王承平 - 秦 宇 侯蓓蓓 -雷 濤 虞成華 - 葛 宇

(1. 上海市質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)技術(shù)研究院，上海 200233；2. 國家食品質(zhì)量監(jiān)督檢驗(yàn)中心，上海 200233)

牛奶是人們?nèi)粘Ｉ钪行杞?jīng)常消費(fèi)的食品。近年來，抗生素殘留問題日益突出，而牛奶中抗生素殘留主要來源于獸醫(yī)臨診及畜牧生產(chǎn)中的大量使用[1]。其中一部分違禁抗生素被違禁應(yīng)用于動(dòng)物飼料添加劑中[2]，或是使用抗生素來預(yù)防動(dòng)物疾病且促進(jìn)動(dòng)物快速增長[3]，或是在休藥期違法使用抗生素而造成抗生素殘留[4]。

牛奶中的抗生素殘留可能產(chǎn)生以下危害[5]：① 對(duì)人體的危害，包括導(dǎo)致人體免疫力下降、降低藥物對(duì)人體的治療作用、使人體慢性中毒、導(dǎo)致基因突變等；② 對(duì)生態(tài)環(huán)境的危害，包括造成環(huán)境污染、破壞微生物種群平衡、增加耐藥菌種等。因此，建立牛奶中的抗生素多殘留檢測(cè)方法已成為保障食品安全的迫切需求。而多殘留檢測(cè)方法的關(guān)鍵是前處理中的提取和凈化。目前報(bào)道的牛乳中抗生素殘留的凈化方法有直接法[6]、QuEChERS法[7]、固相萃取法[8]及免疫固相萃取法[9]等。

試驗(yàn)擬建立一套超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜法測(cè)定生鮮牛奶中72種抗生素殘留的方法，并對(duì)200批次生鮮牛奶進(jìn)行檢測(cè)，為生鮮牛奶中抗生素殘留的檢測(cè)提供新的快速檢測(cè)方法。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

生鮮牛奶：抽檢樣品；

甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷：色譜純，美國Thermo公司；

甲酸：色譜純，美國ACS色譜試劑公司；

乙二胺四乙酸二鈉：純度≥99.0%，國藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

Oasis?PRiME HLB：3 mL/60 mg，美國Waters公司；

24種喹諾酮類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/L)、10種青霉素類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/L)、20種磺胺類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/L)、12種頭孢類抗生素混合標(biāo)準(zhǔn)溶液(100 mg/L)、氨芐西林、苯唑西林標(biāo)準(zhǔn)品：純度均≥98%，美國A ChemTek Inc公司；

9種四環(huán)素標(biāo)準(zhǔn)品：純度≥98%，德國Dr Ehrenstorfer公司。

1.2 儀器與設(shè)備

三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀：TQ-XS型，帶電噴霧離子源(ESI)，美國Waters公司；

液相色譜系統(tǒng)：AcquityH?UPLC CLASS型，美國Waters公司；

電子天平：MSZO 204S型，瑞士MettlerToleo公司；

高速離心機(jī)：Centrifuge 5804型，德國Eppendorf公司；

多管渦旋振蕩器：D-91126型，德國Heidolph公司；

快速溶劑蒸發(fā)儀：EZ-2.3 Elite型，英國Genevac公司；

超純水系統(tǒng)：Milli-Q型，美國Millipore公司。

1.3 樣品前處理

1.3.1 提取 稱取5.00 g試樣于50 mL塑料離心管中，渦旋2 min，加入10 μL甲酸及20.0 mL乙腈[考察溶劑包括甲醇、乙腈、乙酸乙酯、二氯甲烷、EDTA-2Na—乙腈溶液、1.5%(體積分?jǐn)?shù))甲酸—乙腈溶液和5%(體積分?jǐn)?shù))甲酸—乙腈溶液]，渦旋3 min，超聲15 min，加2 g氯化鈉，渦旋2 min，9 000 r/min離心3 min，收集上清液，殘?jiān)俅渭尤?0.0 mL乙腈重復(fù)上述操作，合并兩次上清液于另一離心管中，混合均勻，40 ℃下氮?dú)獯蹈纱齼艋?/p>

