丁小梅 何善生 王 力 李 健 李桂玲

（集美大學(xué)食品與生物工程學(xué)院 福建廈門 361021）

螺旋藻多糖（Polysaccharide from S.platensis，PSP）是一種具有多種生物活性的水溶性功能性生物大分子[1]，其分子結(jié)構(gòu)較復(fù)雜，主要是由D-葡萄糖、D-半乳糖及葡萄糖醛酸等通過糖苷鍵連接而成[2-3]。研究發(fā)現(xiàn)，螺旋藻多糖在抗腫瘤[4-5]，抗氧化[6-7]，抗病毒活性[8]，免疫機(jī)能的調(diào)節(jié)[9-10]，血糖調(diào)節(jié)[11]，抗疲勞[12]，抗衰老[13]等方面發(fā)揮著重要作用。積極開展螺旋藻多糖的深入研究，必能在食品添加劑、功能性藥品、保健品等領(lǐng)域的研究與開發(fā)方面提供極大助力[14]。

酪氨酸酶（EC1.14.18.1，TYR）是一種活性中心含有Cu2+的多功能氧化酶[15]，同時(shí)也是反映黑色素生物合成中限速效應(yīng)的關(guān)鍵酶[16]。酪氨酸酶可通過兩步催化使L-酪氨酸轉(zhuǎn)化為多巴醌，這是果蔬褐變的重要原因[17]。開發(fā)安全、高效的酪氨酸酶抑制劑對抑制果蔬褐變[18]和食品保鮮[19]等方面具有重要意義。螺旋藻多糖作為一種無毒、高效，具有多種生物活性的功能性生物大分子[1]，具有重要的研究價(jià)值。本文在酶動力學(xué)試驗(yàn)的基礎(chǔ)上，以螺旋藻多糖為效應(yīng)物（抑制劑），探究其對酪氨酸酶活力的抑制作用，希望能為以螺旋藻多糖為主要活性組成的新型食品保鮮劑的研究、開發(fā)與應(yīng)用提供一定數(shù)據(jù)基礎(chǔ)和理論依據(jù)[20]。

螺旋藻多糖分子中含有大量的糖醛酸、酚羥基等基團(tuán)[21-22]，具有抗氧化，清除自由基的活性[2]，可有效延緩食品氧化過程，防止食品氧化變質(zhì)[20]。本文以試驗(yàn)所得螺旋藻多糖為主要試劑，通過DPPH自由基清除法，對其自由基清除能力進(jìn)行驗(yàn)證，以期為其在抗氧化劑、食品保鮮等方面的應(yīng)用研究提供更為客觀、綜合的理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 主要試劑

螺旋藻干粉，福建省神六保健食品有限公司；無水乙醇、三氯乙酸、丙酮、L-抗壞血酸、硫酸、二甲基亞砜（DMSO）、NaH2PO4、Na2HPO4，西隴化工股份有限公司；NaOH，上?；瘜W(xué)試劑總廠；L-多巴、蘑菇酪氨酸酶，上海西格瑪有限公司；蒽酮、鹽酸，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；DPPH、葡萄糖，上海麥克林生化科技有限公司。

1.2 主要儀器及設(shè)備

Nicolet Avatar 330型傅里葉變換紅外光譜儀，美國Thermo Electron公司；Cintra 2020型紫外可見分光光度計(jì)，澳大利亞GBC儀器公司；3-30KS高速冷凍離心機(jī)，德國Sigma公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線（硫酸-蒽酮法[23-24]） 配制質(zhì)量濃度為0.113 mg/mL的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，分別取不同體積的該葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，蒸餾水定容至10 mL，配制成一系列濃度梯度的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液，搖勻，再各取1 mL上述葡萄標(biāo)準(zhǔn)溶液于具塞試管中，同時(shí)取1 mL蒸餾水作空白對照，冰浴5 min。再加入4 mL 0.2%硫酸-蒽酮溶液，搖勻后沸水浴15 min，隨后冷卻至室溫，靜置10 min，測定其在620 nm波長處的吸光度值。以吸光度值（A）為縱坐標(biāo)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)品的濃度（C）為橫坐標(biāo)，得到二者之間的標(biāo)準(zhǔn)關(guān)系曲線，用于計(jì)算螺旋藻多糖提取物中的多糖含量。

