喬卿梅，程茂高，馬 霞

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院，河南 鄭州 450046)

應(yīng)激反應(yīng)是動物機(jī)體受到體內(nèi)及外界環(huán)境變化刺激時產(chǎn)生的一種適應(yīng)性反應(yīng)。應(yīng)激反應(yīng)對畜禽的危害主要表現(xiàn)在破壞機(jī)體的防御系統(tǒng)，使機(jī)體的免疫力降低，最終喪失對疾病的抵抗力，導(dǎo)致傳染病的發(fā)生，甚至?xí)霈F(xiàn)不同程度的畜禽死亡現(xiàn)象[1-2]。機(jī)體中T淋巴細(xì)胞與B 淋巴細(xì)胞的分化、增殖主導(dǎo)著免疫應(yīng)答反應(yīng)機(jī)制，是體現(xiàn)機(jī)體免疫能力的重要指標(biāo)[3]。T淋巴細(xì)胞與B 淋巴細(xì)胞主要聚集在脾臟。根據(jù)中醫(yī)發(fā)病原理與病機(jī)學(xué)說，機(jī)體的正氣在維持正常的生理功能、抗病驅(qū)邪和病后自我修復(fù)等方面起著決定性的作用，虛證的病機(jī)主要是正氣不足，臟腑、經(jīng)絡(luò)等生理功能減弱，抗御邪氣的能力下降[4]?，F(xiàn)代藥理研究也表明，中醫(yī)辨證為虛證者常表現(xiàn)出免疫功能低下現(xiàn)象[5]。當(dāng)動物的免疫力低下時，發(fā)病率就會升高，而補(bǔ)益類中藥多能增強(qiáng)機(jī)體的非特異性免疫、細(xì)胞免疫及體液免疫功能[6]，從而提高抗病能力。本試驗(yàn)以黃芪、玉竹、黃精、山藥等補(bǔ)益類中藥組成中藥復(fù)方，研究該中藥復(fù)方對小鼠抗應(yīng)激反應(yīng)和免疫能力的影響，以期為中藥免疫增強(qiáng)劑的開發(fā)提供參考。

1 材料與方法

1.1 主要材料

印度墨汁(Blotopped公司)；刀豆蛋白 A(ConA)、RPMI1640(均為SIGMA公司)；20% SRBC(鴻泉生物)；Yac-1細(xì)胞(中科院上海細(xì)胞生物所)；豚鼠血清、胎牛血清(均為北京博爾西)；四甲基偶氮唑鹽(MTT)、二甲基亞砜(DMSO)(均為南京化學(xué)試劑公司)；淋巴細(xì)胞分離液(天津?yàn)?；Varioskan LUX型酶標(biāo)儀(芬蘭賽默飛)；X1R型高速冷凍離心機(jī)(德國賽默飛)；RE-2000A旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)器(常州智陽)；CO2培養(yǎng)箱(德國賽默飛)。

中藥飲片黃芪、黃精、女貞子、山藥、玉竹、枸杞子均購自北京同仁堂大藥房(鄭州店)。按照處方要求進(jìn)行煎煮，合并濾液，經(jīng)旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)濃縮至相當(dāng)于2 g/mL生藥的濃度，放入4 ℃冰箱備用。健康SPF級小鼠購于河南省實(shí)驗(yàn)動物中心，雌雄各半，體重20±2 g。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 試驗(yàn)設(shè)計(jì)

試驗(yàn)前分別取8.337 mL、16.66 mL、50 mL的中藥濃縮液加蒸餾水定容至50 mL。設(shè)低(6.67 g/kg BW)、中(13.33 g/kg BW)、高(40 g/kg BW)三個劑量組(分別相當(dāng)于人體推薦劑量的5、10和30倍)和蒸餾水陰性對照組[7-8]。每組用小鼠6只(雌雄各半)。每天固定時間按0.02 mL/g BW用量給小鼠灌喂，其他時間均給予滅菌鼠飼料和滅菌水自由攝食飲用。每周測一次小鼠體重，根據(jù)體重的變化，對給藥量進(jìn)行適當(dāng)調(diào)整。持續(xù)灌喂28 d后進(jìn)行相關(guān)測定。