1.3.2 凈化 取氮?dú)獯蹈傻碾x心管，加入定容液(乙腈∶水=1∶3，體積比)5.0 mL，超聲2 min，加入乙腈飽和的正己烷10.0 mL，渦旋混合2 min，9 000 r/min離心1 min，收集下層清液，使其全部通過Oasis PRiME HLB柱(使用前無需活化平衡處理)并收集于另一離心管中，流速2～3 mL/min，再次渦旋混合后，取適量混合液過0.22 μm PTFE濾膜，供液相色譜串聯(lián)—質(zhì)譜/質(zhì)譜儀測(cè)試。

1.3.3 基質(zhì)加標(biāo)標(biāo)準(zhǔn)工作曲線的制備 將混合標(biāo)準(zhǔn)工作液，用定容液逐級(jí)稀釋成5.0～100.0 μg/L標(biāo)準(zhǔn)系列溶液。稱取與試樣基質(zhì)相應(yīng)的陰性樣品5.00 g，加入標(biāo)準(zhǔn)系列溶液1.0 mL，其余操作同1.3.1、1.3.2。

1.3.4 加標(biāo)回收試驗(yàn) 取空白鮮奶樣品，添加混合標(biāo)準(zhǔn)溶液，進(jìn)行總數(shù)為96批次(4基質(zhì)×6平行×4批次，為期1月)的加標(biāo)回收率試驗(yàn)。

1.4 LC-MS/MS條件

1.4.1 液相色譜條件 色譜柱Atlantis?T3柱(2.1 mm×50 mm，1.7 μm)，柱溫30 ℃，進(jìn)樣體積2 μL，流動(dòng)相A為0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸—水溶液，流動(dòng)相B為乙腈，流速0.5 mL/min。梯度洗脫程序：0～2 min，5% B；2～7 min，5%～95% B；7～8 min，95% B；8～8.1 min，95%～5% B；8.1～10 min，5% B。

1.4.2 質(zhì)譜條件 多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)，電噴霧正離子模式(ESI+)；毛細(xì)管電壓3.00 kV；脫溶劑氣溫度500 ℃；脫溶劑氣流速1 000 L/h；反吹氣流速150 L/h；碰撞氣流速0.15 mL/min。

1.4.3 質(zhì)譜參數(shù)的優(yōu)化 將5類混合標(biāo)準(zhǔn)溶液分別注入質(zhì)譜儀中，對(duì)去簇電壓(Cone)、碰撞能量(CE)進(jìn)行優(yōu)化，選取相對(duì)豐度較高的兩對(duì)多反應(yīng)監(jiān)測(cè)(MRM)離子對(duì)作為定量離子和定性離子。

1.5 數(shù)據(jù)處理

使用MassLynx?軟件對(duì)每個(gè)化合物的定量離子進(jìn)行數(shù)據(jù)處理以得到樣品溶液濃度數(shù)據(jù)，并使用定性離子進(jìn)行輔助定性。然后計(jì)算樣品含量、精密度、回收率數(shù)據(jù)。

2 結(jié)果與分析

2.1 色譜、質(zhì)譜條件優(yōu)化

2.1.1 色譜柱的選擇 通過比較分析，選擇可在寬pH條件下使用且對(duì)極性化合物有較好分離效果的Waters Atlantis T3色譜柱，并選擇柱長50 mm、粒徑1.7 μm的UPLC型號(hào)，分離檢測(cè)72種抗生素殘留單次運(yùn)行時(shí)間為10 min。

2.1.2 流動(dòng)相的選擇及洗脫梯度的優(yōu)化 通過比較水—甲醇、水—乙腈、0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸—甲醇、0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸—乙腈4種流動(dòng)相組合的分離效果，發(fā)現(xiàn)乙腈相對(duì)于甲醇的峰形更好，色譜柱反壓更低，保留時(shí)間更穩(wěn)定；而在ESI+模式下，0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸相對(duì)于水能提供更多地離子化所需的H+，從而明顯增強(qiáng)化合物的響應(yīng)，提高檢測(cè)靈敏度。因此，最終選擇0.1%(體積分?jǐn)?shù))甲酸—乙腈作為流動(dòng)相，并優(yōu)化了洗脫梯度，所有化合物均得到了較好地分離并具有良好的峰形。5類抗生素代表化合物的MRM色譜圖見圖1。

