李函彤 王 芬 蘆 晶 逄曉陽(yáng) 張書文 劉 鷺 呂加平*

（1 中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所 農(nóng)業(yè)部農(nóng)產(chǎn)品加工與質(zhì)量控制重點(diǎn)開放實(shí)驗(yàn)室 北京 100193

2 北京市營(yíng)養(yǎng)源研究所 系統(tǒng)營(yíng)養(yǎng)工程技術(shù)研究中心 北京 100069

3 天津科技大學(xué)食品工程與生物技術(shù)學(xué)院 天津 300457）

三價(jià)鉻作為一種不可缺少的微量元素，在維持機(jī)體的糖、脂和蛋白質(zhì)的正常代謝中起著重要作用。鉻在環(huán)境中多以Cr（Ⅲ）和Cr（Ⅵ）形式存在[1-2]，鉻的生物學(xué)功能與它的氧化價(jià)態(tài)有關(guān)[3]。Cr（Ⅵ）具有一定的致癌性，對(duì)人體有害；Cr（Ⅲ）則是對(duì)人體有益的微量元素[4]。鉻是目前已知的唯一隨著機(jī)體衰老而遞減的金屬離子[5-6]。機(jī)體缺鉻會(huì)導(dǎo)致機(jī)體葡萄糖代謝紊亂，出現(xiàn)葡萄糖不耐受反應(yīng)。通過營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑對(duì)特定人群進(jìn)行強(qiáng)化補(bǔ)鉻尤為重要。人體對(duì)無機(jī)鉻（硫酸鉻、氯化鉻）的吸收利用率極低，不到1%；對(duì)有機(jī)鉻的利用率可達(dá)10%～25%[7]。葡萄糖耐量因子（Glucose tolerance factor，GTF）專指來源于酵母，由甘氨酸、谷氨酸、半胱氨酸與煙酸共同絡(luò)合中心的Cr（Ⅲ）形成具有生物活性的鉻配合物，也稱酵母鉻[8-10]。研究表明GTF與動(dòng)物體內(nèi)鉻調(diào)素（Chromodulin）一樣，人體對(duì)其吸收率較高，安全性較高。GTF被認(rèn)為是最安全的鉻補(bǔ)充劑[11]。

酵母細(xì)胞因其繁殖速度快，吸收金屬能力強(qiáng)，轉(zhuǎn)化快的特點(diǎn)，常被作為微量元素的高效載體。微生物主要通過生物吸附（非代謝依賴型）和生物轉(zhuǎn)化（代謝依賴型）完成對(duì)環(huán)境中金屬離子的吸收及轉(zhuǎn)化。丁文軍[12]利用酵母細(xì)胞富集Cr（Ⅵ）時(shí)發(fā)現(xiàn)酵母細(xì)胞對(duì)Cr（Ⅵ）的富集并非是細(xì)胞表面的物理吸附，無機(jī)鉻還可通過與生物分子的牢固結(jié)合發(fā)生生物轉(zhuǎn)化進(jìn)而形成大量的有機(jī)鉻。其中有機(jī)鉻占細(xì)胞總鉻的84%，未發(fā)生轉(zhuǎn)化的無機(jī)鉻僅占16%，其中 Cr（Ⅲ）為232 μg/g，Cr（Ⅵ）為24.5 μg/g。丁文軍[13]認(rèn)為Cr（Ⅵ）通過細(xì)胞壁進(jìn)入細(xì)胞后，80%的鉻存在于原生質(zhì)體內(nèi)。楊峰等[14]的研究表明釀酒酵母各組分對(duì)Cr6+均有一定的吸附作用，說明菌體對(duì)金屬的吸附是胞外吸附和胞內(nèi)積累并存，而細(xì)胞壁的鉻吸附量都明顯高于完整細(xì)胞，并且用X-射線衍射和傅里葉轉(zhuǎn)換紅外光譜（FTIR）分析表明菌體對(duì)鉻的吸附并未破壞其本身的結(jié)構(gòu)。

