田 艷 段曉嫣 - 鄧放明 -

(湖南農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)技術(shù)學(xué)院，湖南 長(zhǎng)沙 410128)

火龍果(HylocereusundulatusBritt)，仙人掌科植物[1-2]，植物性蛋白與膳食纖維含量豐富[3-4]，經(jīng)常食用可以改善便秘，對(duì)糖尿病患者及高血脂癥患者有輔助治療作用[5-7]。紅心火龍果果皮和果肉色澤艷麗，富含甜菜苷類(lèi)色素，是制備天然色素的優(yōu)良資源[8-11]。

目前，國(guó)內(nèi)外火龍果色素主要采用溶劑提取法，所得火龍果色素產(chǎn)品純度低，耗時(shí)較長(zhǎng)，且存在提取劑殘留、色素產(chǎn)品中含有果膠等問(wèn)題[12-14]。超聲波可與媒質(zhì)產(chǎn)生熱作用、機(jī)械作用和空穴作用，在一定程度上破壞細(xì)胞壁結(jié)構(gòu)，使細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)快速溢出，從而使溶劑更易進(jìn)入細(xì)胞內(nèi)。應(yīng)用超聲波技術(shù)提取天然活性成分能夠有效提高提取率，并利于生物活性的保留[15-18]。酶解法主要利用果膠酶、纖維素酶等軟化或分解植物細(xì)胞壁，促進(jìn)胞內(nèi)成分流出，增加待提取物與提取劑接觸機(jī)會(huì)，有效提高生物活性成分的提取率[19-21]。

試驗(yàn)擬采用酶協(xié)同超聲波輔助溶劑提取紅肉火龍果果皮、果肉色素，應(yīng)用響應(yīng)面法優(yōu)化其提取工藝條件，為火龍果色素的制備及資源的綜合利用提供依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 試驗(yàn)材料

紅肉火龍果：湖南天和盛業(yè)農(nóng)業(yè)開(kāi)發(fā)有限公司；

無(wú)水乙醇、丙酮：分析純，國(guó)藥集團(tuán)化學(xué)試劑有限公司；

檸檬酸、檸檬酸鈉：食品級(jí)，華興生物制劑有限公司；

纖維素酶(2 113 U/mL)、果膠酶(2 096 U/mL)：華興生物制劑有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

分析天平：AUY2200型，日本SHAMADZV公司；

真空冷凍干燥機(jī)：FDU-1200型，日本 EYELA 公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：RV10型，德國(guó)IKA公司；

紫外分光光度計(jì)：WFJ7200型，尤尼柯(上海)儀器有限公司；

離心機(jī)：TDL-5型，上海安亭科學(xué)儀器廠；

超聲波清洗儀：KM-400DE型，昆山美美超聲儀器有限公司；

高速中藥粉碎機(jī)：400Y型，旭曼有限公司；

水浴鍋：YLJYE-100型，艾本德(中國(guó))有限公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 工藝流程

火龍果→清洗、去除表面鱗片、晾干→果皮、果肉分離→果皮切條、果肉打漿→凍干→粉碎過(guò)40目篩→取粉末，加入提取劑提取→3 800 r/min離心15 min→取上清液減壓旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)去除溶劑、濃縮→紅色素粗提液

1.3.2 酶—超聲波法提取色素的單因素試驗(yàn)設(shè)計(jì)

(1) 酶種類(lèi)：準(zhǔn)確稱(chēng)取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g，按料液比1∶200(g/mL)溶解于pH 4.5 20%乙醇中，按照表1加入不同酶種類(lèi)及體積，在超聲溫度40 ℃，超聲功率200 W條件下提取30 min，離心取上清液，濃縮處理后定容至100 mL，于538 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算火龍果紅色素得率。

表1 不同酶種類(lèi)提取紅肉火龍果果皮與果肉色素?

