的應(yīng)用為我們在較短時間內(nèi)縮短與發(fā)達(dá)國家的差距提供了可行的途徑。為此，將GWAS技術(shù)應(yīng)用于乳酸菌的遺傳和進(jìn)化研究以及分離篩選，具有更加現(xiàn)實(shí)的意義。