黃芳華，陳紅君，唐原君，朱李飛，余自成（．同濟(jì)大學(xué)附屬楊浦醫(yī)院藥學(xué)部，上海 00090；．上海交通大學(xué)附屬第一人民醫(yī)院臨床藥學(xué)科，上海 00080）

丙戊酸制劑是療效較好的一線廣譜抗癲癇藥，特別在老年癲癇患者中使用更為廣泛[1]。但其安全范圍窄，易引起胃腸道、共濟(jì)失調(diào)、甚至肝損傷[2]等不良反應(yīng)，且老年癲癇患者的藥代動(dòng)力學(xué)受生理狀況、并發(fā)疾病以及合并用藥等多種因素影響變異更大，使用丙戊酸制劑更需要測(cè)定血藥濃度，進(jìn)行治療藥物監(jiān)測(cè)（therapeutic drug monitoring，TDM）。丙戊酸血藥濃度的測(cè)定方法目前常用的有免疫法、高效液相色譜法（HPLC）等[3-5]，其方法各有利弊。筆者通過對(duì)HPLC色譜條件和樣品處理方法的改進(jìn)，以ω-溴苯乙酮為丙戊酸的衍生化試劑，環(huán)己烷羧酸為內(nèi)標(biāo)，建立了反相高效液相色譜法測(cè)定丙戊酸的血藥濃度，并成功測(cè)定了64例老年癲癇患者使用丙戊酸制劑的穩(wěn)態(tài)谷濃度，為其個(gè)體化用藥提供了支持。

1 儀器與試藥

1.1 儀器

高效液相色譜系統(tǒng)（Waters）：包括1525二元泵、2489紫外檢測(cè)器、2707自動(dòng)進(jìn)樣器、智能柱溫箱、BreezeTMSoftware色譜工作站；MS204S型電子分析天平（瑞士梅特勒公司）；超純水儀（Synergy UV系統(tǒng)，美國(guó)Millipore公司）；Allegra X-30R超速冷凍離心機(jī)（貝克曼庫(kù)爾特有限公司）；MIXER-UZUSIO VTX-3000 L旋渦混合器（上海飛域國(guó)際貿(mào)易有限公司）。

1.2 試藥

丙戊酸鈉對(duì)照品（中國(guó)食品藥品檢定研究院，批號(hào)：100963-20170606，純度：99.0%）；環(huán)己烷羧酸（西格瑪奧德里奇貿(mào)易有限公司，批號(hào)：101360309，純度：98%）；ω-溴苯乙酮（國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司，批號(hào)：20160215，純度96%）；甲醇（Merck公司，HPLC級(jí)）；水為超純水；其余試劑均為分析純。

2 方法與結(jié)果

2.1 溶液配制

精密稱取丙戊酸鈉對(duì)照品23.51 mg（以丙戊酸計(jì)為20.20 mg），置于10 mL棕色量瓶中，加水溶解并定容，搖勻，即得以丙戊酸計(jì)濃度為2.02 mg·mL-1的對(duì)照品儲(chǔ)備液，-20 ℃冰箱保存。

精密稱取環(huán)己烷羧酸4 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加0.2 mol·L-1氨水溶解并定容，搖勻，即得環(huán)己烷羧酸濃度為0.4 mg·mL-1的內(nèi)標(biāo)儲(chǔ)備液，-20 ℃冰箱保存。

精密稱取ω-溴苯乙酮50 mg，置于10 mL棕色量瓶中，加乙腈溶解并定容，搖勻，既得ω-溴苯乙酮濃度為5 mg·mL-1的衍生化試劑，-20 ℃冰箱保存。

2.2 色譜條件

色譜柱：Phenomenex C18柱（250 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：甲醇:水= 82∶18（V∶V），等度洗脫；流速1 mL·mL-1；檢測(cè)波長(zhǎng)248 nm；柱溫35 ℃；進(jìn)樣時(shí)間10 min；進(jìn)樣量20 μL；內(nèi)標(biāo)為環(huán)己烷羧酸。

2.3 血清樣品預(yù)處理

精密吸取取樣品血清100 μL，加內(nèi)標(biāo)液環(huán)己烷羧酸（0.4 mg·mL-1）50 μL后，再加1 mol·L-1的硫酸100 μL，混合搖勻，加入正己烷1 mL，于藥用振蕩器振搖10 min，13 000 r·min-1，20 ℃，離心5 min，精密吸取上清液860 μL，轉(zhuǎn)移至另一干凈試管中，加入20 μL的衍生化試劑（5 mg·mL-1的ω-溴苯乙酮）和10 μL堿化試劑（20%三乙胺），搖勻，置60 ℃水浴衍生化反應(yīng)10 min，氮?dú)獯蹈?。殘?jiān)苡?20 μL流動(dòng)相中，渦旋30 s，13 000 r·min-1，20 ℃，離心5 min，取20 μL進(jìn)樣分析。