1.2.2 中藥復(fù)方對小鼠應(yīng)激反應(yīng)能力的影響

參照陳奇等[5]的研究方法，對小鼠進(jìn)行抗疲勞游泳測試、耐高溫測試和耐常壓缺氧測試。

1.2.3 中藥復(fù)方對小鼠免疫能力的影響

1.2.3.1 小鼠臟器指數(shù)的測定

小鼠頸椎脫臼處死，先稱體重，再放入75%酒精中浸泡3 min，移入超凈工作臺，取出脾臟、胸腺，用濾紙吸干臟器上的血污，稱量臟器濕重，計(jì)算小鼠臟器指數(shù)。小鼠臟器指數(shù)=臟器重/體重(mg/g)。

1.2.3.2 小鼠血清溶血素的測定

小鼠從結(jié)束給藥前第6 d開始，每天腹腔注射20% SRBC 0.2 mL，6 d后摘除眼球取血，置于抗凝離心管內(nèi)，2000 r/min冷凍離心10 min，小心吸取血清，用生理鹽水稀釋50倍供測試。另取10 mL離心管，依次加入50倍稀釋的小鼠血清1 mL、補(bǔ)體(豚鼠血清)0.5 mL、20% SRBC 0.5 mL，混勻后置37 ℃恒溫水浴中反應(yīng)10 min，冰浴終止反應(yīng)。空白對照管將血清替換為生理鹽水，其他同樣品管。用酶標(biāo)儀在540 nm波長處讀取吸光度A值[9-10]。

1.2.3.3 小鼠脾淋巴細(xì)胞增殖能力的測定(MTT法)[11]

小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾臟，制備脾細(xì)胞懸液，用含10%胎牛血清的RPMI1640將脾細(xì)胞濃度調(diào)整為每毫升約3×106個。將脾細(xì)胞懸液加入96孔板中，每孔加入1 mL，每個處理設(shè)6孔，其中3孔加ConA液81 μL(相當(dāng)于5 μg/mL)，3孔不加ConA液。放置在37 ℃含5% CO2的培養(yǎng)箱中培養(yǎng)68 h，培養(yǎng)板各孔內(nèi)加入5 mg/mL MTT液10 μL，37 ℃繼續(xù)培養(yǎng)4 h。取出培養(yǎng)板，2000 r/min離心5 min，棄上清液，于各孔內(nèi)加入150 μL DMSO，溶解10 min或者在振蕩器上充分震蕩30 s，靜止數(shù)分鐘后用酶標(biāo)儀在波長570 nm下測定A值，用加ConA液孔的A值減去不加ConA液孔的A值表示淋巴細(xì)胞增殖能力。

1.2.3.4 單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力的測定(碳廓清試驗(yàn))

用無菌注射器從小鼠尾靜脈緩緩注入20%印度墨汁，注射量為0.01 mL/g，注射完后用秒表計(jì)時。在注射后的2 min與10 min，用毛細(xì)管分別從目內(nèi)眥靜脈叢取血20 μL，并立即加入到裝有2 mL 0.1% Na2CO3溶液的離心管中，充分混合均勻。用酶標(biāo)儀在波長675 nm處測吸光度A值，以0.1% Na2CO3溶液做空白對照。

在超凈工作臺上處死小鼠，取出脾臟和肝臟，用濾紙吸干脾臟和肝臟表面的血污，在電子天平上分別稱重記錄[5]。

吞噬指數(shù)α=[體重/(肝重+脾重)]×K/3

K=(lgA1-lgA2)/(t2-t1)，為未經(jīng)校正的吞噬指數(shù)。A1為t1(2min)血標(biāo)本的A值，A2為t2(10 min)血標(biāo)本的A值。

