馬 晶，孫柳柳，馬文囡，陶義芬，陳 蘊，朱瑞宇，金 堅

（江南大學 藥學院，江蘇 無錫 214122）

小鼠骨肉瘤病毒癌基因同源物B（FBJmurine osteosarcoma viral oncogene homolog BFOSB或FOSB）是Fos轉錄因子家族的一員，與細胞的增殖、分化、轉化及腫瘤發(fā)生密切相關。Fos家族包括4種轉錄因子：FOS、FOSB、FOSL1和FOSL2， 這些基因能夠編碼亮氨酸拉鏈蛋白，與其它蛋白質形成同源或異源二聚體，二聚體與靶基因的堿性激活因子-1（Activatingprotein-1，AP-1）結合，以調節(jié)靶基因的表達[1]。FOSB基因的蛋白質產物除全長的FOSB外，還存在一個在C端比FOSB短101個氨基酸殘基的DeltaFOSB蛋白[2]，它是一種FOSB的較短的剪切形式，但比FOSB更為穩(wěn)定，在治療慢性上癮癥狀中扮演著重要的角色[3-6]。而FOSB基因不僅與藥物成癮相關，也與乳腺癌和卵巢癌的發(fā)生有關，在誘導因子的作用下會引起三陰性乳腺癌細胞的死亡[7-9]。最近研究發(fā)現，FOSB基因有望成為血管內皮瘤細胞及胃癌細胞的有效生物標記物[10-11]，而對FOSB基因蛋白表達調控機制的研究，很少報道。

真核生物中經典的翻譯機制是帽依賴型的翻譯起始機制，需要mRNA上的帽子結構和真核翻譯起始因子來招募核糖體進而起始翻譯。然而在病毒中，存在著另一種更為高效的翻譯起始機制，即非帽依賴型翻譯起始機制，其mRNA并沒有帽子結構，核糖體的40S小亞基直接通過識別mRNA序列結構或mRNA的5’非翻譯區(qū)（5’UTR）起始翻譯。其mRNA 5’UTR上核糖體能識別的序列稱為內部核糖體進入位點（（internal ribosme entry site，IRES）[12]。事實上，在真核生物中，也已發(fā)現許多轉錄因子的mRNA具有IRES活性，而這些轉錄因子大多與細胞增殖、分化、凋亡以及細胞耐藥等有關，如血管內皮生長因子 （Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）[13]、NF-κB 抑 制 因 子 （NF-κB repressing factor，NRF）[14]、原癌基因 c-myc[15]、DNA 損傷結合蛋白 2（DNA damage-binding protein 2，DDB2）[16]、核糖體結合蛋白 1（Ribosome Binding Protein 1，RRBP1）[17]等。而已發(fā)現的IRES元件通常5’UTR偏長、GC含量豐富、二級結構復雜。FOSBmRNA 5’UTR符合上述IRES的基本特征，作者將FOSBmRNA 5’UTR的基因序列插入到研究IRES活性常用的雙熒光素酶報告質粒（pRL-FL）中，檢測其是否有IRES活性并初步探究其IRES的結構與功能。

1 材料與方法

1.1 實驗材料

在實驗室初期構建并保存真核表達載體即雙熒光素酶報告載體pRL-FL以及去啟動子載體pRL-FL△SV40；大腸桿菌DH5a：天根生化科技有限公司；DNA限制性內切酶NdeⅠ和EcoRⅠ：Fermantas公司；T4 DNA連接酶和prime STAR HS DNA聚合酶：TaKaRa公司；重組質粒pRL-FOSBFL：作者構建；重組質粒pRL-c-myc-FL：中美泰和購買，DMEM、RPMI1640培養(yǎng)基和胎牛血清：美國Gibco公司；人胚腎細胞HEK293、人卵巢癌細胞A2780/WT、人結腸癌細胞HCT-8/WT、人肝癌細胞Bel-7402/WT及宮頸癌細胞Hela/WT：均保存于作者所在實驗室的液氮罐中；紫杉醇，順鉑藥物：Sigma公司；LipofectamineTM 2000：美國Invitrogen公司；雙熒光素酶報告基因檢測試劑盒（Dual?Luciferase Reporter Assay System）：美國Promega公司；其他試劑均為分析純試劑。