? 果膠酶液為固體酶稀釋250倍，纖維素酶為固體酶稀釋200倍。

(2) 酶添加量：準(zhǔn)確稱(chēng)取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g，按料液比1∶200(g/mL)溶解于pH 4.5 20%乙醇中，分別添加0.20，0.25，0.50，0.75，1.00，1.25 mL 輔助酶，在超聲溫度40 ℃，超聲功率200 W條件下提取30 min，離心取上清液，濃縮處理后定容至100 mL，于538 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算火龍果紅色素得率。

(3) 提取溶劑種類(lèi)：準(zhǔn)確稱(chēng)取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g，按料液比1∶200(g/mL)分別加入 pH 4.5 蒸餾水、30%丙酮、30%甲醇、30%乙醇，添加0.5 mL 纖維素酶，在超聲溫度40 ℃，超聲功率200 W條件下提取30 min，離心取上清液，濃縮處理后定容至100 mL，于538 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算火龍果紅色素得率。

(4) 浸提液 pH：準(zhǔn)確稱(chēng)取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g，按料液比 1∶200(g/mL)溶解于不同 pH的20%乙醇，添加0.5 mL纖維素酶，在超聲溫度40 ℃，超聲功率200 W條件下提取30 min，離心取上清液，濃縮處理后定容至100 mL，于538 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算火龍果紅色素得率。

(5) 浸提液濃度：準(zhǔn)確稱(chēng)取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g，按料液比 1∶200(g/mL)分別溶解于 pH 4.5 的10%，20%，40%，60%，80%乙醇，添加0.5 mL纖維素酶，在超聲溫度40 ℃，超聲功率200 W條件下提取30 min，離心取上清液，濃縮處理后定容至100 mL，于538 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算火龍果紅色素得率。

(6) 料液比：準(zhǔn)確稱(chēng)取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g，分別按照料液比為1∶50，1∶100，1∶150，1∶200，1∶250，1∶300(g/mL)溶解于 pH 4.5的20%乙醇，添加0.5 mL纖維素酶，在超聲溫度40 ℃，超聲功率200 W 條件下提取30 min，離心取上清液，濃縮處理后定容至100 mL，于538 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算火龍果紅色素得率。

(7) 超聲功率：準(zhǔn)確稱(chēng)取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g，按料液比為 1∶200(g/mL)加入 pH 4.5的20%乙醇，添加0.5 mL纖維素酶，分別在超聲功率50，100，200，300，400 W，超聲溫度40 ℃條件下提取30 min，離心取上清液，濃縮處理后定容至100 mL，于538 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算火龍果紅色素得率。

(8) 超聲溫度：準(zhǔn)確稱(chēng)取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g，按料液比為 1∶200(g/mL)加入 pH 4.5的20%乙醇，添加0.5 mL纖維素酶，分別在超聲溫度20，40，60，80 ℃，超聲功率200 W條件下提取30 min，離心取上清液，濃縮處理后定容至100 mL，于538 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算火龍果紅色素得率。

(9) 超聲時(shí)間：準(zhǔn)確稱(chēng)取火龍果果皮(或果肉)凍干樣品0.250 0 g，按料液比為 1∶200(g/mL)加入 pH 4.5的20%乙醇，添加0.5 mL纖維素酶，在超聲溫度40 ℃，超聲功率200 W條件下分別超聲10，20，30，40，50 min，離心取上清液，濃縮處理后定容至100 mL，于538 nm處測(cè)定吸光度，計(jì)算火龍果紅色素得率。

1.3.3 響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)設(shè)計(jì) 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，應(yīng)用Box-Behnken 中心組合的試驗(yàn)設(shè)計(jì)原理，選取火龍果果皮(果肉)色素得率為響應(yīng)值，超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率和乙醇濃度為因素進(jìn)行四因素三水平的響應(yīng)面分析試驗(yàn)。

1.3.4 指標(biāo)測(cè)定

(1) 纖維素酶活力測(cè)定：按NY/T 912—2004執(zhí)行。經(jīng)測(cè)定，試驗(yàn)中所用纖維素酶稀釋液活力為2 113 U/mL。

(2) 果膠酶活力測(cè)定：參照張飛等[22]、王小敏等[23]，采用DNS比色法。經(jīng)測(cè)定，試驗(yàn)中所用果膠酶稀釋液活力為2 096 U/mL。

(3) 火龍果甜菜苷得率：火龍果色素粗提取液定容至100 mL，于538 nm處測(cè)得相應(yīng)吸光度，按式(1)計(jì)算總甜菜苷得率。

(1)

