齊世華，張 棟，趙林森，艾連中，王世杰,4,*

（1.河北一然生物科技有限公司，河北 石家莊 050800；2.石家莊君樂(lè)寶乳業(yè)有限公司，河北 石家莊 050221；3.上海理工大學(xué)醫(yī)療器械與食品學(xué)院，上海 200093；4.河北科技大學(xué)生物科學(xué)與工程學(xué)院，河北 石家莊 050018）

西藏靈菇，又稱藏靈菇、天山靈菇、雪蓮菌，是源于西藏林芝地區(qū)的菌類復(fù)合體，是多種菌共生形成的有機(jī)、統(tǒng)一整體，是一種傳統(tǒng)酸乳的天然發(fā)酵劑[1]。堅(jiān)持飲用西藏靈菇發(fā)酵酸乳可以增強(qiáng)人體抵抗力[2-3]、調(diào)節(jié)免疫[4-5]、抗衰老[6-7]、抑制有害菌生長(zhǎng)[8]等。

近年來(lái)，隨著生活水平的逐步提高，消費(fèi)者對(duì)于食品的營(yíng)養(yǎng)健康訴求逐漸加強(qiáng)。乳酸菌作為益生菌的主要來(lái)源，其功能性越來(lái)越受到消費(fèi)者的認(rèn)可，其主要作用包括調(diào)節(jié)腸道菌群平衡[9]、抗氧化[10]、降膽固醇[11]、降血壓[12]、調(diào)節(jié)免疫[13]及抗腫瘤[14]等。由于我國(guó)益生菌研究起步較晚，目前市場(chǎng)上的益生菌主要為國(guó)外引進(jìn)的菌種，開發(fā)具有我國(guó)自主知識(shí)產(chǎn)權(quán)的益生菌迫在眉睫。西藏靈菇是以耐熱可魯維酵母、亞羅可魯維酵母為主體真菌，以乳酸桿菌、嗜酸乳桿菌、短乳桿菌和乳酸鏈球菌等乳酸菌為主體細(xì)菌構(gòu)成的塊狀共生菌系[15]，其優(yōu)良的保健功能可能與其微生物組成有關(guān)。本研究期望能夠從西藏靈菇中分離得到具有優(yōu)良性狀的益生菌，為我國(guó)國(guó)產(chǎn)益生菌發(fā)展提供參考。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

1.1.1 材料

采集自西藏當(dāng)雄縣當(dāng)曲卡鎮(zhèn)牧民長(zhǎng)年自制酸乳中自然形成的西藏靈菇。采用直接取樣法，樣品置于預(yù)先滅菌的50 mL離心管中，標(biāo)記樣品號(hào)并做記錄，密封4℃保存。待所有樣品采集完成后帶回實(shí)驗(yàn)室4℃保存?zhèn)溆谩?/p>

1.1.2 培養(yǎng)基與試劑

10 g/100 mL脫脂乳、MRS培養(yǎng)基、細(xì)菌基因組提取試劑盒（DP302）天根生化科技（北京）有限公司；其他試劑均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

DPX-25BS-11生化培養(yǎng)箱、凈化工作臺(tái)上海新苗醫(yī)療器械制造有限公司；CX31RTSF顯微鏡日本奧林巴斯公司；D-37520高速離心機(jī)賽默飛世爾科技（中國(guó)）有限公司；LDZX-50KBS立式壓力蒸汽滅菌器上海申安醫(yī)療器械廠；7890A氣相色譜-5975C質(zhì)譜聯(lián)用儀美國(guó)安捷倫公司；5078HW-1數(shù)顯恒溫磁力攪拌器杭州儀表電機(jī)有限公司；JJ200電子天平常熟市雙杰測(cè)試儀器廠。

