李 娟 牛澤宇 - 岳湘齊 - 謝 璇 付鑫景 - 陸 俊

(1. 特醫(yī)食品加工湖南省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，湖南 長沙 410004；2. 中南林業(yè)科技大學(xué)食品科學(xué)與工程學(xué)院，湖南 長沙 410004)

中國是世界上最大的柑橘產(chǎn)區(qū)，大多數(shù)柑橘類產(chǎn)品都是新鮮食用或制成果汁，每年都會(huì)產(chǎn)生大量柑橘皮等殘留物。柑橘皮含有酚酸、類黃酮、單寧和VC等抗氧化活性成分，蒲玲玲等[1]發(fā)現(xiàn)贛南臍橙皮中的酚酸成分主要為魏酸、咖啡酸、香豆酸、芥子酸、對羥基苯甲酸、原兒茶酸和香草酸。張磊[2]利用超聲波法提取贛南臍橙皮中黃酮類化合物，得率為 3.01%。未脫脂橙皮中的VC含量平均值達(dá)到了3.46 mg/g[3]。祝愛艷等[4]發(fā)現(xiàn)贛南臍橙幼果中總酚和總黃酮含量分別為11.02～17.14 mg/g和5.01～7.60 mg/g。黃酮類化合物已被證明具有很強(qiáng)的抗氧化活性[5]和抗炎[6]等活性作用?，F(xiàn)已從柑橘中鑒定出來的黃酮類化合物有60余種，常見的有橙皮苷、新橙皮苷、桔紅素、橙皮素、柚皮苷和川陳皮素等二氫黃酮[7]。橙皮苷是對心血管、對腎臟系統(tǒng)都具有顯著的藥理活性[8]，抑制人體肝癌等癌癥細(xì)胞的增殖[9]，柚皮苷、新橙皮苷分別具有降低血糖的功效[10]，川陳皮素和桔紅素是多甲氧基黃酮的重要代表成分，具有豐富的藥理學(xué)活性[11]。中藥陳皮就是由柑橘和柑橘的干燥成熟柑橘皮組成。柑橘皮還可作為香精油[12]、橙皮色素[13]、果膠[14]、橙皮苷[15]的生產(chǎn)原料，殘?jiān)€可用作禽畜飼料[16]。甜橙又是柑橘的主要品種，其年產(chǎn)量約占柑橘產(chǎn)量的2/3，而冰糖橙和臍橙又是甜橙的主要品種，產(chǎn)量豐富，極具開發(fā)利用價(jià)值。

目前有關(guān)甜橙果皮的活性成分及抗氧化活性研究側(cè)重于對不同桔類與橙類皮的研究[17-18]，而對于多種甜橙皮活性及抗氧化比較鮮有報(bào)道。張東峰等[18]對湖南部分臍橙和冰糖橙果皮的多酚黃酮含量進(jìn)行了研究，但未利用HPLC對其具體組分進(jìn)行檢測。試驗(yàn)擬以湖南8種甜橙皮作為研究對象，對其抗氧化主要成分黃酮、多酚、單寧及VC含量和抗氧化能力進(jìn)行檢測，比較不同地區(qū)橙皮抗氧化活性的差異，并分析抗氧化成分與抗氧化活性的相關(guān)性，最后通過主成分分析和系統(tǒng)聚類分析對8種不同甜橙進(jìn)行初步分類，為甜橙皮的加工利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料、試劑與儀器

麻陽冰糖橙、麻陽臍橙：麻陽萬盛生態(tài)農(nóng)業(yè)發(fā)展有限公司；

永興冰糖橙、洪江冰糖橙、石門冰糖橙、石門臍橙、邵陽臍橙、瀏陽臍橙：購于長沙紅星水果市場；

乙腈：色譜純，美國天地有限公司；

福林試劑：分析純，上海源葉生物科技有限公司；

TPTZ(2，4，6-三吡啶基三嗪)：分析純，南京都萊生物技術(shù)有限公司；

水溶性維生素E(Trolox)：分析純，上海華藍(lán)化學(xué)科技有限公司；

1,1-二苯基-2-三硝基苯肼(1,1-diphenyl-2-picrylhydrazyl，DPPH)：分析純，日本東京化成工業(yè)株式會(huì)社；

2′-聯(lián)氨-雙-3-乙基苯并噻唑啉-6-磺酸(2,2′-azino-bis(3-ethylbenzothiazoline-6-sulfonic acid，ABTS)：分析純，合肥博美生物有限公司；

柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素、桔紅素：色譜純(≥98%)，成都曼思都生物科技有限公司；

其他均為分析純。

1.2 儀器與設(shè)備

高效液相色譜儀：LC-20A型，日本島津有限公司；

超聲波細(xì)胞粉碎機(jī)：JY92-Ш型，寧波新芝生物科技股份有限公司；

旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀：R-3型，瑞士Buchi Labortecknic AG公司；

總而言之，國內(nèi)人造金紅石制備過程中總體呈現(xiàn)出以下問題：產(chǎn)品粉化嚴(yán)重；鹽酸再生回收利用困難；設(shè)備腐蝕嚴(yán)重。

紫外可見光光度計(jì)：UV1800型，日本島津公司。

1.3 試驗(yàn)方法

1.3.1 甜橙皮的預(yù)處理與提取 將新鮮甜橙除去橙皮上的灰塵、泥土后，手工剝皮并放在陰涼通風(fēng)處陰干后，再放入鼓風(fēng)烘箱中在40 ℃條件下烘干24 h，用粉碎機(jī)粉碎過60目篩，得到粉末樣品貯存于-20 ℃冰箱。樣品的提取參考黃運(yùn)紅等[19]的方法并略為修改，精確稱取3.00 g橙皮粉末置于燒杯中，按照料液比1∶35 (g/mL)的比例加入105 mL 60%的乙醇，在功率125 W，溫度50 ℃條件下進(jìn)行超聲波輔助提取1 h。將樣液抽濾后并用旋轉(zhuǎn)蒸發(fā)儀在50 ℃溫度下去除乙醇，濃縮液貯藏于-4 ℃冰箱待用。

1.3.2 抗氧化活性成分含量測定

(1) 多酚含量：參考文獻(xiàn)[20]的方法進(jìn)行測定，以每克干樣品中沒食子酸當(dāng)量(mg GAE/g·樣品干重)表示。

(2) 黃酮含量：參照文獻(xiàn)[21]的方法進(jìn)行測定，以每克干樣品中蘆丁當(dāng)量(mg RE/g·樣品干重)表示。

(3) 單寧含量：參照文獻(xiàn)[22]的方法進(jìn)行測定，以每克干樣品中單寧酸當(dāng)量(mg TAE/g·樣品干重)表示。

(4) VC含量：參照文獻(xiàn)[23]的方法進(jìn)行測定，結(jié)果以mg/g·樣品干重表示。

1.3.3 抗氧化活性檢測

(2) 鐵離子還原能力(FRAP)：參考Lu等[25]的方法。

(3) ABTS+·清除能力：參考Oh等[26]的方法，

抗氧化能力均采用每克干樣品中Trolox當(dāng)量表示，單位為μmol TE/g·樣品干重。

1.3.4 橙皮中黃酮類化合物的檢測 采用HPLC測定橙皮中黃酮類化合物[27]。色譜條件：LC-20A高效液相色譜儀，色譜柱為安譜 CNW Athena C18-WP Symmetry (4.6 mm×250 mm, 5 μm)，檢測波長254 nm。流動(dòng)相為1%乙酸水(A) 和甲醇(B)，流速0.8 mL/min，柱溫35 ℃，進(jìn)樣量20 μL。流動(dòng)相梯度洗脫程序?yàn)?～18 min，20%～70% B；18～25 min，70%～80% B；25～26 min，80%～20% B；26～35 min，20% B。

1.3.5 統(tǒng)計(jì)分析 方差分析由SPSS 17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行，數(shù)據(jù)表示為[平均值±標(biāo)準(zhǔn)偏差(SD)]。利用XLSTAT 2015軟件進(jìn)行主成分分析和系統(tǒng)聚類分析，采用Pearson相關(guān)系數(shù)進(jìn)行相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 橙皮中抗氧化活性成分含量

橙皮中的多酚、黃酮、單寧和VC含量見表1。由表1可知，8種甜橙皮中的抗氧化成分含量具有顯著性差異(P<0.05)。多酚含量在5.470～7.596 mg GAE/g·樣品干重，黃酮含量在3.033～4.566 mg RE/g·樣品干重，單寧含量在8.893～17.900 mg TAE/g·樣品干重，VC含量在13.236～17.858 mg/g·樣品干重，高于臺(tái)灣品種Liucheng (C.sinensisL.)的黃酮含量(1.51 mg/g·樣品干重)[28]。