前期研究已通過航天誘變及地面人工誘變選育出高產(chǎn)GTF的酵母菌株YSI-3.7，動(dòng)物試驗(yàn)表明該酵母源GTF可有效改善動(dòng)物的葡萄糖代謝[15-16]。本文擬在此基礎(chǔ)上，以實(shí)驗(yàn)室保藏YSI-3.7為研究對(duì)象，利用電鏡觀察吸附Cr3+前、后的酵母細(xì)胞形態(tài)變化；采用EDTA洗脫、原生質(zhì)體制備法將富鉻酵母細(xì)胞分成不同組分，利用火焰原子吸收法測(cè)定不同部位的鉻含量；最后利用EDSTEM和TOF-SIMS對(duì)富鉻細(xì)胞從不同深度、橫截面不同部位分析鉻在其中的含量和分布，最后二者印證分析鉻在細(xì)胞中的空間分布。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 菌種 釀酒酵母YSI-3.7保藏于中國(guó)農(nóng)業(yè)科學(xué)院農(nóng)產(chǎn)品加工研究所乳品加工研究室。

1.1.2 試劑 大豆蛋白胨和酵母浸粉，北京奧博星生物技術(shù)公司；葡萄糖、過硫酸銨和乙二胺四乙酸（EDTA），國(guó)藥集團(tuán)；硝酸、氨水和高氯酸，上海晶純科技公司；酵母破壁酶，北京索萊寶公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平TB-214，美國(guó)DENVER公司；恒溫培養(yǎng)振蕩器，上海世平實(shí)驗(yàn)設(shè)備公司；高速冷凍離心機(jī)，德國(guó)SiGMA公司；微波消解儀，上海新儀微波化學(xué)科技公司；LGJ-25C凍干機(jī)，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；雙光束原子吸收分光光度計(jì)，日本島津公司；SU-8010型掃描電子顯微鏡和透射電子顯微鏡Hitachi H-7500，日本hitachi公司；Oxford X-max N80T EDS-能譜儀，英國(guó)牛津儀器公司；飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜儀TOF-SIMS 5-100，德國(guó)ION-TOF GmbH公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 培養(yǎng)基的制備 YPD培養(yǎng)基：大豆蛋白胨20 g，葡萄糖 20 g，酵母浸粉 10 g，蒸餾水 1 L，pH 5.8，121℃，15 min 滅菌。

1.3.2 YSI-3.7培養(yǎng)方法 將篩選出的富鉻能力最強(qiáng)、生物量最大的釀酒酵母YSI-3.7單菌落（有機(jī)鉻含量 1 033.91 μg/g·DCW，總鉻含量 1 603.87 μg/g·DCW，生物量 1.041 g/100 mL）置于 YPD 培養(yǎng)基中培養(yǎng)至第3代，然后以體積分?jǐn)?shù)10%接種量分別接種于 Cr3+質(zhì)量濃度為0，200，500，800 μg/mL YPD培養(yǎng)基中，于恒溫培養(yǎng)振蕩器中28℃，200 r/min培養(yǎng)44 h。4℃，6 000 r/min離心10 min獲得菌體，用無菌水洗滌3次，稱其濕重，-60℃冷凍干燥48 h后稱其干重。利用火焰原子吸收法測(cè)其有機(jī)鉻和總鉻的含量。

1.3.3 有機(jī)鉻、總鉻含量的測(cè)定

1.3.3.1 有機(jī)鉻測(cè)定方法 稱取0.1 g凍干菌粉，溶于0.1 mol/L氨水溶液中，將其置于37℃、200 r/min恒溫培養(yǎng)振蕩器中提取3 h。然后4℃下、5 000 r/min離心10 min，收集上清液于溶樣杯中，加入6 mL濃硝酸。將其置于加熱板上，160℃預(yù)加熱30 min，再加入0.5 mL高氯酸和5 mL 5%（質(zhì)量分?jǐn)?shù)）的過硫酸銨，進(jìn)行微波消解，參數(shù)如表1所示。消解完全后用10%NH4Cl溶液定容至25 mL，參照 GB/T15555.6-1995火焰原子吸收光譜法測(cè)定消化液中有機(jī)鉻含量。

1.3.3.2 總鉻測(cè)定方法 稱取0.1 g凍干菌粉于溶樣杯中，微波消解，方法同1.3.3.1節(jié)所述。

表1 微波消解儀消化參數(shù)表Table1 Parameters of microwave digestion instrument

1.3.4 鉻對(duì)酵母形態(tài)的影響

1.3.4.1 掃描電鏡觀察酵母形態(tài) 離心收集不同Cr3+質(zhì)量濃度（0，200，500，800 μg/mL）YPD 培養(yǎng)基中培養(yǎng)44 h的YSI-3.7菌體，用無菌水洗滌3次，離心收集菌體。取適量菌體進(jìn)行固定液固定，乙醇梯度脫水，干燥、粘臺(tái)、噴金，最后置于掃描電子顯微鏡樣品室中，以10 kV觀測(cè)電壓進(jìn)行電鏡觀察。