2.4 方法學(xué)驗(yàn)證

2.4.1 方法專屬性 在本實(shí)驗(yàn)條件下，丙戊酸衍生物與內(nèi)標(biāo)衍生物能夠得到良好的分離，丙戊酸及內(nèi)標(biāo)衍生物的保留時(shí)間分別為（8.63±0.14）min和（6.15±0.11）min，樣品峰型良好。在此條件下，血清內(nèi)源性物質(zhì)以及臨床可能合用的苯妥英鈉、苯巴比妥、卡馬西平、艾司唑侖等藥物對(duì)本法測(cè)定均無干擾，具有較好的特異性。色譜圖見圖1。

圖1 HPLC色譜圖A - 空白血清，B -空白血清+丙戊酸+內(nèi)標(biāo)，C -患者服用丙戊酸后的血清樣品；1 -內(nèi)標(biāo)，2 -丙戊酸Fig 1 HPLC chromatogramsA - blank serum, B - blank serum + valproic acid + IS, C - patient's serum after valproic acid administration; 1 - IS; 2 - valproic acid

2.4.2 標(biāo)準(zhǔn)曲線與定量下限 精密吸取“2.1溶液配制”項(xiàng)下丙戊酸鈉對(duì)照品溶液。用空白血清配制成含丙戊酸濃度為1.01、2.02、5.05、10.10、20.20、50.50、101.00、202.00 μg·mL-1的標(biāo)準(zhǔn)血清樣品，按上述“2.3血清樣品預(yù)處理”方法操作后進(jìn)樣測(cè)定。分別以丙戊酸衍生物的峰面積與內(nèi)標(biāo)衍生物峰面積的比值（As/Ai）對(duì)應(yīng)丙戊酸質(zhì)量濃度（C）進(jìn)行線性回歸，得丙戊酸濃度測(cè)定的標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為：As/Ai= 2.23×10-3C + 1.17×10-2，r2= 0.999 5（n = 5，每個(gè)點(diǎn)取5份溶液測(cè)定取平均值）。結(jié)果表明，丙戊酸濃度在1.01 ～ 202.00 μg·mL-1范圍內(nèi)測(cè)定線性關(guān)系良好。配制一定濃度的丙戊酸樣品，按基線噪音的3倍為檢測(cè)限，測(cè)得丙戊酸的檢測(cè)限為 0.505 μg·mL-1。

2.4.3 回收率與精密度 按“2.4.2”項(xiàng)下方法配制含丙戊酸濃度分別為2.02、20.20、161.60 μg·mL-1的低、中、高三種濃度的質(zhì)控樣品，每個(gè)濃度平行配制5份，按上述“2.3”項(xiàng)下方法操作后進(jìn)樣測(cè)定。由實(shí)測(cè)濃度與配制濃度的比值計(jì)算回收率，并計(jì)算日內(nèi)精密度。將低、中、高三個(gè)濃度的質(zhì)控樣品連續(xù)五天進(jìn)行測(cè)定，每次每個(gè)濃度測(cè)定五份，計(jì)算日間精密度。結(jié)果見表1。

表1 HPLC法測(cè)定人血清中丙戊酸的方法回收率和精密度. n = 5Tab 1 Method recovery and precision of valproic acid determination in human serum. n = 5

2.4.4 穩(wěn)定性試驗(yàn) 本實(shí)驗(yàn)主要考察了丙戊酸質(zhì)控血清樣品室溫放置12 h、反復(fù)凍融3次、密封低溫保存（-70 ℃）1個(gè)月的穩(wěn)定性。取低、中、高濃度的質(zhì)控血清樣品進(jìn)行穩(wěn)定性試驗(yàn)，進(jìn)樣測(cè)定，每次平行測(cè)定5份樣品。結(jié)果表明，丙戊酸血清樣品在室溫放置4 h、預(yù)處理后自動(dòng)進(jìn)樣器放置12 h、凍融3次和密封低溫保存（-70 ℃）3個(gè)月等條件下回收率均為85% ～115%，RSD均＜ 15%。

2.5 臨床應(yīng)用

選擇我院神經(jīng)內(nèi)科服用丙戊酸制劑的癲癇患者64例，其中男性27例，女性37例，平均年齡（71.08±13.47）歲，患者服用丙戊酸制劑達(dá)穩(wěn)態(tài)血藥濃度后（5 ～ 7個(gè)半衰期），采集谷濃度使用本方法進(jìn)行測(cè)定。丙戊酸有效血藥濃度參考范圍為50 ～ 100 μg·mL-1，小于50 μg·mL-1為低于有效濃度范圍，大于100 μg·mL-1為中毒濃度范圍，64例患者丙戊酸血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果見表2。結(jié)果表明，丙戊酸治療窗較窄，在患者服用該藥期間應(yīng)密切關(guān)注其血藥濃度，以期達(dá)到個(gè)體化給藥的目的。

