黃家佳， 龍曉燕， 王 瑞， 李光英

（西南科技大學(xué)，四川 綿陽(yáng)621000）

白芷為傘形科植物白芷Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.或 杭 白 芷 Angelica dahurica（Fisch.ex Hoffm.） Benth.et Hook.f.var.formosana（Boiss）Shan et Yuan 的干燥根，主要用于治療感冒頭痛、眉棱骨痛、鼻塞、鼻淵、牙痛、白帶異常、瘡瘍腫痛［1］，其主要成分為香豆素、揮發(fā)油，其中有效鎮(zhèn)痛物質(zhì)是前者，并且有一些具有抗氧化、抗增殖活性［2-3］，如歐前胡素、異歐前胡素等。本實(shí)驗(yàn)建立HPLC 法測(cè)定歐前胡素含有量［4］，并在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上通過(guò)正交試驗(yàn)優(yōu)化白芷中香豆素類成分滲漉提取工藝［5-6］，以期為相關(guān)研究提供理論依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器 EC2000 高效液相色譜儀（配置UV230＋紫外-可見(jiàn)檢測(cè)器、手動(dòng)進(jìn)樣器，大連依利特分析儀器有限公司）；RE-52AA 旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀（上海亞榮生化儀器廠）；SHB-Ⅲ循環(huán)水式多用真空泵（鄭州長(zhǎng)城科工貿(mào)有限公司）；DLSB-5120 低溫冷卻液循環(huán)泵（上海賢德實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；KQ-300TDE 高頻數(shù)控超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；HX-200 高速中藥粉碎機(jī)（浙江省永康市溪岸五金藥具廠）；AR124CN 電子天平［奧豪斯儀器（上海） 有限公司］。

1.2 試藥 白芷（批號(hào)G07816F01） 購(gòu)自四川中庸藥業(yè)有限公司，經(jīng)專家鑒定為正品。 歐前胡素對(duì)照品 （批號(hào)T9MZ-FFSK，上海源葉生物科技有限公司）。甲醇為色譜純；乙醇為分析純；水為娃哈哈純凈水。

2 方法與結(jié)果

2.1 粉碎度考察 取藥材適量，粉碎，稱取粉碎度10、20、30、40 目的各20 g，40 mL 80%乙醇濕潤(rùn)浸泡，裝筒，加入8 倍量80%乙醇，滲漉速度3 mL／ （min·kg），浸泡時(shí)間12 h，滲漉液置于50 ℃水浴中濃縮定容至50 mL 量瓶中，再吸取2.0 mL 定容至10 mL 量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，粉碎度20 目時(shí)歐前胡素含有量最高，故選擇其進(jìn)行后續(xù)實(shí)驗(yàn)。

2.2 對(duì)照品溶液制備 精密稱取歐前胡素對(duì)照品10.00 mg，置于50 mL 量瓶中，甲醇溶解定容至刻度，搖勻，精密吸取3.0、4.0、5.0、6.0、7.0 mL 于10 mL 量瓶中，甲醇稀釋至刻度，搖勻，0.45 μm 微孔濾膜過(guò)濾，即得（每1 mL 分別含0.06、0.08、0.10、0.12、0.14 mg 歐前胡素）。

2.3 供試品溶液制備 將藥材粉碎成粗粉，過(guò)20 目篩，稱取20 g，40 mL 乙醇濕潤(rùn)浸泡，裝筒，續(xù)加乙醇，靜置，滲漉，滲漉液置于50 ℃水浴中，濃縮定容至50 mL 量瓶中，再吸取2.0 mL 定容至10 mL 量瓶中，搖勻，0.45 μm微孔濾膜過(guò)濾，即得。

2.4 色譜條件 Kromasil C18色譜柱（4.6 mm×150 mm，5 μm）；流動(dòng)相甲醇∶水（65 ∶35）；檢測(cè)波長(zhǎng)300 nm；柱溫室溫；體積流量1.0 mL／min；進(jìn)樣量20 μL。色譜圖見(jiàn)圖1，理論塔板數(shù)不低于3 000。

2.5 線性關(guān)系考察 吸取“2.2” 項(xiàng)下對(duì)照品溶液，以溶液質(zhì)量濃度為橫坐標(biāo)（X），峰面積為縱坐標(biāo)（Y） 進(jìn)行回歸，得方程為Y ＝21 596.95X ＋438.653（R2＝0.999 67），在0.06～0.14 mg／mL 范圍內(nèi)線性關(guān)系良好。