1.3.4.2 透射電鏡觀察酵母形態(tài) 將YSI-3.7進(jìn)行固定，LR-white樹脂包埋，樹脂膠囊修塊，切成90～120 nm厚度的超薄切片，鎳網(wǎng)撈片，最后用鋨酸染色后在透射電子顯微鏡下用80 V加速電壓觀察細(xì)胞形態(tài)。

1.3.5 鉻在酵母細(xì)胞中的分布

1.3.5.1 EDTA洗脫法 火焰原子吸收法測(cè)得EDTA洗脫液中的鉻為細(xì)胞壁中的鉻，菌體沉淀中的鉻為原生質(zhì)體中的鉻。

圖1 EDTA洗脫菌體及不同部位鉻含量流程圖Fig.1 The flow chart of EDTA elution of YSI-3.7 and its determination of chromium content

1.3.5.2 原生質(zhì)體制備法 選擇在質(zhì)量濃度為500 μg/mL Cr3+YPD培養(yǎng)基中培養(yǎng)44 h的YSI-3.7為樣品，用高滲液（0.3 mol/L NaCl+0.3 mol/L蔗糖，蒸餾水配制）洗滌2次，棄上清。加入經(jīng)35℃預(yù)溫的酵母破壁酶溶液，每10 mL細(xì)胞培養(yǎng)液中加入75 μL酵母破壁酶，1 410 μL山梨醇緩沖液，再加入 15 μL β-巰基乙醇，37 ℃處理 2 h。 在顯微鏡鏡下檢查其原生質(zhì)體生成率。然后于4 000 r/min離心5 min，棄上清；用高滲液重懸，再次離心，鏡檢至沒有雜質(zhì)。將原生質(zhì)體重懸于40 mL高滲液備用。利用火焰原子吸收法，分別測(cè)定全細(xì)胞、原生質(zhì)體及細(xì)胞壁中鉻含量。

原生質(zhì)體生成率=（A-C）/A×100%

式中，A——破壁處理后高滲液在顯微鏡視野下所統(tǒng)計(jì)的菌數(shù)；C——破壁的菌液在無菌水中靜置20 min后在顯微鏡視野下所統(tǒng)計(jì)的菌數(shù)。

1.3.6 利用能譜及質(zhì)譜方法檢測(cè)酵母菌體中鉻分布

1.3.6.1 能譜分析儀-透射電子顯微鏡（EDSTEM）測(cè)定 將 500 μg/mL和800 μg/mL Cr3+YPD中培養(yǎng)44 h的YSI-3.7制成100 nm的超薄切片。將切片置于EDS能譜分析儀中，在200 kV電壓下，采用點(diǎn)分析方法分析其顯微結(jié)構(gòu)中鉻的分布。

1.3.6.2 飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜儀（TOF-SIMS）測(cè)定 利用TOF-SIMS[17]測(cè)定鉻在YSI-3.7顯微空間的分布。將500 μg/mL Cr3+YPD中培養(yǎng)的菌體的凍干菌粉，在銅雙面膠上粘成薄薄一層，置于TOF-SIMS 5-100中，一次離子束是 Bi1+，30 keV，45°入射，掃描面積 150 μm2，濺射離子束是 Ar2500+團(tuán)簇離子，10 keV，11.06 nA。濺射速率以SiO210倍速率估算為2.26 nm/s。

2 結(jié)果與分析

2.1 不同Cr3+ 質(zhì)量濃度下YSI-3.7生長(zhǎng)及富鉻情況

如表2所示，隨著Cr3+質(zhì)量濃度的升高，酵母富集鉻的總量升高，而酵母的生物量下降。相比于500 μg/mL Cr3+質(zhì)量濃度，800 μg/mL Cr3+質(zhì)量濃度培養(yǎng)下的酵母總鉻少量增加，生物量降低較為嚴(yán)重，有機(jī)鉻率僅為29.62%。因此，500 μg/mL Cr3+質(zhì)量濃度為YSI-3.7富鉻形成GTF的最適質(zhì)量濃度。

表2 Cr3+ 質(zhì)量濃度對(duì)酵母YSI-3.7生長(zhǎng)及其富鉻量的影響Table2 Effect of various Cr3+ mass concentrations on YSI-3.7 growth and its chromium enrichment

