陳 齊，馬章獻(xiàn)，鄭建豐*，韓 迪

（潤盈生物工程（上海）有限公司，上海 201700）

嗜酸乳桿菌（Lactobacillus acidophilus）屬于革蘭氏陽性細(xì)菌，具有多種生理功能[1-3]，如維持腸道菌群平衡、增強(qiáng)免疫力[4-5]、抑制有害菌生長[6]、控制膽固醇水平等作用[7-8]。嗜酸乳桿菌是功能性食品中的益生菌種之一[9]，獲得美國食品藥品監(jiān)督管理局和我國衛(wèi)生部授權(quán)。嗜酸乳桿菌培養(yǎng)過程中對環(huán)境及營養(yǎng)的要求較高[10]，研究高密度生產(chǎn)所需的培養(yǎng)基配方、培養(yǎng)工藝[11]、提高發(fā)酵活菌水平[12]是制備高活菌數(shù)嗜酸乳桿菌菌粉的關(guān)鍵。本研究利用單因素試驗(yàn)、正交試驗(yàn)、最陡爬坡試驗(yàn)及響應(yīng)面優(yōu)化等方法[13-14]對嗜酸乳桿菌LA-G80的培養(yǎng)工藝進(jìn)行優(yōu)化研究，得到嗜酸乳桿菌LA-G80發(fā)酵的最佳培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件，為企業(yè)高質(zhì)量、高活菌水平生產(chǎn)提供一定參考依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料

嗜酸乳桿菌LA-G80分離自人體腸道菌群，由潤盈生物工程（上海）有限公司研發(fā)中心實(shí)驗(yàn)室乳酸菌菌種資源庫提供。

MRS液體培養(yǎng)基，按照GB 4789.35—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 乳酸菌檢驗(yàn)》[15]的方法配制。

1.2 儀器與設(shè)備

JH UV-2102C紫外-可見分光光度計 上海菁華科技儀器有限公司；BioFlo?/CelliGen 115?生物反應(yīng)器 德國Eppendorf公司。

1.3 方法

1.3.1 菌種活化及種子培養(yǎng)

菌種活化：取嗜酸乳桿菌LA-G80脫脂乳凍干管接入MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)12h，活化3 代。

種子培養(yǎng)：將活化后的菌種按體積分?jǐn)?shù)2%接種到裝有200 mL MRS培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中，普通培養(yǎng)8h。

1.3.2 嗜酸乳桿菌LA-G80三角瓶發(fā)酵及發(fā)酵液活菌計數(shù)

將達(dá)標(biāo)的種子按體積分?jǐn)?shù)2%接種到裝有200 mL培養(yǎng)基的250 mL三角瓶中，置于37℃培養(yǎng)箱中，普通培養(yǎng)12h。發(fā)酵液活菌計數(shù)采用稀釋傾注培養(yǎng)的方式，參照GB 4789.34—2012《食品安全國家標(biāo)準(zhǔn) 食品微生物學(xué)檢驗(yàn) 雙歧桿菌的鑒定》[16]。

1.3.3 嗜酸乳桿菌LA-G80培養(yǎng)基成分優(yōu)化

以MRS液體培養(yǎng)基作為起始培養(yǎng)基，選擇添加量均為20 g/L的蔗糖、大豆低聚糖、低聚半乳糖、海藻糖、葡萄糖、果糖、甘露糖、乳糖、麥芽糖、大豆纖維素作為碳源，進(jìn)行碳源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)；選擇添加量均為10 g/L的牛肉浸粉、酵母粉、牛骨蛋白胨、胰蛋白胨、魚蛋白胨、脫鹽乳清粉、酪蛋白胨、乳清粉、酵母蛋白胨進(jìn)行氮源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)；選擇添加量均為0.2 g/L的天冬氨酸、亮氨酸、賴氨酸、苯丙氨酸、絲氨酸、丙氨酸、精氨酸、半胱氨酸和組氨酸進(jìn)行氨基酸優(yōu)化實(shí)驗(yàn)。在三角瓶中進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，于37℃普通培養(yǎng)12h進(jìn)行發(fā)酵液活菌計數(shù)，初步確定培養(yǎng)基成分。

在上述優(yōu)化后的培養(yǎng)基基礎(chǔ)上，分別添加5 g/L花生粉646、花生蛋白粉542、豆粕粉850、豆餅粉742、大豆蛋白粉858、大豆蛋白粉740、蛋白粉MZ9508、棉籽餅粉MZ9541、小麥胚芽粉9 種營養(yǎng)豐富的粗料，考察發(fā)酵液活菌數(shù)，確定嗜酸乳桿菌LA-G80培養(yǎng)基中主要成分的最優(yōu)配比。