1.2 表達載體的構建

FOSB 5’UTR cDNA 序列 （NM_001114171）由生工生物工程（上海）有限公司合成，合成序列含有NdeⅠ和EcoRⅠ酶切位點。FOSB5’UTR的全長基因序列和實驗所需的各截短基因序列均以重組質粒pRL-FOSB-FL為模板進行擴增，在SV40啟動子的載△pRL-FL上插入FOSB5’UTR的全長基因序列，構建△pRL-FOSB-FL；同時又載體pRL-FL上插入各截短片段，構建出的截短片段的重組質粒分別為 pRL-FOSB-J1-FL （-376 to-1）、pRL-FOSBJ2-FL（-592 to-217）、pRL-FOSB-J3-FL（-592 to-377）、pRL-FOSB-J4-FL （-188 to-1）、pRL-FOSBJ5-FL（-377 to-217）。將各重組質粒轉化到感受態(tài)大腸桿菌Escherichia coliDH 5a中，涂板搖菌后，將菌液送至生工生物工程（上海）股份有限公司進行測序，質粒截短PCR所用引物見表1，其中下劃線是NdeI和EcoRI的酶切位點和保護堿基。引物均由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。

表1 構建截短質粒PCR所用引物序列Table 1 Oligonucleotide primers used in PCR for deletion plasmids construct

1.3 細胞培養(yǎng)與轉染

人胚腎細胞HEK293、人卵巢癌細胞A2780/WT、人宮頸癌細胞Hela/WT培養(yǎng)于DMEM完全培養(yǎng)基（加10%的血清），而肝癌細胞Bel-7402/WT和結腸癌細胞HCT-8/WT培養(yǎng)于RPMI 1640完全培養(yǎng)基（加10%的血清），待細胞長至80%～90%時，用胰酶消化傳代，待細胞再次長至80%～90%時，鋪細胞于24孔板，鋪板后第二天加入100 uL的opti-MEM，1 ug的質粒以及 2 uL的 LipofectamineTM 2000混勻，孵育25 min，加入已換好液的24孔板中，培養(yǎng) 18～24 h后將細胞用 1×PLB（Passive Lysis Buffer）裂解，收于-80℃待用。

1.4 雙熒光素酶檢測活性

在24孔板中鋪細胞（70%～80%），細胞貼壁后（16～24 h）將質粒轉染進細胞中，24 h后取出24孔板，用PBS洗兩遍，可輕微振蕩，并用槍頭將殘留PBS 吸干，加 100 uL 1×PLB（Passive Lysis Buffer）到每個孔中去裂解細胞，并在搖床上充分裂解15 min后，用槍頭吹打板底并收集細胞裂解液，將待檢樣置于-80℃中保存。對雙熒光素酶的活性檢測時，準備干凈的Corning Costar 96孔白板，先加入20 uL的細胞裂解液，接著將加過裂解液的孔板放在GloMaxTM_96孔板發(fā)光檢測儀上，然后加入100 uL的螢火蟲熒光素酶底物（LARⅡ），在充分混合后迅速地測定其熒光值，最后加入100 uL的反應終止液海腎熒光素酶底物（Stop&Glo?reagent），使之充分混勻后，再測其熒光值。IRES的活性以螢火蟲熒光素酶活性與海腎熒光素酶活性的比值表示（即Fluc/Rluc）。

1.5 統計學分析方法

本研究所有的數據均用GraphPad Prism 5.0軟件分析，統計數據采用SEM表示，組間比較采用Student t檢驗分析統計學差異。 *：P<0.05；**：P<0.005；***：P<0.000 5。