如圖2所示，隨著YPD培養(yǎng)基中Cr3+質(zhì)量濃度的升高，YSI-3.7生長(zhǎng)達(dá)到穩(wěn)定期的時(shí)間推遲；并且Cr3+質(zhì)量濃度升高，延遲時(shí)間增加。在未添加Cr3+的YPD培養(yǎng)基中，YSI-3.7培養(yǎng)約5 h即可達(dá)到穩(wěn)定期。在含200 μg/mL Cr3+質(zhì)量濃度的培養(yǎng)基中，YSI-3.7到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)間與未添加Cr3+相近，由OD值可知，二者到達(dá)穩(wěn)定期時(shí)的菌質(zhì)量濃度也相近。而在含500 μg/mL Cr3+質(zhì)量濃度培養(yǎng)的YSI-3.7到達(dá)穩(wěn)定期所需時(shí)間較未添加Cr3+推遲2 h，且菌體終質(zhì)量濃度較低。在800 μg/mL Cr3+中，YSI-3.7直至14 h時(shí)以后才達(dá)到穩(wěn)定期，并且此時(shí)的菌體質(zhì)量濃度明顯低于前3組。由以上結(jié)果可知，Cr3+質(zhì)量濃度為500 μg/mL 時(shí)，對(duì)YSI-3.7富鉻形成GTF最有利。

圖2 不同Cr3+ 質(zhì)量濃度下YSI-3.7酵母生長(zhǎng)曲線Fig.2 The growth curve of YSI-3.7 at various Cr3+ mass concentration

2.2 富鉻前、后酵母的形態(tài)變化

如圖3所示，未加Cr3+培養(yǎng)的YSI-3.7（圖3a）形狀是規(guī)則的橢圓形，立體形狀飽滿，無性繁殖方式為芽殖。在200 μg/mL Cr3+處理的酵母細(xì)胞表面沒有顯著變化，胞體上有多個(gè)芽痕，說明在此質(zhì)量濃度下，酵母的出芽繁殖活動(dòng)并沒有受到顯著影響。由酵母表面出現(xiàn)芽痕的數(shù)量，可以大體判斷菌齡，而由上圖看出，200 μg/mL Cr3+處理的具有相同菌齡的YSI-3.7相對(duì)于空白處理細(xì)胞，形狀變長(zhǎng)。 Cr3+質(zhì)量濃度增加（500 μg/mL）酵母細(xì)胞形狀變得更長(zhǎng)，且表面出現(xiàn)了沉淀，推測(cè)是Cr3+在酵母細(xì)胞壁上富集。同樣，800 μg/mL Cr3+質(zhì)量濃度時(shí)，酵母細(xì)胞形變加劇，表面富集更多的沉淀。然而，圖中各個(gè)Cr3+質(zhì)量濃度條件下，YSI-3.7細(xì)胞壁均未受到明顯破壞，都有一個(gè)至多個(gè)芽痕出現(xiàn)，說明在上述Cr3+質(zhì)量濃度下，YSI-3.7可以正常繁殖。

由圖4可知，未加Cr3+處理的YSI-3.7細(xì)胞呈較規(guī)則的橢圓形，并且鋨酸染色比較均勻，細(xì)胞核較小，線粒體沿著細(xì)胞輪廓均勻地排布在細(xì)胞膜內(nèi)側(cè)；200 μg/mL Cr3+處理的YSI-3.7也是呈橢圓形，細(xì)胞稍微拉長(zhǎng)，細(xì)胞核變大，并且細(xì)胞核周圍出現(xiàn)白色空泡；當(dāng)Cr3+質(zhì)量濃度增加至500 μg/mL和800 μg/mL時(shí)，細(xì)胞變成了更細(xì)長(zhǎng)的無規(guī)則的形狀，并且細(xì)胞核中出現(xiàn)的空泡更多更大。隨著Cr3+質(zhì)量濃度的升高，YSI-3.7細(xì)胞的形狀變長(zhǎng)，細(xì)胞壁逐漸變薄，并且內(nèi)部出現(xiàn)空泡的數(shù)目越來越多，破壞主要集中在細(xì)胞核上，細(xì)胞核更容易被高質(zhì)量濃度的鉻破壞。推測(cè)這與核膜通透性（核孔40～70 nm）比其它生物膜大有關(guān)。

圖3 不同質(zhì)量濃度Cr3+ 培養(yǎng)的酵母YSI-3.7菌體掃描電鏡圖Fig.3 Scanning electron microscopy（SEM）of YSI-3.7 cultivated at various mass concentrations of Cr3+