1.3.2 螺旋藻多糖提取工藝的優(yōu)化研究

1.3.2.1 螺旋藻多糖的提取與純化[25]取一定質(zhì)量的螺旋藻干粉，在95%乙醇中浸泡過夜，離心后取沉淀，37℃烘干；加入適量蒸餾水，用1 mol/L NaOH溶液調(diào)pH值為10，80℃水浴加熱3 h；離心取上清液，用1 mol/L鹽酸調(diào)節(jié)上清pH值為7.0，逐滴加入5%三氯乙酸，4℃靜置3 h后離心取上清液，重復(fù)上述操作，去除上清液中的蛋白；加入約3倍上清液體積的95%乙醇，4℃下放置過夜；離心取沉淀，用丙酮洗滌2～3次，對沉淀進(jìn)行冷凍干燥處理后，即可得到螺旋藻多糖產(chǎn)品。

1.3.2.2 螺旋藻多糖提取條件的優(yōu)化 選取對試驗(yàn)結(jié)果具有較大影響的4個(gè)因素，即提取時(shí)間（t），料液比（M），提取溫度（T）和pH 值，進(jìn)行 4 因素3水平的正交試驗(yàn)，優(yōu)化螺旋藻多糖的提取條件，獲得最佳提取工藝，正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)如表1所示。

表1 正交試驗(yàn)設(shè)計(jì)Table1 Orthogonal experimental design

1.3.3 螺旋藻多糖對酪氨酸酶抑制效果的研究酪氨酸酶可以催化L-多巴生成多巴色素，多巴色素在波長475 nm處具有最大吸收[26-27]。具體操作根據(jù)參考文獻(xiàn)[20]所提供的方法：取0.1 mL的酪氨酸原酶溶液，與0.9 mL的PBS溶液（pH 6.8）混勻，在0℃暫存。稱取不同質(zhì)量的螺旋藻多糖，用DMSO 配制成不同質(zhì)量濃度（4，12，20，28，36，40，44，52，60，80，100 mg/mL）的多糖溶液（效應(yīng)物）。取一定量的0.5 mmol/L L-多巴溶液，在30℃下水浴10 min。在比色皿中，加入2.8 mL的L-多巴溶液，0.1 mL效應(yīng)物，混勻后調(diào)零，再加0.1 mL酪氨酸酶溶液，混勻后立即在475 nm波長進(jìn)行連續(xù)掃描，得到吸光度與時(shí)間的變化關(guān)系曲線。同時(shí)用0.1 mL不含效應(yīng)物的DMSO空白對照，消光系數(shù)ε=3700 L·mol-1·cm-1[28]，直線的斜率為相對酶活，繪制相對酶活與多糖濃度（CI）之間的關(guān)系圖。

1.3.4 螺旋藻多糖對酪氨酸酶抑制機(jī)理的研究 以0.5 mmol/L的L-多巴溶液為底物，在上述反應(yīng)體系中，研究螺旋藻多糖對酪氨酸酶的抑制機(jī)理[20，29]。 分別取酶酪氨酸原酶 40，60，80，100，120 μL，用pH 6.8的PBS溶液稀釋，定容至1 mL；分別稱取螺旋藻多糖樣品 0.1，0.3，0.5，0.7 g，用 DMSO配制成不同濃度的多糖溶液（效應(yīng)物），測定不同濃度的效應(yīng)物對酪氨酸酶抑制活力的影響。以剩余酶活為縱坐標(biāo)，以酶濃度（CE）為橫坐標(biāo)，繪制剩余酶活與酶濃度之間的關(guān)系曲線。根據(jù)直線的相交、平行情況，直線斜率變化情況，探究效應(yīng)物對酪氨酸酶的抑制機(jī)理[20，30]。

1.3.5 螺旋藻多糖對酪氨酸酶抑制類型和抑制常數(shù)的測定 抑制劑類型的測定采用上述同樣的測定體系，通過固定酶液濃度（酪氨酸酶質(zhì)量濃度6.207 μg/mL），改變底物濃度（L-多巴液濃度分別為0.2，0.3，0.4，0.5，0.6 mmol/L）和抑制劑的濃度（螺旋藻多糖溶液質(zhì)量濃度分別為4，12，20，28 mg/mL），探究不同濃度的抑制劑對酪氨酸酶活力的影響。本試驗(yàn)采用Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法，以反應(yīng)速率的倒數(shù)（V-1）對底物濃度的倒數(shù)（CS-1）作圖，觀察直線的相交情況以及橫縱軸截距[20，31]，以直線斜率為縱坐標(biāo)，抑制劑濃度（CI）為橫坐標(biāo)，進(jìn)行二次作圖，可得該效應(yīng)物對酪氨酸酶的抑制常數(shù)（KI），從而判斷出螺旋藻多糖對酪氨酸酶的抑制類型[32]。