圖1 歐前胡素HPLC 色譜圖

2.7 單因素試驗(yàn)［7］

2.7.1 乙醇體積分?jǐn)?shù) 固定料液比1 ∶8，浸泡時(shí)間12 h，滲漉速度4 mL／ （min·kg），乙醇用量40 mL，考察50%、60%、70%、80%、90%乙醇對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖2。由圖可知，60%乙醇提取時(shí)歐前胡素含有量明顯高于50%乙醇，故選擇50%、60%、70%這3 個(gè)水平進(jìn)行考察。

圖2 乙醇體積分?jǐn)?shù)對(duì)歐前胡素含有量的影響

2.7.2 料液比 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%， 滲漉速度4 mL／（min·kg），乙醇用量40 mL，浸泡時(shí)間12 h，考察料液比1 ∶6、1 ∶7、1 ∶8、1 ∶9、1 ∶10 對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖3。由圖可知，料液比1 ∶9 時(shí)歐前胡素含有量明顯高于1 ∶8，故選擇1 ∶8、1 ∶9、1 ∶10 這3 個(gè)水平進(jìn)行考察。

圖3 料液比對(duì)歐前胡素含有量的影響

2.7.3 滲漉速度 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1 ∶9，乙醇用量40 mL，浸泡時(shí)間12 h，考察滲漉速度3、4、5、6、7 mL／（min·kg）對(duì)提取效果的影響，結(jié)果見(jiàn)圖4。由圖可知，滲漉速度在5 mL／（min·kg）時(shí)歐前胡素含有量明顯高于4 mL／（min·kg），故選擇3、4、5 mL／（min·kg）這3個(gè)水平進(jìn)行考察。

圖4 滲漉速度對(duì)歐前胡素含有量的影響

2.7.4 浸泡時(shí)間 固定乙醇體積分?jǐn)?shù)70%，料液比1 ∶9，乙醇用量40 mL，滲漉速度5 mL／（min·kg），考察浸泡時(shí)間6、12、18、24、30 h 對(duì)提取效果的影響。結(jié)果見(jiàn)圖5。由圖可知，浸泡時(shí)間18 h 時(shí)歐前胡素含有量明顯高于12 h時(shí)，故選擇12、18、24 h 這3 個(gè)水平進(jìn)行考察。

圖5 浸泡時(shí)間對(duì)歐前胡素含有量的影響

2.8 正交試驗(yàn) 在單因素試驗(yàn)基礎(chǔ)上，以乙醇體積分?jǐn)?shù)（A）、乙醇用量（B）、滲漉速度（C）、浸泡時(shí)間（D） 為影響因素，進(jìn)行4 因素3 水平L9（34） 正交試驗(yàn)［8］。因素水平見(jiàn)表1，結(jié)果見(jiàn)表2，方差分析見(jiàn)表3。

表1 因素水平

表2 試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

表3 方差分析

由表1 可知，各因素影響程度依次為B＞D＞A＞C；由表2 可知，因素B、D 有顯著性影響（P＜0.05），以前者更明顯。綜合考慮，最優(yōu)工藝為A2B1C2D1，即8 倍量60%乙醇浸泡12 h，滲漉速度4 mL／（min·kg），歐前胡素含有量為1.489 5 mg／g。

2.9 驗(yàn)證試驗(yàn) 按“2.7” 項(xiàng)下優(yōu)化工藝進(jìn)行3 批驗(yàn)證試驗(yàn)，測(cè)得歐前胡素平均轉(zhuǎn)移率為95.12%，RSD 為1.34%，表明工藝穩(wěn)定可行。

3 討論

白芷中香豆素類成分歐前胡素和異歐前胡素受熱不穩(wěn)定，前者易發(fā)生Claisen 烯丙基重排，生成別歐前胡素，即使在真空中加熱也會(huì)如此［9］。前期曾采用水蒸氣蒸餾法提取白芷，但得率低，耗時(shí)長(zhǎng)，浪費(fèi)能源，同時(shí)易破壞其他有效成分［10］，故本實(shí)驗(yàn)采用乙醇滲漉法提取，能較好地保留有效成分。

由于粉碎度過(guò)細(xì)時(shí)，提取率反而會(huì)下降［11］，故白芷在提取過(guò)程中不宜粉碎過(guò)細(xì)，避免提取過(guò)程中發(fā)生堵塞滲漉筒現(xiàn)象，影響提取效果。同時(shí)，采用粗粉進(jìn)行提取，即方便操作，也符合滲漉法提取特點(diǎn)和要求。

在含有量測(cè)定時(shí)，曾采用精密量取提取液，低溫蒸干后甲醇溶解殘?jiān)姆椒▉?lái)制備供試品溶液，但在甲醇溶解、轉(zhuǎn)移過(guò)程中會(huì)造成有效成分的損失。因此，采用提取液稀釋后進(jìn)行測(cè)定，該方法操作簡(jiǎn)便，結(jié)果可靠。