微生物對(duì)有害物質(zhì)和環(huán)境改變有一定的適應(yīng)性和抵抗力。作為一種重金屬，鉻對(duì)微生物具有一定毒性。鉻離子為800 μg/mL時(shí)，嚴(yán)重抑制菌體的生長(zhǎng)；400 μg/mL時(shí)，對(duì)菌體有一定的刺激生長(zhǎng)作用[18]。葉錦韶等[19]在研究酵母對(duì)重金屬鉻的吸附作用時(shí)發(fā)現(xiàn)環(huán)境中的某些重金屬在低濃度時(shí)對(duì)微生物有利，因?yàn)檫@些金屬是微生物細(xì)胞中的某些酶的必需成分；但當(dāng)重金屬含量超過其臨界濃度時(shí)，對(duì)微生物具有毒性，甚至?xí)⑺牢⑸?。從富鉻酵母掃描電鏡圖看出，酵母在無鉻或者低鉻（200 μg/mL）培養(yǎng)時(shí)，酵母狀態(tài)飽滿，細(xì)胞壁光滑沒有沉淀出現(xiàn)，生長(zhǎng)曲線趨勢(shì)類似；隨著鉻質(zhì)量濃度增加（500～800 μg/mL），酵母細(xì)胞壁上開始出現(xiàn)沉淀。本研究推測(cè)有可能是鉻與酵母細(xì)胞壁的多糖或者菌體分泌出蛋白質(zhì)、脂類等生物大分子結(jié)合，形成顆粒物附著于細(xì)胞表面；或者是高質(zhì)量濃度的鉻對(duì)菌體表面形成一定的破壞作用。張曉青等[20]研究酵母吸附鉛，發(fā)現(xiàn)吸附前的酵母菌為橢圓形結(jié)構(gòu)，且形態(tài)規(guī)則整齊；吸附后的酵母菌表面粗糙，凹凸不平。說明細(xì)胞表面的物質(zhì)與Pb2+發(fā)生了作用，生成沉淀物附著在細(xì)胞壁上，引起細(xì)胞形態(tài)變化。本研究中Cr3+對(duì)YSI-3.7作用與Pb2+對(duì)其細(xì)胞表面作用類似。湯曉燕[21]利用細(xì)胞表面展示蛋白（a-凝集素）將金屬硫蛋白表達(dá)在酵母細(xì)胞表面，研究酵母細(xì)胞對(duì)重金屬的吸附機(jī)理時(shí)發(fā)現(xiàn)酵母吸附Cr6+后，金屬硫蛋白細(xì)胞表面展示菌體表面皺縮程度及菌體凹陷程度要遠(yuǎn)小于對(duì)照菌株，表明金屬硫蛋白對(duì)于酵母菌抵制重金屬的毒害作用具有重要影響。

由前人研究可知，重金屬離子必須要進(jìn)入到細(xì)胞后才有生理作用或毒害作用。大部分細(xì)胞可采用兩類重金屬離子吸收系統(tǒng)[22]：一類是快速吸收，即通常僅靠化學(xué)滲透離子梯度或質(zhì)子驅(qū)動(dòng)勢(shì)，低能量消耗即把金屬離子轉(zhuǎn)運(yùn)通過細(xì)胞質(zhì)膜的金屬離子吸收系統(tǒng)。另一類是緩慢吸收，借助ATP水解作為能量或有時(shí)借用化學(xué)滲透梯度需要耗費(fèi)能量的金屬離子吸收系統(tǒng)。富鉻酵母的透射電鏡圖顯示：當(dāng) Cr3+低質(zhì)量濃度時(shí)（≤200 μg/mL），進(jìn)入酵母的鉻對(duì)于酵母內(nèi)部沒有產(chǎn)生可見的破壞；隨著質(zhì)量濃度增加（達(dá)到 500，800 μg/mL），對(duì)酵母內(nèi)部產(chǎn)生了很大程度的破壞，出現(xiàn)了空洞，并且主要集中在細(xì)胞核附近。這主要是因?yàn)楫?dāng)環(huán)境中存在低質(zhì)量濃度Cr3+，微生物可以通過自身的解毒機(jī)制減輕對(duì)Cr3+的攝取，增加細(xì)胞內(nèi)Cr3+的排放，進(jìn)而達(dá)到控制胞內(nèi)Cr3+毒性的作用；當(dāng)環(huán)境中存在高質(zhì)量濃度Cr3+時(shí)，大量重金屬鉻進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)部，可對(duì)胞內(nèi)的大分子產(chǎn)生嚴(yán)重破壞，且菌體內(nèi)大量維持細(xì)胞結(jié)構(gòu)的陽(yáng)離子向體外擴(kuò)散，細(xì)胞結(jié)構(gòu)被破壞，產(chǎn)生空殼甚至裂解等現(xiàn)象[23]。

