許中霞，劉桂智，劉衛(wèi)東， 郭瑞庭，李華鐘*， 鄭迎迎

（1.江南大學(xué) 工業(yè)生物技術(shù)教育部重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，江蘇 無(wú)錫 214122；2.中國(guó)科學(xué)院 天津工業(yè)生物技術(shù)研究所，天津300308）

玉米赤霉烯酮（zearalenone，ZEN）是一類由鐮刀菌屬真菌產(chǎn)生的類雌激素毒素，是目前全球污染最嚴(yán)重的三種霉菌毒素之一。ZEN主要存在于玉米、小麥、大麥和黍等農(nóng)作物及其制品中，能導(dǎo)致攝入者出現(xiàn)早熟、生殖周期紊亂等雌激素紊亂癥，給種植業(yè)和養(yǎng)殖業(yè)帶來(lái)巨大損失[1-3]。ZEN還具有強(qiáng)致癌性，能夠引起乳腺癌、食管癌等疾病[4-5]。為減輕霉菌毒素造成的飼料業(yè)和畜牧業(yè)的損失，人們陸續(xù)開(kāi)發(fā)出多種物理、化學(xué)和生物學(xué)的方法來(lái)降解或吸附飼料中的霉菌毒素?；瘜W(xué)法和物理法脫毒通常缺乏選擇性，造成飼料中其它營(yíng)養(yǎng)成分的破壞和流失。而生物酶法脫毒因其高選擇性、脫毒徹底、操作簡(jiǎn)易，受到廣泛關(guān)注。

Naoko Takahashi-Ando等[6]首次從粉紅粘帚菌中分離出了一種可降解玉米赤霉烯酮的內(nèi)酯水解酶ZHD101。ZHD101是目前研究最為廣泛的玉米赤霉烯酮降解酶，其在大腸桿菌和釀酒酵母中的表達(dá)產(chǎn)物可以高效的降解ZEN[7]，另外，zhd101轉(zhuǎn)基因水稻和轉(zhuǎn)基因玉米的種子也可以有效降解ZEN[8-9]，表明ZHD101具備良好的降解玉米赤霉烯酮的能力和巨大的應(yīng)用前景。Takahashi-Ando等[10]通過(guò)對(duì)ZHD101的酶學(xué)性質(zhì)表征，發(fā)現(xiàn)ZHD101的熱穩(wěn)定性較差，在50℃下迅速失活。較低的熱穩(wěn)定性使其無(wú)法滿足飼料工業(yè)中制粒工藝的溫度需求，為促進(jìn)ZHD101在飼料工業(yè)中的應(yīng)用，需要通過(guò)分子改造等手段提高其熱穩(wěn)定性。

在結(jié)構(gòu)中引入二硫鍵是提高酶的熱穩(wěn)定性的常用手段[11-14]，二硫鍵通過(guò)降低蛋白解折疊狀態(tài)的主鏈熵值和降低解折疊速度來(lái)穩(wěn)定蛋白結(jié)構(gòu)[15-16]。溫度因子（temperature factor，B factor）是表征氨基酸殘基擺動(dòng)度的重要結(jié)構(gòu)參數(shù)，溫度因子越高，氨基酸所在部位的構(gòu)象就越不穩(wěn)定，相應(yīng)的蛋白質(zhì)熱穩(wěn)定性就越差。在溫度因子高的蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)部位處引入二硫鍵，可以有效降低該部位的擺動(dòng)度，從而提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性。

我們?cè)谇捌谘芯恐性馕龀鯶HD101與底物ZEN的復(fù)合物分子結(jié)構(gòu)[17]。在此基礎(chǔ)上，作者進(jìn)行基于結(jié)構(gòu)的理性設(shè)計(jì)和分子改造，在蛋白質(zhì)結(jié)構(gòu)中溫度因子較高的部位引入二硫鍵以提高ZHD101的熱穩(wěn)定性。我們選擇了7對(duì)殘基進(jìn)行半胱氨酸突變以形成潛在的二硫鍵，進(jìn)而構(gòu)建四突變考察對(duì)熱穩(wěn)定性的影響。最后，對(duì)熱穩(wěn)定性提高的突變體進(jìn)行分析，分析二硫鍵形成的可能性和對(duì)穩(wěn)定結(jié)構(gòu)的分子基礎(chǔ)。本研究將對(duì)ZHD101在飼料工業(yè)的應(yīng)用打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 質(zhì)粒pET-46 EK/LIC-ZHD101：由臺(tái)灣大學(xué)生物科技研究所劉嚞睿教授課題組構(gòu)建。