1.3 方法

1.3.1 樣品中乳酸菌的分離純化及保存

取1 g樣品至無(wú)菌研缽，研碎后置于9 mL生理鹽水中振蕩混勻，梯度稀釋至體積比為1∶106后，分別取10-4、10-5、10-6稀釋液100 μL涂布于MRS固體培養(yǎng)基上，37℃厭氧培養(yǎng)48h；菌落形成后挑取形態(tài)特征不同的單菌落至MRS液體培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)24h；通過(guò)顯微鏡觀察，將不純的菌株在MRS固體培養(yǎng)基上劃線分離、純化，37℃培養(yǎng)48h，反復(fù)操作至少3 次，直到鏡檢結(jié)果為純的單一菌株，編號(hào)、傳代[16]。

對(duì)分離、純化后的菌株進(jìn)行過(guò)氧化氫實(shí)驗(yàn)和革蘭氏染色實(shí)驗(yàn)，將過(guò)氧化氫反應(yīng)陰性的革蘭氏陽(yáng)性菌株暫定為乳酸菌，取其MRS培養(yǎng)液1 mL與50%滅菌甘油以體積比1∶1混合后置于-80℃冰箱保存，同時(shí)另取1 mL MRS培養(yǎng)液進(jìn)行RNA提取。

1.3.2 分離菌株的16S rRNA序列分析

采用細(xì)菌基因組小量提取試劑盒對(duì)分離純化后的菌株進(jìn)行RNA提取。以提取的RNA為模板，以細(xì)菌通用引物27F（5’-AGAGTTTGATCCTGGCTCAG-3’）、1492R（5’-CTACGGCTACCTTGTTACGA-3’）為反應(yīng)引物，進(jìn)行16S rRNA基因的聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)（polymerase chain reaction，PCR）擴(kuò)增。PCR擴(kuò)增結(jié)束后，取擴(kuò)增產(chǎn)物2 μL進(jìn)行1%瓊脂糖凝膠電泳檢測(cè)，擴(kuò)增成功的樣品應(yīng)在1 500 bp處有清晰的擴(kuò)增條帶，且無(wú)明顯拖尾、彌散現(xiàn)象。將擴(kuò)增成功的樣品送至北京中科希林生物科技有限責(zé)任公司進(jìn)行純化、測(cè)序和拼接。

將測(cè)序得到的序列利用NCBI數(shù)據(jù)庫(kù)中的BLAST進(jìn)行同源性分析，將鑒定菌株與模式菌株的16S rRNA序列一起運(yùn)用MEGA 4.1以鄰接（Neighbor-Joining，N-J）法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹，進(jìn)行菌相分析[17]。

1.3.3 菌株產(chǎn)酸曲線的繪制

取所分離菌株的甘油保存管，將菌株接種至液體MRS培養(yǎng)基中連續(xù)活化3 代；按體積分?jǐn)?shù)3%接種量接種于蛋白質(zhì)含量為3 g/100 mL的巴氏滅菌脫脂復(fù)原乳中，培養(yǎng)溫度35℃。每隔3h記錄pH值，繪制菌株產(chǎn)酸曲線[18]。

1.3.4 發(fā)酵乳香氣分析

將活化后的菌株接種至12 g/100 mL的無(wú)菌脫脂乳中，37℃發(fā)酵72h，運(yùn)用氣相色譜-質(zhì)譜分析其發(fā)酵香氣。

頂空固相微萃取：取酸乳樣品7 mL，加入1 mL飽和NaCl溶液，60℃條件下用50/30 μm二乙烯苯/碳分子篩/聚二甲基硅氧烷（divinylbenzene/carboxen/polydimethylsiloxane，DVB/CAR/PDMS）萃取頭頂空恒溫萃取30 min，然后再將萃取頭在250℃進(jìn)樣口熱解析5 min，進(jìn)樣，進(jìn)行氣相色譜-質(zhì)譜解析。

色譜條件：D B-W A X聚乙二醇色譜柱（30 m×0.25 mm，0.25 μm）；He流速1.0 mL/min；升溫程序：起始溫度35℃，保持6 min，然后以8℃/min升至80℃，保持2 min，再以5℃/min升至110℃，最后以10℃/min升至210℃，保持10 min；進(jìn)樣口溫度250℃（適用于DVB/CAR/PDMS萃取頭）。