圖4 不同質(zhì)量濃度Cr3+ 培養(yǎng)的酵母菌體透射電鏡圖Fig.4 Transmission electron microscopy（TEM）of YSI-3.7 cultivated at various mass concentrations of Cr3+

2.3 利用EDTA洗脫法和酶解處理對(duì)比分析鉻在酵母細(xì)胞中的分布

2.3.1 EDTA溶液洗脫法 利用濃度為0.2 mol/L EDTA溶液洗滌凍干菌粉，洗脫液中Cr3+的含量隨著洗脫次數(shù)的增加而降低，持續(xù)洗脫至第4次時(shí)，洗脫液中檢測(cè)不到Cr3+，表明洗脫完全。洗脫過程中各部分鉻含量所代表的酵母細(xì)胞部位如圖1所示。

由表3可知，菌粉中有機(jī)鉻含量占總鉻的52.95%，細(xì)胞壁中鉻的含量占到總鉻含量的9.8%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于原生質(zhì)體所占的87.43%。這說明YSI-3.7吸附的Cr3+大部分聚集在原生質(zhì)體中。另外，原生質(zhì)體中有機(jī)鉻分別占原生質(zhì)體中總鉻含量的48.62%，與整個(gè)酵母細(xì)胞中有機(jī)鉻占總鉻含量百分比接近。推測(cè)細(xì)胞壁中吸附的大部分鉻為無機(jī)鉻，有機(jī)鉻基本存在于原生質(zhì)體中。

表3 利用EDTA洗脫法分析酵母不同部位鉻含量Table3 The analysis of chromium content in different parts of YSI-3.7 by EDTA elution

2.3.2 原生質(zhì)體制備法 酵母破壁酶含量為75 μL，山梨醇緩沖液體積為1 410 μL，β-巰基乙醇體積為15 μL，37℃處理菌體2 h，此時(shí)酵母細(xì)胞原生質(zhì)體生成率可達(dá)97%。

如表4所示，YSI-3.7中富集的有機(jī)鉻含量占總鉻百分比在52.77%～57.55%之間，細(xì)胞壁中的鉻含量占整個(gè)細(xì)胞富集的總鉻含量的13.55%～15.79%，遠(yuǎn)遠(yuǎn)小于原生質(zhì)體所占的73.26%～76.62%。同樣說明YSI-3.7吸附的Cr3+大部分聚集在原生質(zhì)體中，細(xì)胞壁中只占一小部分。由于YSI-3.7細(xì)胞壁只占酵母細(xì)胞重量的18%～30%，故酵母中細(xì)胞壁和原生質(zhì)體中鉻分布基本是均勻的。另外，原生質(zhì)體中有機(jī)鉻分別占原生質(zhì)體總鉻含量的71.46%～75.58%，也說明，細(xì)胞壁中吸附的大部分鉻為無機(jī)鉻，而有機(jī)鉻的形成大部分在原生質(zhì)體中。

表4 利用酶解法分析酵母不同部位鉻含量Table4 The analysis of chromium content in different parts of YSI-3.7 by enzymatic hydrolysis

2.4 利用能譜、質(zhì)譜學(xué)方法檢測(cè)酵母菌體中Cr分布

2.4.1 透射電子顯微鏡-能譜分析（TEM-EDS）測(cè)定 將 于 500 μg/mL Cr3+和800 μg/mL Cr3+的YPD培養(yǎng)基培養(yǎng)44 h的YSI-3.7進(jìn)行清洗、干燥、超薄切片，置于透射電鏡下觀察細(xì)胞形態(tài)并選擇測(cè)定點(diǎn)，利用EDS能譜儀進(jìn)行細(xì)胞中鉻的能譜分析。例如，圖5a中所選點(diǎn)500-1的譜圖如圖6所示，選定所關(guān)注元素種類，可以看出Cr在其中所占的比例。單一鉻峰強(qiáng)度可以半定量表示鉻質(zhì)量濃度。如圖5所示，圖中標(biāo)注的紅色數(shù)字表示該點(diǎn)Cr元素的峰強(qiáng)度，可近似為Cr質(zhì)量濃度之比。圖5a為0.051～0.054，圖5b為0.08～0.09。隨著培養(yǎng)液中Cr3+質(zhì)量濃度增加，能譜圖中Cr的峰值增加。同時(shí)，由圖6顯示同一Cr3+質(zhì)量濃度處理下的酵母細(xì)胞壁及原生質(zhì)體中各部位質(zhì)量濃度差異不大，說明鉻在酵母中的分布基本是均勻的。這與EDTA洗脫法以及酶解制備原生質(zhì)體的方法測(cè)得細(xì)胞壁及原生質(zhì)體Cr含量的結(jié)果相吻合。