式中：

X——總甜菜苷含量，mg/100 g；

Aλ——總甜菜苷吸光值；

MW——標(biāo)準(zhǔn)甜菜苷摩爾質(zhì)量分?jǐn)?shù)，550.46；

n——稀釋倍數(shù)；

V——提取液體積，mL；

ε——標(biāo)準(zhǔn)甜菜苷摩爾消光系數(shù)，61 600；

L——通路長(zhǎng)度，1.0 cm。

1.4 數(shù)據(jù)處理

采用 Excel 2010 制作圖表，利用 Design Expert 8.0軟件進(jìn)行試驗(yàn)設(shè)計(jì)、分析和建模。

2 結(jié)果與分析

2.1 單因素試驗(yàn)結(jié)果

綜合圖1及色素提取效果與性價(jià)比可知，紅色火龍果果皮色素提取的工藝條件為纖維素酶0.7 mL、20%乙醇濃度、pH 5.0、料液比1∶200(g/mL)、超聲功率300 W、超聲溫度40 ℃、超聲時(shí)間20 min；紅色火龍果果肉色素提取的工藝條件為纖維素酶0.5 mL、20%乙醇濃度、pH 5.0、料液比1∶200(g/mL)、超聲功率300 W、超聲溫度40 ℃、超聲時(shí)間30 min。

2.2 火龍果果皮色素提取工藝優(yōu)化

2.2.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 根據(jù)單因素試驗(yàn)結(jié)果，選取超聲時(shí)間、超聲溫度、超聲功率、乙醇濃度為自變量，以火龍果色素得率為響應(yīng)值，利用Design Expert 8.0 軟件中的Box-Behnken設(shè)計(jì)四因素三水平響應(yīng)面優(yōu)化試驗(yàn)，試驗(yàn)因素水平表見(jiàn)表2，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表3。

2.2.2 回歸方程方差分析 對(duì)表3的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，得到應(yīng)變量對(duì)自變量的關(guān)系為：

圖1 不同因素對(duì)火龍果紅色素得率的影響

表2酶—超聲波輔助乙醇提取火龍果果皮(肉)色素響應(yīng)面試驗(yàn)因素水平表

Table 2 Extraction of pigments from pitaya fruit peel(meat)by enzyme-ultrasound assisted method

水平A超聲時(shí)間/minB超聲溫度/℃C超聲功率/WD乙醇濃度/%-110(20)20(20)200(200)10(10)020(30)40(40)300(300)20(20)130(40)60(60)400(400)30(30)

表3酶—超聲波輔助乙醇提取火龍果果皮色素響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 3 Ultrasonic-assisted enzymatic extraction of pitaya pericarp pigment by response surface methodology design and results

試驗(yàn)號(hào)ABCD色素得率/(10-2 mg·g-1)1-110058.1192-1-10054.7033-101057.3394001-164.2105000078.39061-10065.1887-10-1057.8128000076.4479010165.1101000-1166.089110-10-161.247120-11066.8081301-1064.91914101074.39315-100158.52816000079.13417100176.2311810-1067.12119-100-156.9372000-1-163.69021011067.348220-1-1061.06923001171.607240-10166.80925000078.68826100-165.10927000078.54028010-163.08529110067.070

Y=78.24+5.97A+0.82B+1.75C+2.51D-0.38AB+1.94AC+2.38AD-0.83BC-0.88BD+1.25CD-8.49A2-8.12B2-5.51C2-5.98D2。

(2)

綜上所述，該回歸模型擬合度良好，試驗(yàn)誤差小，能準(zhǔn)確分析和預(yù)測(cè)酶—超聲波同步輔助提取火龍果果皮色素的得率。

表4酶—超聲波輔助乙醇提取火龍果果皮色素影響因素響應(yīng)面回歸模型的方差分析?

Table 4 Variance analysis on regression model of enzyme-ultrasonic method for extraction of pitaya pericarp pigments

方差來(lái)源平方和自由度均方F值P值顯著性模型1 469.7214104.9866.77<0.000 1***A428.091428.09272.26<0.000 1***B8.0518.055.120.040 1*C36.76136.7623.380.000 3***D75.48175.4848.00<0.000 1***AB0.5910.590.370.550 6AC15.00115.009.540.008 0**AD22.71122.7114.440.001 9**BC2.7412.741.740.208 2BD3.1313.131.990.180 4CD6.2516.253.970.066 1A2467.601467.60297.39<0.000 1***B2428.181428.18272.32<0.000 1***C2196.821196.82125.18<0.000 1***D2231.781231.78147.41<0.000 1***殘差項(xiàng)22.01141.57 失擬項(xiàng)17.68101.771.630.336 7不顯著誤差項(xiàng)4.3341.08綜合1 491.7428