質(zhì)譜條件：電子轟擊離子源；電子轟擊能量70 eV；離子源溫度230℃。

1.3.5 菌株耐酸耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

挑取1 接種環(huán)分離菌株，接種到MRS培養(yǎng)基中，37℃培養(yǎng)48h，取出計(jì)數(shù)；同時(shí)各取1 mL該培養(yǎng)基，分別加入到pH值為2.5和含3 g/L牛膽鹽的MRS培養(yǎng)基中，37℃孵育，于孵育0、4h進(jìn)行菌數(shù)測(cè)定，并計(jì)算存活率[19]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樣品中乳酸菌的分離結(jié)果

從西藏靈菇中分離得到一株過(guò)氧化氫反應(yīng)陰性[20-21]、革蘭氏染色陽(yáng)性的疑似乳酸菌，將其命名為L(zhǎng)C577。菌株LC577在MRS瓊脂培養(yǎng)基上形成的菌落為圓形、邊緣整齊、隆起、表面光滑、有光澤、白色、不透明，顯微鏡下為棒狀桿菌（圖1）。

圖1 菌株LC577的菌落（A）及顯微鏡（B）形態(tài)Fig.1 Colony(A)and microscopic(B)morphology of strain LC577

2.2 分離菌株LC577的16S rRNA序列分析

圖2 根據(jù)16S rRNA序列構(gòu)建的菌株LC577進(jìn)化樹Fig.2 Evolutionary tree for LC577 constructed based on 16S rRNA sequence

將測(cè)序得到的菌株LC577的RNA序列利用NCBI中的BLAST進(jìn)行同源性分析，并與乳桿菌屬模式菌株以N-J法繪制系統(tǒng)發(fā)育樹。由圖2可知，菌株LC577與干酪乳桿菌模式菌株Lactobacillus caseiATCC 393T同源性最高，初步確定菌株LC577為干酪乳桿菌。

2.3 干酪乳桿菌LC577的產(chǎn)酸曲線

圖3 干酪乳桿菌LC577的產(chǎn)酸曲線Fig.3 Acid production curve of Lactobacillus casei LC577

由圖3可知，干酪乳桿菌LC577具有良好的產(chǎn)酸能力。在脫脂復(fù)原乳中發(fā)酵9h可凝乳，發(fā)酵14h時(shí)的pH值可迅速降至4.5，能避免發(fā)酵過(guò)程中的染菌風(fēng)險(xiǎn)，可滿足乳品廠家對(duì)于優(yōu)良干酪乳桿菌發(fā)酵性能的要求；發(fā)酵至60h時(shí)，發(fā)酵乳pH值降至3.7～3.8，也可滿足乳品廠家對(duì)發(fā)酵中止時(shí)發(fā)酵乳酸度的要求。

2.4 干酪乳桿菌LC577發(fā)酵乳香氣分析

由圖4和表1可知，干酪乳桿菌LC577發(fā)酵乳香氣物質(zhì)主要由乙酸、丁酸、己酸、辛酸、苯甲酸、癸酸、乳酸等酸類物質(zhì)以及少量的酮類和醇類物質(zhì)構(gòu)成，其中乙酸、己酸、辛酸、乳酸峰面積響應(yīng)值較強(qiáng)，說(shuō)明樣品酸味、干酪味濃郁。干酪乳桿菌LC577發(fā)酵乳中丁二酮、乙偶姻含量較少，而且該2 種物質(zhì)香氣主要表現(xiàn)為奶油香氣，說(shuō)明干酪乳桿菌LC577發(fā)酵乳奶油香氣較弱[22-24]，并且干酪乳桿菌LC577發(fā)酵乳以短鏈脂肪酸為主。通過(guò)以上香氣分析可以判斷出干酪乳桿菌LC577發(fā)酵乳香氣整體上表現(xiàn)為酸奶酪香氣。

圖4 干酪乳桿菌LC577發(fā)酵乳的氣相色譜-質(zhì)譜圖Fig.4 Gas chromatogram-mass spectrometric analysis of fermented milk with Lactobacillus casei LC577