圖5 富鉻酵母EDS-TEM圖Fig.5 The EDS-TEM of chromium yeast

圖6 點(diǎn)500-1能譜圖Fig.6 The EDS-TEM of the 500-1 spot

2.4.2 飛行時(shí)間二次離子質(zhì)譜儀（TOF-SIMS）測(cè)定 通過TOF-SIMS技術(shù)對(duì)YSI-3.7細(xì)胞中Cr進(jìn)行空間分布的解析。本研究中測(cè)定時(shí)間共為1 500 s，對(duì)YSI-3.7樣品的剖析深度達(dá)3.4 μm～6.8 μm。釀酒酵母在電鏡下顯示為橢圓狀，長(zhǎng)軸為5～13 μm，短軸為3～6 μm[24]。 本研究利用 TOFSIMS對(duì)酵母細(xì)胞的深度剖析，所測(cè)深度已貫穿細(xì)胞短軸，貫穿細(xì)胞長(zhǎng)軸的一半以上的距離。

圖7 氨水提取前、后酵母中鉻分布TOF-SIMS譜圖Fig.7 Mass spectrometer TOF-SIMS of chromium distribution in YSI-3.7 with or without ammonium extraction process

如圖7所示，由于300 s以后鉻峰強(qiáng)度曲線變化不大，故截取了縱向剖析測(cè)定時(shí)間的前300 s，圖7中未經(jīng)氨水洗滌處理的曲線顯示，酵母中鉻吸收峰在前20 s處于上升階段（此時(shí)剖析深度為0～50 nm），Cr吸收峰迅速增加，推測(cè)是YSI-3.7表面的雜質(zhì)干擾了Cr的測(cè)定。測(cè)定時(shí)間為150 s時(shí)，此時(shí)剖析深度在0.3 μm左右，基本已貫穿酵母細(xì)胞壁（酵母細(xì)胞壁厚度為0.1～0.3 μm，細(xì)胞壁重量占細(xì)胞干重的18%～30%）[25]；150 s后測(cè)定深度已達(dá)酵母原生質(zhì)體。由圖7可知隨著剖析深度的增加（20～1 500 s），酵母細(xì)胞中的Cr吸收峰的變化不明顯，表明Cr在酵母菌體內(nèi)基本是均勻分布的。

利用氨水可以提取酵母中的有機(jī)鉻，殘留在酵母菌體的鉻多為無機(jī)鉻。本研究利用TOF-SIMS技術(shù)對(duì)氨水提取有機(jī)鉻后的YSI-3.7菌體中殘余鉻的分布進(jìn)行了深入分析。圖8中氨水洗滌樣TOF-SIMS譜圖曲線顯示，氨水提取可顯著降低YSI-3.7菌體中有機(jī)鉻含量，約減少70%～80%；而殘余鉻在酵母中的分布仍是均勻的。整體來看，無論提取前、后，細(xì)胞中不同深度斷層面上鉻的分布基本均勻。氨水處理后，樣品檢測(cè)初期，其鉻強(qiáng)度從高值在短期內(nèi)顯著下降，主要?dú)w因于氨水只是能有效提取酵母原生質(zhì)體中的有機(jī)鉻，而對(duì)細(xì)胞壁中的鉻沒有提取出來，因此鉻強(qiáng)度表現(xiàn)為高強(qiáng)峰值。所以推斷細(xì)胞壁上吸附的鉻主要為無機(jī)鉻，不被氨水提??；隨著探測(cè)深度的不斷深入，原生質(zhì)體鉻含量整體降低，而降幅平緩。