1.3.4 嗜酸乳桿菌LA-G80培養(yǎng)基主成分比例優(yōu)化

根據(jù)培養(yǎng)基成分優(yōu)化結(jié)果，選擇效果最好的碳源、氮源及粗料3 種因素進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)及中心組合設(shè)計（central composite design，CCD），進(jìn)行響應(yīng)面擬合優(yōu)化分析，得到碳源、氮源及粗料的最佳添加量。

1.3.5 嗜酸乳桿菌LA-G80三角瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化

考察不同培養(yǎng)溫度、初始pH值和接種量對嗜酸乳桿菌LA-G80生長情況的影響，確定較優(yōu)的三角瓶培養(yǎng)條件。

1.3.6 發(fā)酵罐驗(yàn)證

進(jìn)行5 L規(guī)模小試發(fā)酵實(shí)驗(yàn)，將達(dá)標(biāo)的種子接種到裝有4 L培養(yǎng)基的5 L罐中，恒溫（37℃）及攪拌（100 r/min）條件下培養(yǎng)14h，取樣檢測發(fā)酵液活菌數(shù)，驗(yàn)證優(yōu)化后的培養(yǎng)基配方及培養(yǎng)條件。

1.4 數(shù)據(jù)處理

實(shí)驗(yàn)均重復(fù)測定2 次，取平均值。采用WPS 2016軟件對培養(yǎng)基成分優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行匯總及分析，利用Design Expert 8.0軟件對培養(yǎng)基主成分比例優(yōu)化實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析、響應(yīng)面預(yù)測及繪圖。

2 結(jié)果與分析

2.1 嗜酸乳桿菌LA-G80培養(yǎng)基優(yōu)化結(jié)果

2.1.1 碳源優(yōu)化結(jié)果

碳源是培養(yǎng)基中主要的能量來源，碳源的充足與多樣性影響菌體的生長速率與菌體形態(tài)，多種碳源綜合使用有利于菌體的均衡生長，是影響發(fā)酵液活菌數(shù)和凍干粉質(zhì)量的重要因素。

圖1 不同碳源（20 g/L）對嗜酸乳桿菌LA-G80發(fā)酵液活菌數(shù)的影響Fig.1 Effect of different carbon sources(20 g/L)on the viable count of Lactobacillus acidophilus LA-G80 fermentation broth

由圖1可知，以葡萄糖、麥芽糖或大豆低聚糖為碳源時，嗜酸乳桿菌LA-G80生長效果較好，對三者進(jìn)行正交試驗(yàn)。

由表1可知，根據(jù)3 種碳源極差值的區(qū)別得到3 種碳源的影響程度為葡萄糖＞麥芽糖＞大豆低聚糖，最優(yōu)組合為葡萄糖添加量40 g/L、麥芽糖20 g/L、大豆低聚糖10 g/L。按照最優(yōu)組合的碳源添加量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，嗜酸乳桿菌LA-G80的發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)5.9×108CFU/mL。

表1 嗜酸乳桿菌LA-G80碳源優(yōu)化正交試驗(yàn)Table1 Orthogonal array design with experimental results for optimization of mixed carbon sources for Lactobacillus acidophilus LA-G80

2.1.2 氮源優(yōu)化結(jié)果

氮源是細(xì)胞合成核苷酸和蛋白質(zhì)的重要原料物質(zhì)，充足且易利用的氮源有利于細(xì)胞的快速分裂；蛋白胨類物質(zhì)富含氨基酸、多肽、糖類、脂肪和生長因子等成分，能很好地促進(jìn)嗜酸乳桿菌LA-G80的生長。

圖2 不同氮源（10 g/L）對嗜酸乳桿菌LA-G80發(fā)酵液活菌數(shù)的影響Fig.2 Effect of different nitrogen sources(10 g/L)on the viable count of Lactobacillus acidophilus LA-G80 fermentation broth

選擇9 種不同氮源進(jìn)行氮源優(yōu)化實(shí)驗(yàn)，MRS對照組碳源按照優(yōu)化后的比例進(jìn)行配制。由圖2可知，牛肉浸粉、胰蛋白胨和酵母蛋白胨為氮源時，嗜酸乳桿菌LA-G80培養(yǎng)效果較好。