2.2.3 響應(yīng)曲面分析 由圖2(a)、(b)可知，A與B對(duì)Y的交互作用不顯著，A與C對(duì)Y存在交互作用。隨著超聲時(shí)間和超聲功率的增加，火龍果果皮色素得率逐漸升高，但當(dāng)超聲時(shí)間和超聲功率增大到一定值后，火龍果果皮色素的得率卻隨超聲時(shí)間的增加和超聲功率的增大而降低。同理，由圖2(c)～(f)可得，A與D所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)曲面圖形坡度陡峭，等高線形狀趨于橢圓形且排列緊密，說(shuō)明超聲時(shí)間和乙醇濃度對(duì)火龍果果皮色素得率的響互影響較大，而A與B、B與C、C與D對(duì)Y的響應(yīng)面圖形坡度相對(duì)平緩，等高線排列較稀疏，表明超聲溫度與超聲時(shí)間、超聲時(shí)間與超聲功率、超聲時(shí)間與乙醇濃度對(duì)火龍果果皮色素得率的交互影響相對(duì)較弱。

2.2.4 提取參數(shù)優(yōu)化及模型驗(yàn)證運(yùn)用 根據(jù)所得模型，預(yù)測(cè)出在穩(wěn)定狀態(tài)下最佳提取工藝參數(shù)為超聲時(shí)間24.28 min、超聲溫度 39.18 ℃、超聲功率326.97 W、乙醇濃度23.23%。在此條件下，火龍果果皮色素得率為80.161 2 mg/100 g。考慮到實(shí)際操作及設(shè)備參數(shù)調(diào)整可行性，調(diào)整最優(yōu)提取工藝參數(shù)為提取時(shí)間24 min、提取溫度39 ℃、超聲功率325 W、乙醇濃度23%。在此條件下采用酶—超聲波同步輔助提取火龍果果皮色素(n=3)，得到火龍果果皮色素得率為(81.661 3±0.762 0) mg/100 g，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果可行。

2.3 火龍果果肉色素提取工藝優(yōu)化

2.3.1 Box-Behnken試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果 試驗(yàn)設(shè)計(jì)與火龍果果皮色素提取的方法一致，試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果見(jiàn)表5。

2.3.2 回歸方程方差分析 對(duì)表5的試驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行多元二次回歸擬合，獲得應(yīng)變量對(duì)自變量的關(guān)系為：

Y=276.79+12.42A+3.31B+2.07C+4.70D-0.65AB+2.00AC+2.12AD-2.08BC-2.19BD+2.68CD-20.04A2-15.58B2-12.23C2-13.44D2。

(3)

圖2 各因素交互作用對(duì)火龍果果皮色素得率的影響

表5酶—超聲波輔助乙醇提取火龍果果肉色素響應(yīng)面分析法試驗(yàn)設(shè)計(jì)及結(jié)果

Table 5 Ultrasonic-assisted enzymatic extraction of pitaya pulp pigment by response surface methodology design and results

試驗(yàn)號(hào)ABCD色素得率/(10-2 mg·g-1)10-110249.81820-1-10240.2613-100-1225.8304-10-10232.0055001-1245.91761-100248.452700-11252.3538-1100236.59490011262.885100101249.234110-10-1240.6511210-10253.91313010-1248.25714-1001232.81115100-1249.427160110253.394171010259.764181100256.059191001264.874200-101250.403210000278.857220000278.639230000278.0832400-1-1246.1122501-10252.171260000278.28527-1010229.84728-1-100226.388290000270.101

表6酶—超聲波輔助乙醇提取火龍果果肉色素影響因素響應(yīng)面回歸模型的方差分析?

