魏 敏，李興佳，柴艷兵，李 飛，劉 麗，張耀廣*

（石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司，農(nóng)業(yè)農(nóng)村部乳品質(zhì)量安全控制重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，河北 石家莊 050021）

酪蛋白磷酸肽（casein phosphopeptide，CPP）是酪蛋白經(jīng)適合的蛋白酶消化所得的一系列含有磷酸絲氨酸簇的短肽[1]。大量研究表明，CPP可以提高繁殖能力、降低腫瘤發(fā)生率、增強(qiáng)免疫力等[2-5]。因此，越來(lái)越多的保健食品、嬰幼兒配方乳粉配方將CPP作為營(yíng)養(yǎng)強(qiáng)化劑進(jìn)行添加[6-8]。

我國(guó)對(duì)于嬰幼兒配方乳粉中CPP含量的測(cè)定尚無(wú)公開(kāi)、統(tǒng)一的方法和標(biāo)準(zhǔn)[9-12]。目前，研究較多的檢測(cè)方法有毛細(xì)管區(qū)帶電泳法、高效液相色譜（high performance liquid chromatography，HPLC）法[13-14]和液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法[15-17]。由于毛細(xì)管區(qū)帶電泳法操作復(fù)雜，液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法價(jià)格昂貴，HPLC已逐漸成為檢測(cè)CPP的主要方法[18-20]。目前，HPLC檢測(cè)方法前處理復(fù)雜，本研究通過(guò)優(yōu)化樣品前處理方法和上機(jī)檢測(cè)條件，旨在建立一種前處理簡(jiǎn)單、快速、回收率穩(wěn)定的嬰幼兒配方乳粉中CPP含量的HPLC檢測(cè)方法，為相關(guān)標(biāo)準(zhǔn)的制定提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

CPP原料（純度89.5%）丹麥Arla公司；嬰幼兒配方乳粉7個(gè)不同品牌市售。

乙腈（色譜純）德國(guó)默克公司；三氟乙酸（色譜純）、鹽酸（分析純）天津市大茂化學(xué)試劑廠；實(shí)驗(yàn)用水為符合GB/T 6682—2008《分析實(shí)驗(yàn)室用水規(guī)格和試驗(yàn)方法》規(guī)定的一級(jí)水。

1.2 儀器與設(shè)備

2695高效液相色譜儀美國(guó)Waters公司；BS224S電子天平瑞士梅特勒-托利多公司。

1.3 方法

1.3.1 標(biāo)準(zhǔn)溶液的配制

準(zhǔn)確稱取CPP 0.050 0 g（CPP原料純度89.5%，折算后稱取CPP原料0.055 9 g），用水定容至50 mL，配制成CPP質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液；分別準(zhǔn)確吸取5、10、20、40、60、80、100 μL上述標(biāo)準(zhǔn)儲(chǔ)備液，用水定容至1 mL，配制成CPP質(zhì)量濃度分別為5、10、20、40、60、80、100 μg/mL的標(biāo)準(zhǔn)工作液。

1.3.2 樣品溶液的制備

準(zhǔn)確稱取5.00 g乳粉置于三角瓶中，用25 mL水?dāng)嚢枞芙?，? mol/L鹽酸調(diào)節(jié)pH值至4.6后用水轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶，定容，振蕩搖勻，用濾紙過(guò)濾，經(jīng)0.45 μm濾膜過(guò)濾后作為待測(cè)液。

1.3.3 CPP特征峰的確定

將CPP原料、不含CPP的配方乳粉及強(qiáng)化CPP配方乳粉作為樣品，分別進(jìn)行HPLC分析，通過(guò)比較確定CPP的特征峰。

1.3.4 色譜條件

色譜柱：C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5.0 μm）；流動(dòng)相：A相為0.05%三氟乙酸，B相為0.05%乙腈（或A相為0.05%冰乙酸，B相為0.05%乙腈）；流速1 mL/min；柱溫55℃；檢測(cè)波長(zhǎng)215 nm；進(jìn)樣量20.0 μL；梯度洗脫程序見(jiàn)表1。

表1 梯度洗脫程序Table1 Gradient elution procedure

1.3.5 CPP含量計(jì)算

樣品中CPP含量按下式計(jì)算。

式中：X為樣品中CPP含量/（mg/100 g）；ρ為由標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得試樣中CPP的質(zhì)量濃度/（μg/mL）；V為試樣定容體積/mL；m為樣品質(zhì)量/g。計(jì)算結(jié)果保留3 位有效數(shù)字。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品前處理方法的優(yōu)化

表2 樣品前處理方法Table2 Sample pretreatments

表3 經(jīng)不同前處理樣品的回收率及相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差Table3 Recovery and relative standard deviation for different pretreated samples