在微生物生長過程中，多種氮源的復(fù)合使用更有利于細(xì)胞生長，考察復(fù)合氮源對嗜酸乳桿菌LA-G80生長的影響，設(shè)計正交試驗(yàn)。由表2可知，3 種氮源的影響順序?yàn)榕Ｈ饨郏疽鹊鞍纂耍窘湍傅鞍纂?，較優(yōu)組合為牛肉浸粉添加量15 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母蛋白胨15 g/L。按照最優(yōu)組合的碳源及氮源添加量進(jìn)行實(shí)驗(yàn)，發(fā)酵液活菌數(shù)最高可達(dá)7.9×108CFU/mL。

表2 嗜酸乳桿菌LA-G80氮源優(yōu)化正交試驗(yàn)Table2 Orthogonal array design with experimental results for optimization of mixed nitrogen sources for Lactobacillus acidophilus LA-G80

2.1.3 氨基酸優(yōu)化結(jié)果

嗜酸乳桿菌LA-G80菌體細(xì)胞內(nèi)缺乏各種必需的生物合成系統(tǒng)，依賴于培養(yǎng)基提供某些生長必需氨基酸，且可提高氮源利用率。在有氨基酸的培養(yǎng)過程中，乳酸菌可吸收相容性物質(zhì)，以此加強(qiáng)水分子與胞內(nèi)生物大分子物質(zhì)的親和力，進(jìn)而保持蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)和酶活性，從而提高菌株凍干過程的存活率。在上述優(yōu)化的基礎(chǔ)上，選擇9 種氨基酸，添加量均為0.2 g/L，考察嗜酸乳桿菌LA-G80發(fā)酵液活菌數(shù)。

圖3 不同氨基酸（0.2 g/L）對嗜酸乳桿菌LA-G80發(fā)酵液活菌數(shù)的影響Fig.3 Effect of different amino acids(0.2 g/L)on the viable count of Lactobacillus acidophilus LA-G80 fermentation broth

由圖3可知，與對照組相比，添加0.2 g/L天冬氨酸、絲氨酸、丙氨酸均能促進(jìn)嗜酸乳桿菌LA-G80的生長，對三者添加量進(jìn)行組合試驗(yàn)，進(jìn)一步確定3 種氨基酸的較適添加量。

由表3可知，隨著3 種氨基酸添加量的增多，嗜酸乳桿菌LA-G80發(fā)酵液活菌數(shù)先上升后下降，最高發(fā)酵液活菌數(shù)為9.9×108CFU/mL，此時3 種氨基酸添加量均為0.16 g/L。

表3 嗜酸乳桿菌LA-G80培養(yǎng)基氨基酸優(yōu)化組合試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table3 Combined test design with experimental results for optimization of mixed amino acids for Lactobacillus acidophilus LA-G80

2.1.4 粗料優(yōu)化結(jié)果

表4 嗜酸乳桿菌LA-G80培養(yǎng)基粗料（5 g/L）優(yōu)化結(jié)果Table4 Selection of optimal solid culture substrate(5 g/L)for Lactobacillus acidophilus LA-G80

在微生物培養(yǎng)中，粗料作為一類營養(yǎng)豐富、含促生長因子、價格便宜的物質(zhì)被大量利用。由表4可知，添加5 g/L 9 種粗料均對嗜酸乳桿菌LA-G80的生長有促進(jìn)作用，其中添加豆餅粉742和花生蛋白粉542的效果最好，發(fā)酵液活菌數(shù)可分別達(dá)到16.2×108、15.3×108CFU/mL，且菌體形態(tài)更加均一，有利于提高菌體密度和菌泥產(chǎn)量。

2.2 響應(yīng)面法優(yōu)化嗜酸乳桿菌LA-G80培養(yǎng)基主成分比例

通過碳源、氮源及粗料添加試驗(yàn)后，確定葡萄糖、牛肉浸粉及豆餅粉742添加量為3 個最顯著因素，進(jìn)行最陡爬坡試驗(yàn)，確定中心點(diǎn)。

由表5可知，隨著葡萄糖、牛肉浸粉和豆餅粉742添加量的增加，嗜酸乳桿菌LA-G80活菌密度先上升后下降，在第5組試驗(yàn)中達(dá)到最大，此時葡萄糖添加量為4.0%、牛肉浸粉添加量1.7%、豆餅粉742添加量0.5%。以這3 個因素添加量為中心點(diǎn)，以葡萄糖添加量（A）、牛肉浸粉添加量（B）、豆餅粉742添加量（C）為自變量，嗜酸乳桿菌LA-G80菌體密度（OD600nm）為響應(yīng)值（Y），利用Design-Expert 8.0軟件設(shè)計3因素5水平的CCD，具體數(shù)據(jù)如表6～7所示。