前人研究結(jié)果顯示，微生物對(duì)重金屬的富集一般分為生物吸附和生物轉(zhuǎn)化兩個(gè)類型，即被動(dòng)吸附過程和主動(dòng)轉(zhuǎn)化過程[26]。本研究利用EDTA洗脫和原生質(zhì)體酶法處理菌體，即對(duì)酵母細(xì)胞中不同部位的鉻進(jìn)行洗脫、分離，以火焰原子吸收法測(cè)定不同部位的鉻含量。結(jié)果顯示，酵母細(xì)胞壁和原生質(zhì)體中均有鉻的存在，并且原生質(zhì)體中大部分為有機(jī)鉻。另外，有研究證明，重金屬離子進(jìn)入胞內(nèi)，它將進(jìn)入不同的細(xì)胞器，如線粒體和液泡[27]。液泡可起到調(diào)控胞質(zhì)內(nèi)機(jī)體代謝所必需的金屬離子濃度和解除金屬離子毒害的作用，比如菌體某些多肽可螯合 Mn2+、Fe2+、Zn2+、Ni2+、Li+等金屬離子并將其隔離貯存在液泡內(nèi)，解除其對(duì)細(xì)胞的毒害。Martinag等[28]指出重金屬吸收到胞內(nèi)的機(jī)制主要分2種：（1）與重金屬離子形成不同的包涵體；（2）使重金屬離子與胞內(nèi)富含半胱氨酸的熱穩(wěn)定的低分子量蛋白，即金屬硫蛋白結(jié)合。金屬硫蛋白普遍存在于真菌細(xì)胞內(nèi)[29]，且大多數(shù)金屬硫蛋白需要在金屬離子的誘導(dǎo)下產(chǎn)生[30]。利用傅立葉變換紅外光譜法分析重金屬離子與絮凝酵母細(xì)胞表面基團(tuán)相互作用的結(jié)果表明，與Cr6+相互作用的細(xì)胞表面基團(tuán)為酰胺和羥基基團(tuán)；與Cu2+相互作用的細(xì)胞表面基團(tuán)為羥基、氨基、羧基和酰胺基團(tuán)；與Cd2+相互作用的細(xì)胞表面基團(tuán)為羥基、氨基、酰胺、羧基和磷酸基[31]。酵母體內(nèi)還有其它物質(zhì)對(duì)細(xì)胞內(nèi)富集重金屬發(fā)揮作用，如谷胱甘肽[32]，它是低分子量的硫醇，是一個(gè)內(nèi)生的硫磺和氮的存儲(chǔ)器，可緩解重金屬毒害作用。菌體液泡對(duì)Zn2+、Mn2+、Co3+和Ni4+有著很強(qiáng)的吸附性能，酵母在主動(dòng)轉(zhuǎn)運(yùn)富集鉻離子時(shí)，需要把體內(nèi)糖類、蛋白質(zhì)等生物大分子分解為小分子，并釋放出能量，在向體外運(yùn)輸小分子蛋白或其它小分子生物活性物質(zhì)的同時(shí)把鉻轉(zhuǎn)運(yùn)到菌體內(nèi)，而Cr3+進(jìn)入細(xì)胞后主要與蛋白質(zhì)發(fā)生結(jié)合，或氨基酸通過羰基氧原子的配位作用而形成有機(jī)鉻，這是富鉻酵母生成具有生物學(xué)功能GTF的前提[33]。

3 結(jié)論

釀酒酵母富集Cr3+形成GTF過程中，酵母的表面形狀和內(nèi)部結(jié)構(gòu)都會(huì)發(fā)生變化，并隨著Cr3+質(zhì)量濃度的升高而加劇。隨著培養(yǎng)液中Cr3+質(zhì)量濃度的升高，酵母細(xì)胞在電鏡下的形狀由規(guī)則的橢圓形變成長(zhǎng)軸拉長(zhǎng)的橢圓形。酵母細(xì)胞變長(zhǎng)，細(xì)胞壁逐漸變薄且內(nèi)部出現(xiàn)空泡的數(shù)目越來越多，空泡越來越大，主要集中在細(xì)胞核上。當(dāng)Cr3+質(zhì)量濃度為500 μg/mL時(shí)，酵母細(xì)胞吸附的總鉻和有機(jī)鉻含量最高，分別達(dá)到1 803.87 μg/g·DCW和1 133.91 μg/g·DCW。其中細(xì)胞壁上富集的鉻基本為無機(jī)鉻，占菌體富集總鉻的14.43%；原生質(zhì)體上的鉻占酵母富集總鉻的85.57%，其中73.29%主要為有機(jī)鉻。EDS能譜圖和TOF-SIMS圖譜分析結(jié)果顯示，無論是菌體橫截面還是縱深度鉻含量分析，鉻在酵母細(xì)胞中皆呈均勻分布。