分別考察3 種樣品前處理方法（表2）的準(zhǔn)確度和精密度。由表3可知，前處理方法1的加標(biāo)回收率為69.93%～89.47%，RSD為5.77%～16.30%，前處理方法2的加標(biāo)回收率為86.07%～91.77%，RSD為5.29%～13.90%，前處理方法3的加標(biāo)回收率為94.50%～95.45%，RSD為4.54%～7.47%。結(jié)果表明，前處理方法3的準(zhǔn)確度和精密度最高，且操作最簡(jiǎn)單、方便。

2.2 流動(dòng)相的優(yōu)化

圖1 0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作為流動(dòng)相的HPLC圖Fig.1 HPLC profile with 0.05% TFA-0.05% acetonitrile as mobile phase

圖2 0.05%冰乙酸-0.05%乙腈作為流動(dòng)相的HPLC圖Fig.2 HPLC profile with 0.05% glacial acetic acid-0.05% acetonitrile as mobile phase

分別考察采用0.05%冰乙酸-0.05%乙腈和0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作為流動(dòng)相體系時(shí)CPP的分離效果。由圖1～2可知，0.05%冰乙酸-0.05%乙腈作為流動(dòng)相體系時(shí)，雜峰多且不易判定，0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作為流動(dòng)相體系時(shí)峰形較好，分離度高，無(wú)拖尾現(xiàn)象。綜合分離效果、響應(yīng)強(qiáng)度、保留時(shí)間及系統(tǒng)穩(wěn)定性，最終選擇0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作為流動(dòng)相體系。

2.3 CPP特征峰的確定

由圖3可知，CPP標(biāo)準(zhǔn)品和添加CPP的配方乳粉均在17.059 min出峰，而不添加CPP的配方乳粉在17.059 min處無(wú)色譜峰，因此可以確定該峰為定量檢測(cè)CPP的標(biāo)志峰。

圖3 CPP加標(biāo)樣品、空白樣品及標(biāo)準(zhǔn)溶液的HPLC圖Fig.3 HPLC profiles of spiked sample,blank sample and standard solution

2.4 方法的線性范圍、檢出限和定量限

按照確定好的樣品前處理?xiàng)l件和色譜條件對(duì)標(biāo)準(zhǔn)工作溶液進(jìn)行測(cè)定，以CPP質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)，對(duì)應(yīng)的峰面積為縱坐標(biāo)，繪制CPP的標(biāo)準(zhǔn)曲線。結(jié)果表明，CPP質(zhì)量濃度在5～100 μg/mL范圍內(nèi)時(shí)線性關(guān)系良好，標(biāo)準(zhǔn)曲線方程為y=1.26×103x＋2.95×103（R2=0.999 8）。以信噪比（RS/N）=3結(jié)合空白基質(zhì)噪音響應(yīng)確定方法的檢出限為2 mg/100 g，以RS/N=10確定方法的定量限為5 mg/100 g。

2.5 實(shí)際樣品測(cè)定

表4 實(shí)際樣品測(cè)定結(jié)果Table4 Analytical results of actual samples

收集7 個(gè)品牌的市售嬰幼兒配方乳粉，對(duì)產(chǎn)品中的CPP含量進(jìn)行檢測(cè)。由表4可知，本研究建立的方法能夠檢測(cè)出乳粉中是否含有CPP，并能夠準(zhǔn)確測(cè)定乳粉中CPP的含量。因此，該方法可用于嬰幼兒配方乳粉中CPP的定量測(cè)定。

3 結(jié) 論

建立一種HPLC法檢測(cè)嬰幼兒配方乳粉中CPP含量的方法。以CPP標(biāo)準(zhǔn)品建立標(biāo)準(zhǔn)曲線，并對(duì)樣品前處理方法和色譜條件進(jìn)行優(yōu)化，選擇最優(yōu)條件進(jìn)行檢測(cè)。結(jié)果表明：最優(yōu)前處理?xiàng)l件為用鹽酸（1 mol/L）調(diào)節(jié)樣品溶液pH 4.6后用水轉(zhuǎn)移至50 mL容量瓶中，用濾紙過(guò)濾后作為待測(cè)液；上機(jī)檢測(cè)時(shí)用0.05%三氟乙酸-0.05%乙腈作為流動(dòng)相體系進(jìn)行梯度洗脫；樣品加標(biāo)回收率為94.50%～95.45%，線性良好（R2=0.999 8），方法檢出限為2.0 mg/100 g，定量限為5.0 mg/100 g。該方法樣品前處理簡(jiǎn)單、穩(wěn)定性、可靠性好，檢測(cè)結(jié)果滿足線性、精密度、準(zhǔn)確度及檢出限要求，可用于嬰幼兒配方乳粉中CPP含量的測(cè)定，為相關(guān)檢測(cè)標(biāo)準(zhǔn)的出臺(tái)提供了理論依據(jù)和技術(shù)支撐。