何金環(huán)，唐艷彥，張世凱，李 祥，趙 青

(河南牧業(yè)經(jīng)濟(jì)學(xué)院 食品與生物工程學(xué)院，河南 鄭州 450046)

葡萄是世界上種植頗為廣泛的水果之一[1]，產(chǎn)量高、口感好、營養(yǎng)價值高。每年約有25%的葡萄用于鮮食及其它葡萄制品的加工，約75%的葡萄用于釀酒，釀造過程中產(chǎn)生的葡萄梗皮、葡萄籽及發(fā)酵罐中的酒泥沉淀等釀酒葡萄皮渣約占使用鮮葡萄總量的20%-30%[2]。 我國年產(chǎn)葡萄140萬t，且逐年增加[3]，每年因釀制葡萄酒而產(chǎn)生的葡萄皮渣廢棄物達(dá)數(shù)萬噸，除少部分回收提取功能性物質(zhì)外，大都以飼料飼喂畜禽、填埋作為肥料處理或被當(dāng)作垃圾隨處堆放，利用率低，同時也給生態(tài)環(huán)境造成污染[4]。綜合利用釀酒葡萄皮渣已成為葡萄釀造行業(yè)的研究熱點。

葡萄果皮和籽粒中含有大量植物多酚，其中果皮中以花色素、白藜蘆醇及黃酮類為主，籽粒中以兒茶素、槲皮苷、原花青素和單寧為主[5]。在釀造過程中花青素與發(fā)酵時的糖形成花色苷，花色苷為一種類黃酮的衍生物，這些物質(zhì)安全、無毒且含有一定的營養(yǎng)成分，通常作為食品著色劑等[6]，并具有增強人體免疫機(jī)能、抗氧化、降低血脂等藥用與保健價值[7-8]。

常用提取色素的方法有溶劑法[9]、超聲波法[10]、酶解法[11]以及微波法[12]。其中溶劑法操作簡單，影響因素可控，成本低?；ㄉ斩糠治鲋饕斜壬?、pH示差法，色譜法等。常用比色法定量分析花色苷[13]，但需要嚴(yán)格操作和昂貴設(shè)備。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

釀酒葡萄(Cabernet Sauvignon，赤霞珠)皮渣，將釀酒葡萄皮渣在80 ℃條件下烘干10-12 h，粉碎，過60目篩，密封4 ℃保存。

1.2 試驗設(shè)計

1.2.1 色素的提取

稱取5份葡萄皮渣，每份5.00 g分別置入燒杯中，加入不同濃度的乙醇、1%檸檬酸緩沖溶液(固液比1：8)，恒溫水浴一定時間，冷卻后3500 r/min離心10 min，加入1mL無水乙醇，3500 r/min離心10 min，得到葡萄皮渣色素提取溶液。吸取1 mL提取的色素溶液，用磷酸氫二鈉-檸檬酸緩沖液稀釋10倍，波長520 nm處測其吸光值[16]。

1.2.2 單因素試驗

分別以乙醇濃度、浸提時間、浸提溫度、pH為單因素，并分析各因素對色素提取率的影響。

1.2.3 響應(yīng)面法優(yōu)化提取條件

在單因素試驗基礎(chǔ)上，采用響應(yīng)面數(shù)據(jù)分析法對提取條件進(jìn)行優(yōu)化。根據(jù)Box-Behnken中心試驗設(shè)計，采取3因素3水平的響應(yīng)面分析，最終確定乙醇提取色素的最佳條件。表1為試驗因素水平編碼[17]。

表1 試驗因素水平編碼

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素實驗結(jié)果分析

2.1.1 乙醇濃度對色素提取率的影響

如表1所示，大多數(shù)小型焚燒爐采用了氣化焚燒技術(shù)，但很難做到飛灰熔融，飛灰應(yīng)該按照危險廢物相關(guān)法規(guī)處置［5］。但是農(nóng)村地區(qū)通常無飛灰的處置設(shè)施，因此即使煙氣能達(dá)標(biāo)，這些在農(nóng)村地區(qū)運行的焚燒爐仍存在飛灰污染的環(huán)境風(fēng)險。但是采用的熱解后焦炭揮發(fā)分耦合焚燒技術(shù)（以下簡稱熱解耦合焚燒），通過飛灰返燒-熔融模式，存在飛灰玻璃化可能。

圖1表明，乙醇濃度與色素提取率呈正相關(guān)，隨著乙醇濃度的升高，色素提取溶液的吸光值也逐漸增加，當(dāng)乙醇濃度達(dá)到80%時吸光值最高，乙醇濃度超過80%，提取溶液的吸光度值逐步下降。低濃度的乙醇對原料中色素提取不充分，高濃度的乙醇使得提取液中脂溶性物質(zhì)的溶出較多，導(dǎo)致色素提取液沸點降低，不利于花色苷的析出[17]。

圖1 乙醇濃度對吸光度的影響

2.1.2 提取溫度對色素提取率的影響

圖2表明，隨著提取溫度的升高，色素溶液的吸光值也逐漸增加，當(dāng)溫度達(dá)到60 ℃時吸光度達(dá)到最高，超過60 ℃有降低趨勢，達(dá)到90 ℃時吸光值升高，這是由于升溫的過程利于色素的溶解，高溫條件下色素提取不穩(wěn)定，容易造成花色苷的分解，產(chǎn)生副產(chǎn)物影響吸光值[6]。

圖2 溫度對吸光度的影響

2.1.3 提取時間對色素提取率的影響

圖3表明，提取時間對色素吸光值有較大影響。提取時間60 min時，色素溶液的吸光度出現(xiàn)第一個峰值，超過60 ℃有降低趨勢，達(dá)到70 min時產(chǎn)生第二個峰值，這是由于色素隨著時間的延長以及溫度的升高結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，降解產(chǎn)生副產(chǎn)物，從而影響光吸收。