2 結果與分析

2.1 FOSB序列與結構分析

在NCBI里搜索FOSB序列發(fā)現，FOSB序列較長（592 bp）（見圖 1（a））且 GC 含量偏高（56.5%），在各種族間序列同源性較高達到55.74%（見圖1（b））。而用RNA Folding Form模擬其二級結構（見圖 1（c）），可以看出 FOSB 5′UTR 可以形成穩(wěn)定且復雜的二級莖環(huán)結構（ΔG=-202.87 kcal/mole），存在潛在的IRES元件。

2.2 FOSB mRNA 5’UTR IRES活性初步確定

FOSBmRNA 5’UTR是否含有 IRES活性，目前仍要借用工具質粒，而檢測mRNA是否有IRES元件，國際上較為通用的是雙順反子報告載體的方法，由帽依賴型機制來起始載體中的第一個順反子翻譯，在載體上游順反子的3’端和下游順反子的5’端間插入有潛力的IRES元件，來介導下游順反子的翻譯[18]。而本研究中用到的雙熒光素酶報告載體，上游是螢火蟲熒光素酶（FL），下游是海腎熒光素酶（RL）。如圖2（a）所示，在RL和FL之間有許多克隆位點，將基因目的片段克隆到I兩個酶切位點（NdeI和EcoR）之間，通過兩個熒光素酶活性比值的大小，來判斷目的基因是否具有IRES活性，如FL比RL的活性較高時，可初步認為該目的基因有潛在的IRES元件。作者將FOSB5’UTR序列和陽性對照c-myc 5’UTR序列分別插入到報告載體pRL-FL兩個閱讀框中間構建目的載體pRLFOSB-FL、pRL-c-myc-FL（圖 2（b）），其中陽性對照與陰性對照分別是pRL-c-myc-FL與pRL-FL。然后將這三種質粒分別轉染進人胚腎細胞HEK293中，收集細胞裂解液，24 h后，接著通過雙熒光素酶分析實驗得到Fluc/Rluc的值。結果pRL-FOSB-FL活性遠大于陰性質粒（***，P<0.000 5），且與陽性質粒pRL-c-myc-FL活性相似，初步確定FOSBmRNA 5’UTR中存在假定的IRES元件。

雖然雙熒光素酶報告基因檢測系統已相對成熟，但如果插入的檢測序列中有內部啟動子，就會在細胞內形成含有下游螢火蟲熒光素酶的單順反子mRNA的存在，從而影響實驗結果的判斷。為了排除這種潛在的可能性，于是將載體pRL-FL中的SV40啟動子刪除，從而得到新的載體ΔpRL-FL（圖2（c）），接著仍將FOSBmRNA 5’ UTR 基因克隆到這個載體的兩個酶切位點（NdeI和EcoRI）之間，如FL有高表達，則目的基因中有隱含啟動子，反之沒有內部啟動子。將FOSB克隆到載體△pRL-FL上得到△pRL-FOSB-FL，分別將pRL-FOSB-FL與△pRL-FOSB-FL瞬轉染入人胚腎細胞HEK293中，24 h后收集細胞并充分裂解，通過1.5實驗步驟可得 Fluc/Rluc的值。如圖 2（d）所示，△pRL-FOSBFL的RL與FL值均遠小于pRL-FOSB-FL的值（***，P<0.000 5），所以FOSB不含有內部啟動子，進一步證明FOSBmRNA 5’UTR具有IRES活性。

圖1 FOSB mRNA 5’UTR序列與結構分析Fig.1 Sequence and structure analysis of FOSB mRNA 5’UTR