1.2.3.5 小鼠脾臟自然殺傷(NK)細(xì)胞活性測定

(1)效應(yīng)細(xì)胞的制備：小鼠頸椎脫臼處死，無菌取脾臟后用RPMI1640沖洗2次，置培養(yǎng)皿上方200目篩網(wǎng)內(nèi)，用鑷子輕輕撕碎，加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液，用無菌注射器內(nèi)芯輕輕研磨脾臟。將培養(yǎng)皿中含有脾細(xì)胞的淋巴細(xì)胞分離液移至10 mL離心管中，再加入4 mL淋巴細(xì)胞分離液，并沿管壁緩緩加入500 μL的RPMI1640，形成界面。2500 r/min離心30 min，離心結(jié)束后，吸取中間云霧狀淋巴細(xì)胞層，移至15 mL的離心管中，再加入10 mL RPMI1640，吹打混勻，1000 r/min離心10 min，棄上清液，用含10%胎牛血清的RPMI1640將脾細(xì)胞濃度調(diào)整為每毫升約2×107個。

(2)靶細(xì)胞的制備：取對數(shù)生長期的Yac-1細(xì)胞，離心棄去上清液，用含10%胎牛血清的RPMI1640配成濃度為每毫升約4×105個的細(xì)胞懸液。

(3)NK細(xì)胞活性測定：每個處理各設(shè)一個試驗(yàn)孔、一個靶細(xì)胞對照孔和一個效應(yīng)細(xì)胞對照孔。試驗(yàn)孔中加入效應(yīng)細(xì)胞和靶細(xì)胞各100 μL(效靶比50:1)；靶細(xì)胞對照孔加靶細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL；效應(yīng)細(xì)胞對照孔加效應(yīng)細(xì)胞和培養(yǎng)液各100 μL，每個處理作3個復(fù)孔。將所有的試驗(yàn)孔和對照孔放在37 ℃、5% CO2培養(yǎng)箱中培養(yǎng)，24 h后，各孔均直接加入20 μL MTT(5 mg/mL)，再放入CO2培養(yǎng)箱孵育4 h，3000 r/min離心10 min，吸棄上清，各孔加150 μL二甲基亞砜，用酶標(biāo)儀在570 nm波長下測量吸光度值A(chǔ)。

NK細(xì)胞活性(%)=[1-(A(試驗(yàn)孔)-A(效應(yīng)細(xì)胞對照孔))/A(靶細(xì)胞對照孔)]×100%

1.3 數(shù)據(jù)處理

試驗(yàn)數(shù)據(jù)采用“平均值±標(biāo)準(zhǔn)差”來表示最終結(jié)果，應(yīng)用SPSS 20軟件進(jìn)行數(shù)據(jù)分析。

2 試驗(yàn)結(jié)果

2.1 中藥復(fù)方對小鼠應(yīng)激反應(yīng)能力的影響

表1 灌喂中藥復(fù)方后小鼠的應(yīng)激反應(yīng)時間 min

注：同行不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)

由表1可知，以小鼠游泳時間為指標(biāo)觀察中藥復(fù)方對小鼠的抗疲勞作用，中、高劑量組與對照組、低劑量組之間存在極顯著性差異，而低劑量組和對照組之間差異不顯著。耐高溫試驗(yàn)結(jié)果表明：低、中、高劑量組與對照組相比，均存在極顯著性差異，而且中劑量與低劑量、高劑量之間也存在極顯著差異。小鼠耐常壓缺氧試驗(yàn)結(jié)果顯示，不同劑量組與對照組之間差異不顯著。

2.2 中藥復(fù)方對小鼠免疫能力的影響

2.2.1 小鼠臟器指數(shù)

胸腺和脾臟作為重要的免疫器官，對機(jī)體的免疫功能調(diào)節(jié)具有重要作用，胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)的高低取決于中藥復(fù)方對免疫器官的影響[5]。本試驗(yàn)結(jié)果見表2，可以看出，不同劑量組的臟器指數(shù)與對照組相比，均無顯著性差異(P>0.05)，說明不同劑量的中藥復(fù)方對小鼠的胸腺指數(shù)和脾臟指數(shù)無明顯影響。

表2 中藥復(fù)方對小鼠免疫器官指數(shù)的影響 mg/g

注：同行不同大寫字母表示處理間差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示處理間差異顯著(P<0.05)。下同

2.2.2 小鼠血清溶血素試驗(yàn)