8種甜橙皮中，以麻陽冰糖橙皮的多酚含量最高，其次是瀏陽臍橙。同時(shí)，麻陽冰糖橙皮中黃酮含量也最高，其次是洪江冰糖橙，永興冰糖橙和瀏陽臍橙。VC含量和黃酮含量的排序較相似，也是以麻陽冰糖橙>永興冰糖橙>洪江冰糖橙>瀏陽臍橙的順序排列。單寧含量最高的仍為麻陽冰糖橙皮，洪江冰糖橙單寧含量稍低于麻陽冰糖橙皮，邵陽臍橙皮多酚含量最低，僅為麻陽冰糖橙皮單寧含量的1/2。由此可知，麻陽冰糖橙皮具有比其他冰糖橙皮更多的抗氧化活性成分含量，也顯著高于麻陽臍橙皮活性成分的含量。值得注意的是洪江冰糖橙，麻陽冰糖橙和石門臍橙3種橙皮中4種抗氧化成分的含量均按以下順序排列：單寧>VC>多酚>黃酮，而在其他樣品中排列順序則為：VC>單寧>多酚>黃酮。

2.2 橙皮主要黃酮類化合物鑒定

6種黃酮類化合物的線性回歸方程、線性范圍、相關(guān)系數(shù)、檢測限(LOD)和定量限(LOQ)見表2。結(jié)果表明，各標(biāo)準(zhǔn)品在濃度范圍內(nèi)呈良好的線性關(guān)系，且檢測限LOD和定量限LOQ值均低于4 mg/L，說明該液相檢測方法有很高的靈敏度。

表1 8種甜橙皮中抗氧化活性成分含量?

? 同列上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表2 6種黃酮類化合物的標(biāo)準(zhǔn)曲線?

?y為峰面積，x為標(biāo)準(zhǔn)品濃度(mg/L)。

8種甜橙皮樣品的HPLC譜圖見圖1，根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)曲線計(jì)算所得樣品中各黃酮類化合物的含量見表3，除了新橙皮苷未檢出外，其他5種化合物在8種甜橙皮中都能檢出且存在顯著差異，與黃壽恩等[27]在溫州蜜柑皮中也未檢測到新橙皮苷結(jié)果類似。Wang等[11]報(bào)道橙皮苷是柑橘皮中最主要的黃烷酮糖苷，劉賢青等[29]對湖北省秭歸縣臍橙的研究發(fā)現(xiàn)黃皮層中以甜橙黃酮、川陳皮素和橘皮素等多甲氧基黃酮為主，而白皮層、囊衣和汁胞中的類黃酮以橙皮苷、柚皮苷為主。試驗(yàn)結(jié)果發(fā)現(xiàn)橙皮苷的含量比例也是最高的，橙皮苷范圍為2.63～4.65 mg/g·樣品干重，遠(yuǎn)高于甘南臍橙0.21 mg/g[30]和新干香橙0.51 mg/g[31]，也高于陜西漢中柑橘皮中的橙皮苷含量(0.33 mg/g)[32]，但低于奉節(jié)臍橙皮橙皮苷的含量(1.67%～3.76%)[33]。柚皮苷含量稍低于橙皮苷，含量范圍為3.32～1.12 mg/g·樣品干重，以麻陽臍橙的含量最高，是含量最低的石門臍橙皮的3倍左右。橙皮素含量范圍為0.12～0.36 mg/g·樣品干重，以邵陽臍橙含量最高，而川陳皮素和桔紅素，均在永興冰糖橙皮中含量最高，分別為(0.84±0.08)，(0.26±0.03) mg/g·樣品干重。橙皮中黃酮種類和含量的差異可能是由橙子的品種或生長條件差異所造成的[6]。

S、A、B、C、D、E、F、G、H分別為混標(biāo)及永興冰糖橙、洪江冰糖橙、石門冰糖橙、麻陽冰糖橙、石門臍橙、麻陽臍橙、邵陽臍橙、瀏陽臍橙8種橙皮乙醇提取物色譜圖，峰1～6分別為柚皮苷、橙皮苷、新橙皮苷、橙皮素、川陳皮素、桔紅素

圖1 標(biāo)準(zhǔn)品混合物及8種甜橙橙皮提取液在254 nm處的HPLC-UV色譜圖

Figure 1 HPLC-UV chromatograms of standards mixture and ethanol extracts of 8 sweet orange peel at 254 nm

表3 8種甜橙皮主要黃酮類化合物含量的比較?