1.1.2 試劑LB培養(yǎng)基：購(gòu)自碧迪醫(yī)療器械（上海）有限公司；Phusion高保真DNA聚合酶：購(gòu)自Thermo Science公司；Dpn I酶：購(gòu)自Fermentas公司；咪唑：購(gòu)自Merck公司；PCR產(chǎn)物純化試劑盒：購(gòu)自康維世紀(jì)生物科技有限公司；其他試劑均為國(guó)產(chǎn)分析純。

1.1.3 儀器PCR儀：購(gòu)自德國(guó)Eppendorf公司；AKTA purifier純化系統(tǒng)：購(gòu)自美國(guó)GE公司；高效液相色譜儀：購(gòu)自安捷倫科技有限公司；Ultimate XB C18 Column：購(gòu)自月旭科技上海有限公司；BCA試劑盒：購(gòu)自康維世紀(jì)生物科技有限公司。

1.2 方法

1.2.1 突變體構(gòu)建我們前期工作中解析了ZHD101 的分子結(jié)構(gòu)（PDB ID：3wzm），發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)中存在兩處B factor明顯較高的部位。我們?cè)谶@兩個(gè)區(qū)域中引入七對(duì)半胱氨酸雙突變：A110C/P196C、S136C/R189C、D143C/P181C、S147C/P181C、D199C/A202C、L200C/A231C、R204C/G205C，以形成潛在的二硫鍵，研究其對(duì)熱穩(wěn)定性的影響。所采用的定點(diǎn)突變正向引物見(jiàn)表1。

表1 本研究中使用的引物Table 1 Primers used in the study

定點(diǎn)突變采用QuikChange定點(diǎn)突變?cè)噭┖羞M(jìn)行。PCR產(chǎn)物轉(zhuǎn)化大腸感受態(tài)DH5ɑ，挑取單克隆送至華大基因測(cè)序。測(cè)序突變正確的克隆提取質(zhì)粒轉(zhuǎn)大腸表達(dá)菌株BL21（DE3）中，進(jìn)行后續(xù)表達(dá)實(shí)驗(yàn)。

1.2.2 ZHD101突變體的表達(dá)與純化挑取單菌落于5 mL含有100 μg/mL氨芐青霉素（Amp）的小試管中，37℃、220 r/min培養(yǎng)4 h。菌體生長(zhǎng)至OD 600值達(dá)0.6～0.8時(shí)，轉(zhuǎn)接1%至100 mL的LB培養(yǎng)基，37℃、220 r/min培養(yǎng)6 h。轉(zhuǎn)接1%至3 L的 LB大瓶，37℃、220 r/min培養(yǎng)4 h，降溫至16℃，加誘導(dǎo)劑IPTG至終濃度1 mmol/L，誘導(dǎo)24 h后離心收集菌體。將誘導(dǎo)表達(dá)的菌體用25 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、20 mmol/L 咪唑、pH 7.5 的緩沖液重懸，經(jīng)高壓破碎機(jī)破碎，離心后的上清液為蛋白粗酶液。將粗酶液分別用Ni-NTA親核層析柱和DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行純化。純化產(chǎn)物透析在 25 mmol/L Tris、150 mmol/L NaCl、pH 7.5的緩沖液中，并用Amicon Ultra-10k濃縮至20 mg/mL貯存。蛋白質(zhì)濃度用BCA試劑盒測(cè)定表征。

1.2.3 ZHD101野生型和突變體的活性與熱穩(wěn)定性的表征ZHD101活性測(cè)定方法由底物減少量來(lái)表征。 每個(gè)反應(yīng)體系（210 μL）包含 5 μL 底物（1 mg/mL ZEN）和 5 μL 酶（0.25 mg/mL ZHD101，野生型或突變體），反應(yīng)緩沖液為150 mmol/L NaCl、25 mmol/L Tris-HCl、pH 7.5。30 ℃反應(yīng) 10 min之后，加入 50 μL 1 mol/L HCl和 300 μL 甲醇終止反應(yīng)，產(chǎn)物過(guò)濾后取20 μL用于HPLC分析。樣品被60%的乙腈以0.6 mL/min的流速洗脫下來(lái)，吸光度檢測(cè)波長(zhǎng)為254 nm。根據(jù)峰面積計(jì)算底物的減少量。

野生型蛋白分別在 45、55、65、75、85 ℃下加熱處理1、2、10 min。熱處理過(guò)后的蛋白質(zhì)進(jìn)行活性測(cè)定以表征其熱穩(wěn)定性。突變體蛋白質(zhì)在55℃下熱處理2 min后，測(cè)殘余活性表征熱穩(wěn)定性。