血清溶血素是反映動物機(jī)體免疫功能的一個重要指標(biāo)，當(dāng)溶血素生成含量增多時，小鼠的免疫能力也增強(qiáng)。由圖1可知，低、中、高劑量組與對照組比較，小鼠血清溶血素的含量存在顯著差異(P<0.05)，中、高劑量組與對照組相比存在極顯著性差異(P<0.01)，說明此中藥復(fù)方對血清溶血素的活性有一定的提高。

2.2.3 淋巴細(xì)胞增殖能力試驗(yàn)

由圖2可知，隨著中藥復(fù)方劑量的增加，小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力呈升高趨勢，但低、中、高劑量組之間及低、中與對照組之間，均無顯著性差異。說明高劑量濃度組對小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力有促進(jìn)效果。

圖1 中藥復(fù)方對小鼠血清溶血素生成的影響

圖2 中藥復(fù)方對小鼠淋巴細(xì)胞增殖能力的影響

注：圖中數(shù)字為平均值，不同大寫字母表示差異極顯著(P<0.01)，不同小寫字母表示差異顯著(P<0.05)

2.2.4 單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力試驗(yàn)結(jié)果

單核-巨噬細(xì)胞是機(jī)體最重要的防御系統(tǒng)，能清除宿主體內(nèi)的外源異物，是機(jī)體非特異免疫的重要組成部分。由圖3可知，低、中、高劑量組與對照組比較，吞噬指數(shù)存在極顯著差異(P<0.01)，其中給予低劑量的吞噬能力提高最明顯，隨著給藥量的增加，小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力有所下降，且低劑量與高劑量相比差異達(dá)到顯著水平(P<0.05)。表明低、中、高劑量組中藥復(fù)方都能有效提高小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力，且低劑量提高小鼠單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力最強(qiáng)。

2.2.5 NK細(xì)胞殺傷活性試驗(yàn)結(jié)果

NK細(xì)胞是機(jī)體內(nèi)一種重要的非特異性免疫細(xì)胞，在免疫監(jiān)視、抵抗多種微生物感染、抗腫瘤細(xì)胞等過程中起積極作用。本中藥復(fù)方對小鼠NK細(xì)胞殺傷活性的影響見圖4?？芍?，不同劑量組的中藥復(fù)方與對照組相比，低劑量和中劑量給藥時，小鼠NK細(xì)胞殺傷活性都能得到極顯著提高，且中劑量提高最明顯，而高劑量和對照組相比，NK細(xì)胞殺傷活性沒有顯著提高。

圖3 小鼠單核-巨噬細(xì)胞的吞噬能力

3 討論

應(yīng)激反應(yīng)是機(jī)體受到各種有害刺激后產(chǎn)生的一種非特異性緊張反應(yīng)，長期在應(yīng)激狀態(tài)下生活可導(dǎo)致機(jī)體免疫力下降，從而產(chǎn)生各種疾病。本試驗(yàn)結(jié)果表明，以黃芪、山藥、玉竹、黃精等補(bǔ)益類中藥組成的中藥復(fù)方能顯著延長小鼠的游泳時間(具有明顯的抗疲勞作用)，提高小鼠的耐高溫能力，說明本中藥復(fù)方可提高小鼠的抗應(yīng)激反應(yīng)能力。

免疫力是動物機(jī)體保護(hù)自己、抵御外敵的能力，免疫力的強(qiáng)弱能夠衡量機(jī)體對病原微生物的抵抗能力[12]。根據(jù)“保健食品功能學(xué)評價程序和檢驗(yàn)方法”中增強(qiáng)免疫力試驗(yàn)結(jié)果判定規(guī)則，在細(xì)胞免疫功能、體液免疫功能、單核-巨噬細(xì)胞功能、NK細(xì)胞功能檢測中，如有兩個(含兩個)以上功能檢測結(jié)果為陽性，即可判定該受試物具有免疫調(diào)節(jié)作用[13]。

本試驗(yàn)中，小鼠血清溶血素、淋巴細(xì)胞的增殖能力、單核-巨噬細(xì)胞吞噬能力和NK細(xì)胞殺傷活性的測定結(jié)果顯示，三個劑量組與對照組相比都表現(xiàn)出一定程度的優(yōu)勢。因此，由黃芪、山藥、黃精、枸杞子、女貞子、玉竹組成的中藥復(fù)方能有效提高小鼠的免疫能力。