2.3 FOSB mRNA 5’UTR IRES活性中心的鑒定

對FOSB 5’UTR IRES元件活性中心域的的探究，通過RNA Folding Form軟件來模擬FOSBmRNA 5’UTR全長序列的二級結構，并對其二級結構進行分析，分別構建了5個截短質粒：pRLFOSB-J1-FL（-376 to-1）、pRL-FOSB-J2-FL（-592 to-217）、pRL-FOSB-J3-FL （-592 to-377）、pRLFOSB-J4-FL（-188 to-1）、pRL-FOSB-J5-FL（-377 to-217）。將pRL-FOSB-FL以及各截短質粒瞬轉染入人胚腎細胞HEK293與肝癌細胞Bel-7402中，24 h后收集細胞裂解液用于測定Fluc/Rluc（見圖3（a）），兩種細胞的測活結果基本一致。首先從5’端開始截短，發(fā)現-376至-1活性僅降為全長活性的75%左右，說明5’端可能對其活性貢獻較大；繼續(xù)截短發(fā)現在-188至-1活性降為全長的21%～30%，猜測可能中間片段對其IRES活性貢獻更大；為了驗證其3’端的重要性，對3’端進行截短，發(fā)現-592至-377活性下降了75%左右，證明3’端對其IRES活性確實重要，但是截到-217（即-592至-217）時活性又增加到全長的60%左右，懷疑其活性中心序列可能是位于中間的-376至-217，并將該片段插入到雙順反子載體pRL-FL中。如圖3（b）所示，截短質粒-376至-217與全長活性相比，展現出為全長活性的70%～85%，從而判斷確定其IRES活性中心為-376至-217，即-376至-217對最高活性的貢獻較大。結果顯示FOSB mRNA 5’端非翻譯區(qū)-376至-217序列可能是其IRES活性重要活性區(qū)域，而其兩端序列可能抑制其IRES的活性。

圖2 FOSB mRNA 5'UTR IRES活性初步確定Fig.2 Activity of FOSB mRNA 5'UTR IRES preliminary determined

2.4 FOSB mRNA 5’UTR在各細胞中的IRES活性

從上述實驗不難發(fā)現，FOSBmRNA 5’UTR在HEK293細胞與Bel-7402/WT細胞中IRES活性不同，其中在肝癌細胞Bel-7402/WT中活性較高。為了繼續(xù)探究其IRES活性在癌細胞中是否是異常表達，作者將重組質粒pRL-FOSB-FL轉染進另外3株癌細胞包括人卵巢癌細胞A2780/WT、人結腸癌細胞HCT-8/WT、人宮頸癌細胞Hela[19]。24 h后收集細胞裂解液，測定螢火蟲熒光素酶和海腎熒光素酶的活性并計算其比值（Fluc/Rluc）。如圖4所示，在不同細胞中FOSBmRNA 5’UTR IRES活性有著明顯的區(qū)別，其中與HEK293細胞相比，A2780/WT中的活性較高（***，p<0.000 5），Hela 與 Bel-7402/WT細胞的活性也高于 HEK293 細胞（*，p<0.05；**，p<0.005）。而大多數文獻報道[20]，IRES的活性與細胞中 IRES 結合蛋白（IRES trans-acting factors，ITAFs）的表達量有密切關系，可能在這些癌細胞中，其ITAFs表達量較高，這需要進行進一步的研究。

圖3 重組質粒pRL-FOSB-FL及其截短轉染細胞的IRES的相對活性Fig.3 Relative IRES activities of cells transfected with recombinant plasmids pRL-FOSB-FL and its deletions

2.5 FOSB mRNA 5’UTR在細胞壓力下的IRES活性

將重組質粒pRL-FOSB-FL轉染進肝癌細胞Bel-7402/WT中24 h以后，分別用藥物紫杉醇（PTX）和順鉑（DDP）處理細胞，PTX 的使用質量濃度分別為 0、0.25、0.5 ug/mL，DDP 的使用質量濃度為 0、0.5、1 ug/ml），加藥培養(yǎng) 18 h，在兩種藥物中，隨著藥物質量濃度的增加，其IRES活性均呈現逐漸上升的趨勢，見圖5。說明IRES作為一種應激翻譯起始機制，在藥物刺激下FOSBIRES活性會增加，另外在紫杉醇刺激下比順鉑更為明顯 （*，p<0.05；**，p<0.005），可能與藥物不同的作用機制相關。