表5 嗜酸乳桿菌LA-G80培養(yǎng)基成分優(yōu)化最陡爬坡試驗(yàn)設(shè)計及結(jié)果Table5 Steepest ascent design with experimental results for optimization of medium composition for Lactobacillus acidophilus LA-G80

表6 嗜酸乳桿菌LA-G80培養(yǎng)基成分CCD及結(jié)果Table6 CCD with experimental results for optimization of medium composition for Lactobacillus acidophilus LA-G80

表7 響應(yīng)面試驗(yàn)結(jié)果方差分析Table7 Analysis of variance of quadratic polynomial regression model

對表6的數(shù)據(jù)進(jìn)行方差分析，可得擬合方程：Y=12.61＋0.37A＋1.49B＋0.52C＋0.01AB＋0.31AC-0.31BC-1.26A2-1.79B2-1.55C2。采用Design-Expert 8.0軟件分析，所得模型的決定系數(shù)R2為0.933 0，校正后為0.983 0，表明此模型能解釋實(shí)驗(yàn)中98.30%的情況。由表7可知，失擬項(xiàng)P值為0.059 6＞0.05，失擬項(xiàng)對于誤差不顯著，說明回歸模型可信，能較好地解釋嗜酸乳桿菌LA-G80菌體密度的變化，因此可利用該模型對嗜酸乳桿菌LA-G80的高密度發(fā)酵培養(yǎng)情況進(jìn)行預(yù)測。

分析二次多項(xiàng)方程，利用Design Expert 8.0軟件得到二維等高線和三維立體圖，等高線圖越接近橢圓表示交互作用越強(qiáng)，等高線的稀疏表示響應(yīng)面圖形的平陡。每個響應(yīng)面三維分析圖和對應(yīng)的等高線圖分別為當(dāng)1 個變量保持0水平時，另2 個獨(dú)立變量之間的交互作用。由圖4～6可知：葡萄糖與牛肉浸粉、葡萄糖與豆餅粉742、牛肉浸粉與豆餅粉742對嗜酸乳桿菌LA-G80發(fā)酵液菌體密度的交互作用顯著（P＜0.05）；在一定范圍內(nèi)，隨著葡萄糖、牛肉浸粉和豆餅粉742添加量的增加，發(fā)酵液菌體密度隨之增加，在達(dá)到一定程度后，各因素添加量繼續(xù)增加，發(fā)酵液菌體密度逐漸減小，說明它們之間對嗜酸乳桿菌LA-G80發(fā)酵液菌體密度的影響不是簡單的線性關(guān)系，只有在3 個因素添加量適宜的條件下，嗜酸乳桿菌LA-G80的發(fā)酵液菌體密度才會達(dá)到最大值。采用響應(yīng)面法優(yōu)化得到培養(yǎng)基主成分最佳添加量為葡萄糖41.5 g/L、牛肉浸粉18.64 g/L、豆餅粉7 425.48 g/L，其余培養(yǎng)基成分按照優(yōu)化后的量進(jìn)行添加；使用該模型預(yù)測的最大菌體密度（OD600nm）為13.928 2。37℃培養(yǎng)

圖4 葡萄糖與牛肉浸粉對嗜酸乳桿菌LA-G80發(fā)酵液菌體密度交互作用的等高線及響應(yīng)面圖Fig.4 Response surface and contour plots showing the interactive effect of glucose and beef extract powder on cell density of Lactobacillus acidophilus LA-G80

圖5 葡萄糖與豆餅粉742對嗜酸乳桿菌LA-G80發(fā)酵液菌體密度交互作用的等高線及響應(yīng)面圖Fig.5 Response surface and contour plots showing the interactive effect of glucose and soybean cake powder on cell density of Lactobacillus acidophilus LA-G80

圖6 牛肉浸粉與豆餅粉742對嗜酸乳桿菌LA-G80發(fā)酵液菌體密度交互作用的等高線及響應(yīng)面圖Fig.6 Response surface and contour plots showing the interactive effect of beef extract powder and soybean cake powder on cell density of Lactobacillus acidophilus LA-G80