1.3.6 螺旋藻多糖清除DPPH自由基的研究 螺旋藻多糖對DPPH自由基清除能力的研究參照Duan 等[33]的方法：稱取 0，5，10，15，20，25 mg 螺旋藻多糖，用DMSO定容至25 mL，然后分別吸取上述不同濃度的螺旋藻多糖溶液2 mL，置于10 mL的具塞比色管中，每管中各加入2 mL的82 μg/mL DPPH溶液，混勻后，室溫避光條件下靜置30 min，隨后倒入比色皿中，測定其在517 nm波長下的吸光度值A(chǔ)i。其中螺旋藻多糖添加量為0（即未添加螺旋藻多糖）的一組，為空白組，其吸光度值記為A0。取2 mL 95%乙醇于比色皿中，加入2 mL的多糖溶液，測得吸光度值A(chǔ)i0（即為調(diào)零組），以排除樣品本身顏色的干擾[20]。通過式（1），判斷螺旋藻多糖的自由基清除能力情況。

式中，Ai——試驗(yàn)組的吸光度值；A0——空白組的吸光度值；Ai0——調(diào)零組的吸光度值。

為了更直觀地說明螺旋藻多糖的自由基清除能力的強(qiáng)弱，配制相同濃度的L-抗壞血酸溶液，按上述操作，通過對比對螺旋藻多糖的自由基清除能力進(jìn)行說明。

2 結(jié)果與分析

2.1 繪制葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線

根據(jù)硫酸-蒽酮法繪制標(biāo)準(zhǔn)的葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線如圖1所示。

圖1 葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液標(biāo)準(zhǔn)曲線Fig.1 Glucose standard solution standard curve

由圖1可知，所得葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)曲線在0～0.565 mg/mL的范圍內(nèi)線性良好，即在0～0.565 mg/mL的范圍內(nèi)，葡萄糖標(biāo)準(zhǔn)溶液濃度（C）與其對應(yīng)吸光度之間具有良好的線性關(guān)系。其回歸方程：A=7.4856C+0.0068（R2=0.9918）。

2.2 螺旋藻多糖提取條件的優(yōu)化

通過正交試驗(yàn)，優(yōu)化了螺旋藻多糖的提取工藝，獲得最佳提取條件。其正交試驗(yàn)結(jié)果如表2所示。

表2 正交試驗(yàn)結(jié)果Table2 Orthogonal experimental results

由表2可知，在所選的4個(gè)因素中，提取溫度對多糖提取率的影響最為重要，其次為料液比、pH值，提取時(shí)間對多糖提取率的影響則相對最弱。提取螺旋藻多糖的最佳工藝組合：A2B3C3D1，即在提取時(shí)間2 h，提取溫度90℃，pH 8，料液比1∶40的條件下，理論上可以獲得最高的提取率。通過驗(yàn)證試驗(yàn)結(jié)果可知，在上述最佳提取工藝條件下，螺旋藻多糖的提取率可高達(dá)1.50%。

2.3 螺旋藻多糖對酪氨酸酶的抑制效果

以酪氨酸酶相對活性對效應(yīng)物（螺旋藻多糖）濃度（CI）作圖，如圖2所示。

由圖2可知，酪氨酸酶活性與多糖溶液濃度成反比，說明該效應(yīng)物對酪氨酸酶具有抑制作用。當(dāng)抑制劑質(zhì)量濃度<2.0 mg/mL時(shí)，酪氨酸酶酶活迅速下降，此后，酶活下降速度稍緩。測得導(dǎo)致酪氨酶活力下降50%的螺旋藻多糖質(zhì)量濃度（IC50）為1.193 mg/mL。

圖2 多糖溶液對酪氨酸酶抑制效果Fig.2 Inhibitory effect of polysaccharide inhibitor on tyrosinase