Table 6 Variance analysis on regression model of enzyme-ultrasonic method for extraction of pitaya pulp pigments

方差來(lái)源平方和自由度均方F值P值顯著性模型6 569.8314469.2746.72<0.000 1***A1 850.4311 850.43184.24<0.000 1***B131.591131.5913.100.002 8*C51.29151.295.110.040 3***D264.741264.7426.360.000 2***AB1.6911.690.170.687 9AC16.03116.031.600.227 0*AD17.92117.921.780.203 0*BC17.37117.371.730.209 7BD19.25119.251.920.187 9CD28.77128.772.860.112 7A22 605.8912 605.89259.46<0.000 1***B21 574.2811 574.28156.75<0.000 1***C2970.851970.8596.67<0.000 1***D21 172.5111 172.51116.74<0.000 1***殘差項(xiàng)140.611410.04 失擬項(xiàng)84.26108.430.600.767 9不顯著誤差項(xiàng)56.35414.09綜合6 710.4428

2.3.3 響應(yīng)面曲面分析 由圖3(a)、(b)可知，A與B對(duì)Y的交互作用不顯著，A與C對(duì)Y存在交互作用。隨著超聲時(shí)間和超聲功率的增加，火龍果果肉色素得率逐漸升高，但當(dāng)超聲時(shí)間和超聲功率增大到一定值后，火龍果果肉色素的得率卻隨超聲時(shí)間的增加和超聲功率的增大而降低。同理可得，A與D所對(duì)應(yīng)的響應(yīng)曲面圖形坡度陡峭，等高線形狀趨于橢圓形且排列緊密，說(shuō)明超聲時(shí)間和乙醇濃度對(duì)火龍果果肉色素得率的相互影響較大，而A與B、B與C、C與D對(duì)Y的響應(yīng)面圖形坡度相對(duì)平緩，等高線排列較稀疏，表明超聲溫度與超聲時(shí)間、超聲時(shí)間與超聲功率、超聲時(shí)間與乙醇濃度對(duì)火龍果果肉色素得率的交互影響相對(duì)較弱。

2.3.4 提取參數(shù)優(yōu)化及模型驗(yàn)證運(yùn)用 據(jù)所得模型預(yù)測(cè)出在穩(wěn)定狀態(tài)下最佳提取工藝參數(shù)為提取時(shí)間34.27 min、提取溫度40.50 ℃、超聲功率312.72 W、乙醇濃度22.93%，此條件下，火龍果色素得率為279.560 2 mg/100 g?？紤]到實(shí)際操作及設(shè)備參數(shù)調(diào)整可行性，調(diào)整最優(yōu)提取工藝參數(shù)為提取時(shí)間34 min、提取溫度41 ℃、超聲功率315 W、乙醇濃度23%，此條件下采用酶—超聲波同步輔助提取火龍果果肉色素(n=3)，得到火龍果果肉色素得率為(278.660 4±1.084 2) mg/100 g，與預(yù)測(cè)值接近，說(shuō)明優(yōu)化結(jié)果可行。

圖3 各因素交互作用對(duì)火龍果果肉色素得率的影響

3 結(jié)論

以紅色火龍果果皮、果肉凍干樣為原料，采用四因素三水平響應(yīng)面分析法對(duì)纖維素酶—超聲波輔助乙醇提取火龍果果皮、果肉色素進(jìn)行優(yōu)化，得到紅色火龍果果皮色素提取的最優(yōu)工藝為料液比1∶200(g/mL)、pH 5.0、乙醇濃度23%、纖維素酶0.7 mL(2 133 U/mL)、超聲時(shí)間24 min、超聲溫度39 ℃、超聲功率325 W，此條件下火龍果色素得率為(81.661 3±0.762 0) mg/100 g；紅色火龍果果肉色素提取的最優(yōu)工藝條件為料液比1∶200 (g/mL)、pH 5.0、乙醇濃度23%、纖維素酶0.5 mL(2 133 U/mL)、超聲時(shí)間34 min、超聲溫度41 ℃、超聲功率315 W，此條件下火龍果色素得率為(278.660 4±1.084 2) mg/100 g。紅色火龍果果肉色素明顯高于果皮，是工業(yè)化提取色素的優(yōu)質(zhì)原料，但果皮是火龍果食用后的廢棄物，提取色素也是其綜合利用的有效途徑之一。纖維素酶—超聲波輔助乙醇提取火龍果色素具有條件溫和、處理時(shí)間短、提取物食用安全性高和提取率高等特點(diǎn)，優(yōu)于高治平等[24]、王婭玲等[19]采用的超聲波輔助乙醇提取法和陳艷紅等[25]采用的微波提取工藝。但其工業(yè)化應(yīng)用還有待于進(jìn)一步完善。