圖4 重組質粒pRL-FOSB-FL轉染各個細胞的熒光素酶的相對活性Fig.4 Rletive luciferase activity of pRL-FOSB-FL in various cell lines.（*，p ＜0.05；**，p ＜0.005；***，p ＜0.000 5；student t test）.The expression data are presented asthemean + SEM oftriplicate samples

圖5 細胞壓力條件對Bel-7402細胞中FOSB IRES活性的影響Fig.5 FOSB IRES activity in Bel-7402 cells during different cell stress （*，p＜0.05；**，p＜0.005；***，p＜0.000 5；student t test）.The expression data are presented asthemean + SEM oftriplicate samples

3 結語

在真核生物內環(huán)境穩(wěn)定狀態(tài)下大多以帽依賴型機制進行翻譯，而真核細胞處于細胞壓力條件（低氧、饑餓、藥物刺激），此時細胞的生長、分化及凋亡會使細胞的穩(wěn)態(tài)迅速打亂。這時帽依賴的翻譯效率會降低，而此時IRES介導的翻譯卻會增加，進而使細胞繼續(xù)維持穩(wěn)態(tài)環(huán)境。FOSB作為立早基因中的一員，在多種刺激后會立即表達，從而產生不同的轉錄因子，進而調控其他基因的轉錄與表達來維持細胞的生長、發(fā)育和分化[21]。最新的報道顯示，FOSB基因在抗癌藥物的刺激下在細胞增殖速率增加[22]，故作者在研究FOSBmRNA 5'UTR活性的同時，對其進行加藥刺激，發(fā)現其不僅具有IRES活性，并且其在抗癌藥物（紫杉醇和順鉑）刺激下IRES活性增加，這或許與IRES是一種應激翻譯機制，能夠維持IRES在細胞壓力條件下的基本表達密切相關。另外FOSB/ΔFOSB作為慢性成癮的關鍵分子轉換機制，在成癮藥物慢性刺激后出現累積現象，并表現出獨特的高度穩(wěn)定性[23]，這暗示著FOSBmRNA 5'UTR的IRES活性可能與其在藥物刺激下的穩(wěn)定表達有關。

據文獻報道，具有IRES活性的RNA有以下特征：1）富含 GC 堿基；2）較長的 5'UTR；3）二級結構較復雜。決定IRES功能的因素是IRES元件的序列結構以及其反式作用因子（ITAFs），故IRES元件研究的熱門總是去尋找其序列結構抑或者機制上的共性。而作者通過截短分析發(fā)現了FOSBmRNA 5'UTR IRES活性中心位于其5'UTR的-376至-217之間，并通過將該片段連接到雙順反子載體再次驗證-376至-217的IRES活性。相較于國內外已報道的細胞內的IRES元件，FOSBIRES元件在序列與結構上相似度均不高，但是通過在NCBI里面進行序列搜索，并在DNAMAN中對其物種間同源性進行比對，發(fā)現種族間相似性達55%以上，其同源性位置包括其活性中心，IRES的活性序列位于FOS基因種族保守序列中，這間接說明了FOSBIRES序列的保守性，暗示IRES元件在Fos家族中具有相對穩(wěn)定性。

FOSB/Delta FOSB與藥物成癮的機制研究較多，而其與腫瘤形成的機制鮮少提到，其實FOSB與乳腺癌和卵巢癌的形成密切相關，而目前的研究顯示，在FOSB基因在乳腺癌、卵巢癌、胃癌及肺癌等多種癌細胞中發(fā)揮重要的作用，這或使FOSB基因成為某些腫瘤的診斷標志物，用于腫瘤的預防。而本研究中選用不同的癌細胞測其IRES活性，發(fā)現FOSBIRES活性在不同的癌細胞中明顯不同，在卵巢癌細胞中活性較高，這為其成為腫瘤診斷標志物提供了另一種思路。