2 結(jié)果與討論

2.1 ZHD101熱穩(wěn)定性

將 ZHD101 蛋白質(zhì)分別經(jīng)過(guò) 45、55、65、75、85℃加熱處理 1、2、10 min，測(cè)定殘余酶活性，見(jiàn)圖 1。ZHD101在45℃熱處理1、2 min后，殘余活性仍保持在90%以上；熱處理10 min后，殘余活性至少能保留70%。但是經(jīng)過(guò)55℃熱處理1 min后活性直接下降到30%。65、75、85℃熱處理1 min后，殘余活性直接降到20%以下。說(shuō)明ZHD101熱穩(wěn)定性較差，難以耐受飼料生產(chǎn)制粒過(guò)程中的溫度要求，需要通過(guò)分子改造的方法提高其熱穩(wěn)定性。

圖1 ZHD101的熱穩(wěn)定性Fig.1 Thermostability of ZHD101

2.2 突變位點(diǎn)的選擇

通過(guò)對(duì)ZHD101的分子結(jié)構(gòu)（PDB ID：3wzm）的分析，發(fā)現(xiàn)其結(jié)構(gòu)中存在兩處B factor明顯較高的部位（圖2（a））。B factor是表征氨基酸殘基的熱不穩(wěn)定狀態(tài)和自由活動(dòng)程度的重要參數(shù)，B factor高說(shuō)明該殘基的活動(dòng)度可能較高，B factor平均值高的區(qū)域往往具有更彈性的狀態(tài)和較低的熱穩(wěn)定性[18]。因此，在B factor較高即彈性較高的區(qū)域引入二硫鍵應(yīng)能起到穩(wěn)定局部結(jié)構(gòu)的作用，從而提高酶的熱穩(wěn)定性[19-21]?；谏鲜銎者m原則，人們已開(kāi)發(fā)相應(yīng)的程序，根據(jù)B factor的高低更好的推測(cè)引入二硫鍵的位置以有效提高蛋白質(zhì)的熱穩(wěn)定性[22]。在本研究中，我們將ZHD101分子結(jié)構(gòu)在Pymol軟件中根據(jù)B factor的大小直觀的顯示，在其中B factor較高的區(qū)域中引入七對(duì)二硫鍵（圖2（b）），研究其對(duì)熱穩(wěn)定性的影響。

圖2 ZHD101-ZEN復(fù)合體的結(jié)構(gòu)和突變位點(diǎn)的選擇Fig.2 Complex structure of ZHD101 with the substrate ZEN and the mutation sites distribution

2.3 ZHD101突變體的表達(dá)與純化

含突變質(zhì)粒pET46-zhd101-mutants的菌液經(jīng)IPTG誘導(dǎo)后，離心收集上清液，高壓破碎后離心制備總蛋白質(zhì)，采用SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)圖3。IPTG誘導(dǎo)24 h后，在相對(duì)分子質(zhì)量28 700附近處有明顯的誘導(dǎo)條帶，大小與目的片段相符，表明突變體蛋白獲得成功表達(dá)。

突變重組酶經(jīng)過(guò)Ni親和層析和DEAE Sepharose Fast Flow陰離子交換樹(shù)脂進(jìn)行兩步純化并透析除鹽后，對(duì)純化樣品進(jìn)行SDS-PAGE分析，結(jié)果見(jiàn)圖4。純化的蛋白質(zhì)在28 700附近處顯示為單一條帶，與目的蛋白質(zhì)相對(duì)分子質(zhì)量大小相符，經(jīng)活性測(cè)試驗(yàn)證為目的蛋白質(zhì)，可用于后續(xù)酶學(xué)性質(zhì)分析。

圖3 ZHD101突變體表達(dá)的電泳圖Fig.3 Expression of ZHD101 mutants

圖4 ZHD101-mutants純化電泳圖Fig.4 Purification and the SDS-PAGE analysis of ZHD101-mutants

2.4 突變體的活性和耐熱性表征

突變體蛋白純化后稀釋至0.25 mg/mL，進(jìn)行活性和耐熱性的測(cè)定，結(jié)果見(jiàn)圖5（a）。D143C/P181C、S147C/P181C、L200C/A231C三個(gè)突變體的活性均為WT的90%以上；另外三個(gè)突變體A110C/P196C、D199C/A202C、R204C/G205C 的 活 性 僅 為WT的70%以上；而突變體S136C/R189C的活力只有WT的50%左右。50℃加處理2 min后，突變體R204C/G205C和L200C/A231C的殘余活性和野生型一致；突變體 D199C/A202C、S147C/P181C和A110C/P196C的殘余活性低于野生型，其中突變體A110C/P196C的殘余活性最低。而突變體S136C/R189C和D143C/P181C的殘余活性高于野生型，其中突變D143C/P181C的殘余活性是野生型的兩倍左右。在此基礎(chǔ)上，我們?cè)O(shè)計(jì)了四突變S136C/D143C/P181C/R189C，活性測(cè)試結(jié)果見(jiàn)圖 5（b）。 該突變體的活力為野生型的75%，而50℃加熱處理2 min后的殘余活性大約為野生型活性的兩倍，即相對(duì)于雙突變D143C/P181C，活性降低，熱穩(wěn)定性沒(méi)有明顯的改善。