表1 干酪乳桿菌LC577發(fā)酵乳主要風(fēng)味物質(zhì)的峰面積響應(yīng)值及香氣描述Table1 Peak area response values and aroma descriptions of mainflavor compounds in fermented milk with Lactobacillus caseiLC577

2.5 干酪乳桿菌LC577的耐酸耐膽鹽實(shí)驗(yàn)

由表2可知，干酪乳桿菌LC577在pH 2.5的MRS培養(yǎng)基中孵育4h的存活率達(dá)106.06%，活菌數(shù)有所增加，在含有3 g/L膽鹽的MRS培養(yǎng)基中培養(yǎng)4h存活率為13.60%，說(shuō)明干酪乳桿菌LC577具有很強(qiáng)的耐酸能力和較強(qiáng)的耐膽鹽能力。能否耐受酸脅迫和堿脅迫是乳酸菌能否以活菌形式到達(dá)人體腸道并發(fā)揮作用的關(guān)鍵指標(biāo)，體外耐酸耐膽鹽實(shí)驗(yàn)是評(píng)價(jià)益生菌耐酸耐膽鹽能力的常用手段[25-26]。干酪乳桿菌LC577較強(qiáng)的耐酸耐膽鹽能力有利于其到達(dá)腸道并發(fā)揮益生作用。

表2 干酪乳桿菌LC577的耐酸耐膽鹽實(shí)驗(yàn)結(jié)果Table2 Acid and bile salt tolerance of Lactobacillus casei LC 577

3 結(jié) 論

近幾十年來(lái)，在日本、美國(guó)及歐洲等發(fā)達(dá)國(guó)家，益生菌的概念早已深入人心。目前，日本、歐洲的功能性發(fā)酵乳酸菌飲料在乳制品市場(chǎng)的比例已達(dá)到80%，北美約為30%。日本主要乳制品公司均在國(guó)家支持下長(zhǎng)期開展益生菌研究，益生菌產(chǎn)業(yè)發(fā)展取得顯著成績(jī)。為了降低國(guó)民健康費(fèi)用支出，日本鼓勵(lì)公眾食用健康食品以降低患病風(fēng)險(xiǎn)，因此，對(duì)益生菌的研究投入仍在進(jìn)一步增加。隨著我國(guó)人民生活水平的逐漸提高，對(duì)于食品健康的需求日益增長(zhǎng)，益生菌市場(chǎng)需求逐步擴(kuò)大，因此開發(fā)自有知識(shí)產(chǎn)權(quán)的益生菌不僅符合我國(guó)市場(chǎng)需求，同時(shí)對(duì)于提高我國(guó)公共健康水平、降低國(guó)民健康費(fèi)用支出具有重要意義。

干酪乳桿菌常見于傳統(tǒng)發(fā)酵乳制品中，具有悠久的食用歷史，屬于乳桿菌屬，存在于人的口腔、腸道內(nèi)含物、大便及陰道中，也常常出現(xiàn)在乳制品、飼料及面團(tuán)中。目前，已有部分干酪乳桿菌被鑒定為益生菌，如干酪乳桿菌Zhang[27-28]、干酪乳桿菌Shirota[29]和干酪乳桿菌CRL431[30]等。近年來(lái)，國(guó)內(nèi)外學(xué)者對(duì)干酪乳桿菌進(jìn)行的研究發(fā)現(xiàn)，其具有調(diào)節(jié)腸道菌群[31]、抗癌[32]等作用。

本研究通過(guò)對(duì)西藏靈菇樣品進(jìn)行菌株分離純化，得到一株干酪乳桿菌LC577，進(jìn)一步研究發(fā)現(xiàn)，其具有良好的產(chǎn)酸特性和發(fā)酵產(chǎn)香能力，適宜作為酸乳發(fā)酵劑使用，同時(shí)具有良好的耐酸耐膽鹽能力，具有良好的益生菌特性，因此干酪乳桿菌LC577具有良好的應(yīng)用前景。