表2 64例患者血清中丙戊酸濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果Tab 2 Results of serum concentration of valproic acid in 64 epileptic patients

3 討論

由于丙戊酸分子結(jié)構(gòu)中不含有紫外特征吸收基團(tuán)，難以用高效液相色譜法直接測(cè)定。因此，本研究參考相關(guān)文獻(xiàn)[6-7]，在三乙胺的催化條件下，以環(huán)己烷羧酸為內(nèi)標(biāo)，將樣品中加入ω-溴苯乙酮進(jìn)行衍生化反應(yīng)，使其連接上紫外吸收的基團(tuán)。為了提高檢測(cè)的靈敏度，筆者對(duì)衍生化試劑和催化劑的濃度、用量、衍生時(shí)間等進(jìn)行摸索，最終確定衍生化試劑選擇5 mg·mL-1的ω-溴苯乙酮，加入量為20 μL，催化劑選擇20%三乙胺，加入量10 μL，衍生時(shí)間10 min，此時(shí)反應(yīng)完全徹底，衍生化效率最高，結(jié)果穩(wěn)定可靠；衍生產(chǎn)物采用正己烷提取，氮?dú)獯蹈桑粡?fù)溶進(jìn)樣后，在優(yōu)化的色譜條件下，峰形以及分離度良好，且保留時(shí)間均小于10 min，有機(jī)流動(dòng)相使用甲醇，該方法具有低成本、高效的優(yōu)點(diǎn)。

用本法監(jiān)測(cè)了我院老年癲癇患者常規(guī)劑量或經(jīng)驗(yàn)醫(yī)囑使用丙戊酸制劑后的穩(wěn)態(tài)血藥谷濃度，結(jié)果顯示濃度范圍為11.5 ～ 137.0 μg·mL-1，相差可達(dá)10倍之多，有效治療范圍內(nèi)的僅占總數(shù)的40.63%，其中2例患者未能有效控制癲癇癥狀，5例患者出現(xiàn)皮疹、惡心等輕度不良反應(yīng)；有42.19%的患者血藥濃度未達(dá)到有效濃度范圍，其中19例癲癇癥狀控制不佳，4例主訴惡心，自行停藥；在超過有效血藥濃度的11例患者中，有1例癲癇癥狀不能控制，6例出現(xiàn)惡心、皮疹、嗜睡、肝轉(zhuǎn)氨酶升高等輕度不良反應(yīng)，1例出現(xiàn)惡性發(fā)熱及肝功能損害，不良反應(yīng)發(fā)生率達(dá)73%，且存在嚴(yán)重不良反應(yīng)。表明老年癲癇患者在常規(guī)劑量或經(jīng)驗(yàn)醫(yī)囑下使用丙戊酸鈉的體內(nèi)藥動(dòng)學(xué)差異更大[8]，其療效以及不良反應(yīng)的發(fā)生與血藥濃度之間存在較好的相關(guān)性。

老年癲癇患者本身生理情況與兒童、青年等群體有明顯差異，又多同時(shí)患有多種基礎(chǔ)疾病，如本法監(jiān)測(cè)的64例患者中，2/3的患者同時(shí)患有心腦血管疾病，長(zhǎng)期合并使用降壓藥、降糖藥、調(diào)血脂藥、抗血小板藥、抗凝藥、 中成藥等，患者用藥依從性不佳導(dǎo)致漏服，自行停藥的現(xiàn)象明顯增多；在同時(shí)合并使用抗感染藥物的患者中，近1/3的患者在抗感染治療時(shí)選用了喹諾酮類或碳青霉烯類，前者本身易誘發(fā)癲癇[9]，后者與丙戊酸存在復(fù)雜的相互作用[10]。血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果在提高老年癲癇患者的依從性，復(fù)雜病情下個(gè)體化用藥方面，提供了必要的支持，臨床藥師根據(jù)血藥濃度監(jiān)測(cè)結(jié)果，結(jié)合患者的個(gè)體情況，對(duì)自行停藥且癲癇癥狀控制不好的患者進(jìn)行用藥教育，恢復(fù)給藥，對(duì)濃度不達(dá)標(biāo)且癥狀控制不好或不良反應(yīng)嚴(yán)重的患者，結(jié)合藥動(dòng)學(xué)模型，協(xié)助醫(yī)生優(yōu)化給藥方案，最終取得了良好的治療效果。