2.4 螺旋藻多糖對酪氨酸酶的抑制機(jī)理

以0.5 mol/L的L-多巴溶液為底物，通過測定不同濃度下螺旋藻多糖對酪氨酸酶的抑制效果，從而判斷其抑制機(jī)理。結(jié)果如圖3所示。在圖3中，以剩余酶活力為Y軸，以酶濃度為X軸繪圖，得到5條斜率與效應(yīng)物濃度呈反比的、交于原點(diǎn)的直線，即螺旋藻多糖對酪氨酸酶的抑制機(jī)理屬于可逆抑制[32]。說明多糖與酪氨酸酶是通過非共價(jià)鍵結(jié)合的，且其結(jié)合是可逆的。效應(yīng)物的抑制作用只是使酶活降低，對其有效酶量并未產(chǎn)生影響[19-20，32]。

2.5 螺旋藻多糖對酪氨酸酶的抑制類型及抑制常數(shù)

在不同濃度的螺旋藻多糖和L-多巴底物的反應(yīng)體系中，酶質(zhì)量濃度為6.207 μg/mL，測定在不同濃度的螺旋藻多糖溶液中，酶促反應(yīng)速率的變化情況。即研究效應(yīng)物多糖對酪氨酸酶活力的影響。以反應(yīng)速率的倒數(shù)（V-1）和底物濃度的倒數(shù)（CS-1）為研究指標(biāo)，采用 Lineweaver-Burk雙倒數(shù)作圖法作圖，判斷其抑制類型[20，33]，結(jié)果如圖4所示，得到一組直線，該組直線相交于第二象限，且直線在坐標(biāo)軸上的截距與多糖濃度之間存在一定變化規(guī)律，說明螺旋藻多糖對酶促反應(yīng)的最大反應(yīng)速率（Vmax）和米氏常數(shù)（Km）均產(chǎn)生了影響[19-20]。因?yàn)镵m與效應(yīng)物多糖濃度之間成正比關(guān)系，而Vmax則相反，故可判斷其抑制類型為混合型。以圖4中各直線的斜率為Y軸，多糖濃度為X軸，再次作圖，即圖4中的插圖?？汕蟪鲆种瞥?shù)KI為0.544 mg/mL。

圖3 多糖溶液對酪氨酸酶抑制機(jī)理的測定Fig.3 Determination of tyrosinase inhibitory mechanism by polysaccharide inhibitors

圖4 多糖溶液對酪氨酸酶抑制類型及其抑制常數(shù)的測定Fig.4 Determination of tyrosinase inhibition type and its inhibition constant by polysaccharide inhibitor

2.6 螺旋藻多糖清除DPPH自由基的效果

螺旋藻多糖、L-抗壞血酸對DPPH自由基的清除效果如圖5所示。由圖5可知，螺旋藻多糖對DPPH自由基清除能力與其濃度成正比，在質(zhì)量濃度0～0.6 g/L范圍內(nèi)，DPPH自由基清除能力上升較為迅速，其后變化趨于緩和，得到其半清除率（IC50）為0.463 g/L。由圖5可以看出，質(zhì)量濃度為1.0 g/L的螺旋藻多糖的自由基清除率分別為71.49%和86.42%，故可知螺旋藻多糖具有較強(qiáng)的抗氧化能力[20]。

圖5 螺旋藻多糖對DPPH自由基清除效果Fig.5 Spirulina polysaccharide scavenging DPPH free radical

3 結(jié)論

本文通過對螺旋藻多糖提取工藝、螺旋藻多糖對酪氨酸酶抑制作用與機(jī)理及其抗氧化能力的研究，可以得知：在提取時(shí)間2 h，料液比1∶40，提取溫度90℃，pH 8的條件下，螺旋藻多糖得率較高，可達(dá)到1.50%；螺旋藻多糖對酪氨酸酶具有較好的抑制效果，其IC50為1.193 mg/mL，其抑制過程屬于可逆的混合型抑制，抑制常數(shù)KI為0.544 mg/mL。螺旋藻多糖對DPPH自由基清除率最高可達(dá)71.94%，與同濃度下的L-抗壞血酸相比，可知其具有較強(qiáng)的抗氧化能力。因此，開展螺旋藻多糖在防止果蔬褐變、食品保鮮、抗氧化劑、酶抑制劑等方面的相關(guān)研究工作具有重要意義。以期為螺旋藻多糖后續(xù)更為深入的實(shí)際應(yīng)用機(jī)理及毒理學(xué)研究，提供較為綜合、科學(xué)、客觀的試驗(yàn)及理論依據(jù)。