12h，實(shí)際菌體密度（OD600nm）為13.75，可見該模型能夠較好預(yù)測嗜酸乳桿菌LA-G80的菌體生長情況。

2.3 嗜酸乳桿菌LA-G80三角瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化結(jié)果

由表8可知，3 種因素的影響順序?yàn)榕囵B(yǎng)溫度＞起始pH值＞接種量，最優(yōu)培養(yǎng)條件為溫度37℃、起始pH 6.0、接種量2%，在此條件下嗜酸乳桿菌LA-G80活菌數(shù)達(dá)到19.9×108CFU/mL。

表8 嗜酸乳桿菌LA-G80三角瓶培養(yǎng)條件優(yōu)化設(shè)計及結(jié)果Table8 Experimental design with results for optimization of shake flask culture conditions for Lactobacillus acidophilus LA-G80

2.4 5 L發(fā)酵罐發(fā)酵實(shí)驗(yàn)結(jié)果

嗜酸乳桿菌LA-G80高密度培養(yǎng)過程中，不適宜的pH值會抑制酶活性，適宜的恒定pH值可以延長對數(shù)生長期、減輕過酸抑制作用、提高菌體密度，從而增加菌泥產(chǎn)量。在5 L罐發(fā)酵過程中，保持恒定pH 5.5，配制MRS培養(yǎng)基及優(yōu)化培養(yǎng)基，在5 L罐中按照相同的培養(yǎng)條件培養(yǎng)嗜酸乳桿菌LA-G80。結(jié)果表明，利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基培養(yǎng)，嗜酸乳桿菌LA-G80在5 L發(fā)酵罐中的發(fā)酵液活菌數(shù)可達(dá)42.2×108CFU/mL，約為MRS培養(yǎng)基的10 倍。

3 結(jié) 論

近年來，隨著人們生活水平的提高，對食品及保健品的需要越來越強(qiáng)烈，而嗜酸乳桿菌作為人體腸道菌群中主要的有益菌株[17-18]，對其研究也較多。嗜酸乳桿菌對于維持腸道菌群平衡[19]、保持腸道健康具有明顯作用[20-21]，因此生產(chǎn)出具有高生物活性的嗜酸乳桿菌產(chǎn)品變得更加重要。本研究采用正交試驗(yàn)設(shè)計、中心組合試驗(yàn)設(shè)計和響應(yīng)面分析相結(jié)合的方法，確定嗜酸乳桿菌LA-G80高密度培養(yǎng)過程中最顯著影響因子的最佳添加量，為其高質(zhì)量、高密度培養(yǎng)提供了一定參考。

嗜酸乳桿菌LA-G80高密度培養(yǎng)過程中的最優(yōu)培養(yǎng)基組成為葡萄糖添加量41.5 g/L、麥芽糖20 g/L、大豆低聚糖10 g/L、牛肉浸粉18.64 g/L、胰蛋白胨10 g/L、酵母蛋白胨15 g/L、吐溫-80 1 mL/L、K2HPO4·7H2O 2 g/L、N a A c·3 H2O 5 g/L、檸檬酸三銨2 g/L、MgSO4·7H2O 0.25 g/L、MnSO·4H2O 0.05 g/L、天冬氨酸0.16 g/L、丙氨酸0.16 g/L、絲氨酸0.16 g/L、花生蛋白粉5 425 g/L、豆餅粉7 425.48 g/L。嗜酸乳桿菌LA-G80的較適培養(yǎng)條件為接種量2%、初始pH 6.0、恒定pH 5.5、恒溫37℃。進(jìn)行5 L發(fā)酵罐驗(yàn)證實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，菌體形態(tài)均一，發(fā)酵液活菌數(shù)最高達(dá)42.2×108CFU/mL，約為MRS培養(yǎng)基的10 倍。利用優(yōu)化后的培養(yǎng)基組成及培養(yǎng)條件進(jìn)行多次1 t發(fā)酵罐實(shí)驗(yàn)，結(jié)果表明，發(fā)酵液活菌數(shù)比當(dāng)前生產(chǎn)水平提高1 倍，凍干粉活菌數(shù)和產(chǎn)量均提高50%以上，產(chǎn)品具有更高的生物活性。合理的培養(yǎng)基構(gòu)成及粗料的使用使得培養(yǎng)基中營養(yǎng)更加均衡、營養(yǎng)成分更加豐富，且粗料可促進(jìn)細(xì)胞分裂，有利于生產(chǎn)出具有高生物活性的菌粉，且菌粉的食用及保健價值更高，能夠降低成本，提高效益。