圖5 突變體和野生型的活性和耐熱性比較Fig.5 Thermostability and activity comparison of the wide type and mutants

2.5 熱穩(wěn)定性提高的突變體形成二硫鍵的潛力分析

已知二硫鍵的χ3扭轉(zhuǎn)角呈雙相分布，集中在-80°和+100°兩個(gè)區(qū)域，而形成二硫鍵的能量一般在0～4.5 kcal/mol范圍內(nèi)，均值為1.07 kcal/mol。經(jīng)過(guò)Disulfide by Design軟件分析，突變體D143C/P181C的兩個(gè)半胱氨酸位點(diǎn)形成潛在二硫鍵的χ3扭轉(zhuǎn)角和能量均符合要求，見(jiàn)表2，說(shuō)明突變體在該位置有較大可能形成二硫鍵。而S136C/R189C兩個(gè)半胱氨酸形成二硫鍵的χ3扭轉(zhuǎn)角和能量不在上述范圍內(nèi)，表明形成二硫鍵的穩(wěn)定性可能較低。

表2 突變體形成潛在的二硫鍵的扭轉(zhuǎn)角和能量Table 2 Estimated χ3 torsion angle and an energy value of the mutation

2.6 突變體熱穩(wěn)定性提高的結(jié)構(gòu)基礎(chǔ)

通過(guò)對(duì)突變體D143C/P181C的結(jié)構(gòu)分析，發(fā)現(xiàn)D143C存在于α1和α2之間的loop環(huán)上，P181C存在于α3的中間位置，二者形成的二硫鍵穩(wěn)定了分子結(jié)構(gòu)中B factor最高的這三個(gè)α螺旋，見(jiàn)圖6。且α3螺旋中存在對(duì)酶活性起關(guān)鍵作用的重要氨基酸W183，W183通過(guò)與底物ZEN形成的氫鍵和堆疊作用穩(wěn)定底物，該氨基酸的突變將使ZHD101完全失活[16]。因此，在此處引入二硫鍵，對(duì)穩(wěn)定這三個(gè)α螺旋的位置、減少擺動(dòng)、同時(shí)固定關(guān)鍵氨基酸W183的位置，均起重要的作用。因此，此處引入的二硫鍵能有效提高酶的熱穩(wěn)定性。同時(shí)，D143C/P181C二硫鍵的位置遠(yuǎn)離底物結(jié)合中心和催化三聯(lián)體，對(duì)活性的影響很小。

另外，R189C/S136C雙突變也增加了ZHD101的熱穩(wěn)定性。由圖6可知，該處的二硫鍵同樣可能是由于穩(wěn)定了α1螺旋而增加結(jié)構(gòu)的熱穩(wěn)定性。由于該處的二硫鍵僅穩(wěn)定了一個(gè)α1螺旋，因此相對(duì)于D143C/P181C來(lái)說(shuō)，熱穩(wěn)定性提高的程度略低。而四突變將上述兩個(gè)二突變組合起來(lái)，R189C/S136C對(duì)α1螺旋的穩(wěn)定作用被D143C/P181C對(duì)α1-α3三個(gè)螺旋的穩(wěn)定作用所覆蓋，因此四突變對(duì)熱穩(wěn)定性的貢獻(xiàn)并不優(yōu)于D143C/P181C雙突變。

圖6 兩個(gè)熱穩(wěn)定性提高的雙突變?cè)诜肿咏Y(jié)構(gòu)中的位置Fig.6 Location of D143C/P181C andR189C/S136C double-mutations in ZHD101 structure

3 結(jié) 語(yǔ)

通過(guò)對(duì)蛋白質(zhì)分子結(jié)構(gòu)的分析，利用定點(diǎn)突變?cè)诮Y(jié)構(gòu)中擺動(dòng)度較大的位置引入半胱氨酸以形成潛在的二硫鍵，成功提高了內(nèi)酯水解酶ZHD101的熱穩(wěn)定性。經(jīng)過(guò)Disulfide by Design軟件分析，證明其中引入的一對(duì)半胱氨酸符合形成二硫鍵的條件。進(jìn)一步分析了兩處二硫鍵提高ZHD101熱穩(wěn)定性的分子基礎(chǔ)。本研究為酶的熱穩(wěn)定性改造提供了新的思路，同時(shí)為促進(jìn)霉菌毒素降解酶ZHD101在飼料工業(yè)的應(yīng)用打下了基礎(chǔ)。