圖3 浸提時間對吸光度影響

2.1.4 pH對色素提取率的影響

圖4表明，pH值對色素溶液吸光度值的影響呈現(xiàn)先升后降趨勢，在pH 3.0和pH 4.0時有相近的吸光值，pH 3.5 時，提取色素溶液吸光度值最低。pH對色素的影響主要是使其結(jié)構(gòu)發(fā)生改變，從而改變顏色。當(dāng)pH值為1～3時花色為紅色；pH值為3～5時產(chǎn)生無色的甲醇甲堿；pH 6～7時為藍(lán)紫色[18]，色素在中性和弱堿性中不穩(wěn)定，不能保持色素的天然狀態(tài)[19]。

圖4 pH對吸光度的影響

2.2 響應(yīng)面優(yōu)化提取工藝

2.2.1 回歸方程的建立與分析

根據(jù)上述單因素實驗結(jié)果，選取提取時間、乙醇濃度、提取溫度三因素水平，根據(jù)Design-Expert 8.0.6.1軟件中的Box-Benhnken實驗設(shè)計，以確定提取因素和色素提取率的回歸關(guān)系，實驗設(shè)計及結(jié)果(見表2)。

表2 響應(yīng)面實驗方案及結(jié)果

表3 回歸模型的方差分析

注：“*”為差異顯著(0.01

對表3數(shù)據(jù)進(jìn)行二次多項式回歸擬合，回歸方程如下：吸光值=+0.69+0.027*A+0.076*B-0.024*C+0.011*A*B+0.056*A*B+0.021*B*C-0.040*A2+0.021*B2-0.080*C2。根據(jù)響應(yīng)面回歸參數(shù)方差分析可知(表3)，一次項B>A>C，即乙醇濃度>提取時間>提取溫度。各因素與吸光度線性相關(guān)顯著，整體模型達(dá)到極顯著水平(P<0.01)。模型的R2=0.9351，AdjR2=0.8517，說明模型擬合度良好，實驗誤差小，該數(shù)據(jù)模型可以用于預(yù)測和分析釀酒皮渣中色素的提取。

2.2.2 響應(yīng)面分析對色素提取條件的優(yōu)化

通過模型作各因素響應(yīng)面圖及其等高線，結(jié)果見圖5。圖2曲面陡峭，說明乙醇濃度與提取時間之間交互作用較為明顯，與結(jié)果吻合。圖6直觀地反映了乙醇濃度與提取時間之間的交互作用對響應(yīng)值的影響。吸光值隨乙醇濃度的增加呈現(xiàn)先升后降趨勢；當(dāng)乙醇濃度較低時，吸光值隨著提取時間的增加呈現(xiàn)先升后降的趨勢，乙醇濃度較高時，色素吸光值隨著提取時間增加而快速上升，達(dá)到某一定值時趨于平緩。從響應(yīng)面中可以看出乙醇濃度上升的幅度比提取時間陡峭，說明乙醇濃度對色素吸光值的影響比提取時間影響大。

由Design-Expert 8.0.5軟件對實驗數(shù)據(jù)進(jìn)行優(yōu)化，得出最優(yōu)提取條件：乙醇濃度70%、提取時間60 min、提取溫度50 ℃。

圖5 各因素間的響應(yīng)曲面圖及其等高線

2.2.3 試驗驗證響應(yīng)面法優(yōu)化的提取色素條件

根據(jù)響應(yīng)面法優(yōu)化的色素提取最適工藝條件，稱取3份釀酒葡萄皮渣粉末5 g，乙醇濃度70%、提取時間60 min、提取溫度50 ℃、pH 3.0條件下提取色素。結(jié)果見表4，三次平行試驗的平均吸光值為0.686。與Design-Exper 8.0.5軟件預(yù)測值(0.69)基本一致。這說明響應(yīng)面優(yōu)化的釀酒葡萄皮渣色素的提取條件是可行的。

表4 實驗結(jié)果驗證

3 結(jié)論

本試驗從釀酒葡萄皮渣再利用的角度出發(fā)，對葡萄皮渣中的色素提取條件進(jìn)行研究。響應(yīng)面分析顯示釀酒葡萄皮渣中的色素在乙醇濃度70%、提取時間60 min、提取溫度50 ℃、pH 3.0條件下提取效率最高，此條件下色素的吸光值0.686，與模型預(yù)測值(0.69)基本一致，色素得率達(dá)到6.22 mg/g。周雯雯[9]采用溶劑法正交試驗得出提取溶劑乙醇80%、提取時間2 h、提取溫度80 ℃、料液比17:1；黃瑜[20]等采用雙水相法最佳工藝參數(shù):乙醇28%，硫酸銨質(zhì)量分?jǐn)?shù)18.14%，pH 3.0、料液比為35:1，花色苷得率4.43 mg/g。本試驗優(yōu)化的釀酒葡萄皮渣色素的提取條件提取效率較高，可能是因為經(jīng)微生物轉(zhuǎn)化后的葡萄皮渣中的色素更易于析出。

葡萄營養(yǎng)價值較高，經(jīng)發(fā)酵后的釀酒葡萄皮渣中不僅含有大量的粗蛋白、粗脂肪和粗纖維等[21]，也含有豐富的可供開發(fā)的多酚類活性成分，高效分離提取可利用的活性物質(zhì)，形成完整高效的利用系統(tǒng)，通過精加工、深加工提高葡萄皮渣的經(jīng)濟(jì)附加值，變廢為寶，具有重要意義。