圖1 5類抗生素代表化合物MRM色譜圖

2.2 提取溶劑的優(yōu)化

牛乳中含有蛋白質(zhì)、脂肪、乳糖等較多分析干擾物，試驗(yàn)重點(diǎn)考察了沉淀蛋白的方式對(duì)多種抗生素提取效果的影響。由圖2可知，當(dāng)使用1.5%(體積分?jǐn)?shù))甲酸—乙腈溶液為提取溶劑時(shí)，多數(shù)化合物能實(shí)現(xiàn)有效提取，回收率較好，達(dá)74.3%；但隨甲酸濃度的增加，化合物提取效率呈下降趨勢(shì)，可能是甲酸濃度改變了部分化合物的帶電狀態(tài)，降低了其在乙腈中的溶解效率。因此，選擇1.5%(體積分?jǐn)?shù))甲酸—乙腈為提取溶劑。

2.3 凈化方法的優(yōu)化

試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，當(dāng)使用10 mL1.5%(體積分?jǐn)?shù))甲酸—乙腈溶液進(jìn)行蛋白沉淀后，提取液呈澄清狀，由于免疫固相萃取柱具有一定的專一性，比較了直接法進(jìn)樣、市售QuEChERS凈化包及兩種固相萃取柱(HLB和Oasis?PRiME HLB)的凈化效果。結(jié)果表明，QuEChERS凈化包不適用于生鮮牛奶的化合物凈化，主要為部分化合物無回收。相比直接進(jìn)樣法，固相萃取方式適用于生鮮牛奶中的抗生素殘留分析，對(duì)減少基質(zhì)效應(yīng)有較為明顯的影響，綜合試驗(yàn)成本及效率，選擇無需活化處理的Oasis?PRiME HLB柱進(jìn)行凈化處理試驗(yàn)。

1. 二氯甲烷 2. 甲醇 3. 乙酸乙酯 4. 乙腈 5. 1.5%(體積分?jǐn)?shù))甲酸—乙腈溶液 6. 5%(體積分?jǐn)?shù))甲酸—乙腈溶液 7. EDTA-2Na—乙腈溶液

圖2 7種提取溶劑下72種抗生素在牛奶基質(zhì)中的平均回收率

Figure 2 Average recovery of 72 antibiotics in milk matrix in 7 extraction solvents

2.4 方法學(xué)評(píng)價(jià)

2.4.1 線性關(guān)系、檢出限及定量限 試驗(yàn)表明，72種抗生素在1.0～100.0 μg/L濃度范圍內(nèi)均線性良好。線性相關(guān)系數(shù)(R2)在0.960 0～0.999 9。以定量離子信噪比S/N=3計(jì)算化合物的檢出限(LOD)，5種化合物L(fēng)OD為10.0 μg/kg，15種化合物L(fēng)OD為5.0 μg/kg，其余52種化合物L(fēng)OD≤2.5 μg/kg。

2.4.2 精密度與回收率 試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，72種抗生素的加標(biāo)回收率在低、中、高3個(gè)水平下分別為74.0%～118.8%，63.8%～122.6%，43.9%～139.7%；相對(duì)標(biāo)準(zhǔn)偏差分別為1.37%～29.61%，1.79%～30.27%，6.03%～39.70%。

2.5 實(shí)際樣品檢測(cè)

通過試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)，共檢出2批次陽性樣品，分別為氯甲硝咪唑5.76 μg/kg，替米考星6.83 μg/kg。目前，中國關(guān)于氯甲硝咪唑的禁限量標(biāo)準(zhǔn)尚未建立。試驗(yàn)建立的方法可對(duì)市售產(chǎn)品進(jìn)行有效監(jiān)管，在檢測(cè)時(shí)間及簡(jiǎn)單易行上具有優(yōu)勢(shì)，可用于生鮮牛奶中抗生素殘留的快速檢測(cè)。

3 結(jié)論

綜合考慮生鮮牛奶基質(zhì)的特點(diǎn)及5類抗生素的理化性質(zhì)，對(duì)儀器條件和前處理方法進(jìn)行了優(yōu)化，建立了一套可用于快速檢測(cè)生鮮牛奶中72種抗生素的快速前處理—超高效液相色譜—串聯(lián)質(zhì)譜方法，在低、中、高3個(gè)加標(biāo)水平下的回收率為40%～140%，且保留時(shí)間穩(wěn)定，定性準(zhǔn)確。該方法靈敏度高，檢測(cè)時(shí)間較少，方法簡(jiǎn)便，對(duì)生鮮牛奶中抗生素的檢測(cè)具有較高的參考價(jià)值。后續(xù)將增加可檢測(cè)抗生素的類別及種類，盡量覆蓋所有的有可能造成危害的抗生素。