? 同列上標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)；-表示未檢出。

2.3 8種甜橙皮提取物抗氧化活性分析

8種甜橙皮提取物的抗氧化活性結(jié)果見圖2。由圖2可知，8種甜橙皮中的抗氧化活性具有顯著性差異(P<0.05)。DPPH·清除能力為11.39～33.24 μmol TE/g·樣品干重。其中，DPPH·清除活性最高的為邵陽臍橙皮[(33.24±0.57) μmol TE/g·樣品干重]，稍高于麻陽臍橙的[(32.68±1.26) μmol TE/g·樣品干重]，以石門冰糖橙皮最低；FRAP以麻陽冰糖橙皮的最高，其值為(81.45±0.93) μmol TE/g·樣品干重，約為石門臍橙[(41.93±0.87) μmol TE/g·樣品干重]的2倍，ABTS+· 清除能力在32.40～93.15 μmol TE/g·樣品干重，其抗氧化活性最高的為永興冰糖橙皮，其次為洪江冰糖橙，也以石門臍橙皮最低。綜合比較表明，永興冰糖橙和麻陽冰糖橙具有較顯著的抗氧化活性，這些較高的抗氧化活性可能與提取物中較高的黃酮類化合物含量有很大的關(guān)系。

A、B、C、D、E、F、G、H分別為永興冰糖橙、洪江冰糖橙、石門冰糖橙、麻陽冰糖橙、石門臍橙、麻陽臍橙、邵陽臍橙、瀏陽臍橙；同一指標(biāo)字母不同表示差異顯著(P<0.05)

圖2 8種甜橙皮中的抗氧化能力

Figure 2 Antioxidant activity of 8 kinds of sweet orange peels

2.4 抗氧化活性成分與抗氧化活性相關(guān)性分析

甜橙皮的抗氧化活性(DPPH、FRAP和ABTS)與抗氧化活性成分(多酚、黃酮、單寧和VC)之間Spearman相關(guān)性分析結(jié)果見表4。3種抗氧化活性與多酚、黃酮、單寧和VC4種活性成分都存在顯著(P<0.01)的相關(guān)性，但抗氧化活性與各抗氧化成分的相關(guān)系數(shù)均低于0.8，為中度或低度相關(guān)，可能與這些活性成分的相互作用有一定的關(guān)系。同時(shí)結(jié)果表明，多酚與黃酮的含量之間存在很強(qiáng)的相關(guān)性(r=0.905，P<0.01)，說明甜橙皮中黃酮的含量所占總多酚含量比例最大。

表4 抗氧化活性成分和抗氧化活性斯皮爾曼相關(guān)系數(shù)

? **表示在P<0.01水平有顯著性差異。

2.5 主成分和聚類分析

以抗氧化活性成分及抗氧化活性為變量，采用SPSS 17.0軟件進(jìn)行主成分分析，由圖3可知，第1主成分具有最大的特征值4.057，能解釋57.960%的總變異；第2、第3、第4主成分特征值分別為1.069，0.910，0.646，能解釋總變異的值分別為15.265%，12.995%，9.230%。前4個(gè)主成分能解釋95.450%的總變異。因此，可以選擇F1、F2、F3和F4主成分作為評價(jià)指標(biāo)。因子載荷陣(表5)是來自于主成分的原始變量(多酚、黃酮、單寧、VC、DPPH、FRAP和ABTS)和因子之間的相關(guān)性。這些數(shù)據(jù)代表著抗氧化活性成分和抗氧化能力對總變異的貢獻(xiàn)?；贖air等[34]主成分分析理論，載荷因子值≥0.7可用來確定最重要變量和主成分。由表5可知：第1主成分反映的主要指標(biāo)有：多酚(0.848)、黃酮(0.938)、單寧(0.817)、VC(0.902)；第2主成分反映的主要指標(biāo)有VC(-0.058)、DPPH(-0.566)、FRAP(-0.353)和ABTS(-0.495)；第3主成分反映的主要指標(biāo)有：VC(0.334)和DPPH(0.702)；第4主成分反映的主要指標(biāo)為FRAP(0.593)和ABTS(-0.492)。因此，第一主成分主要由多酚、黃酮、單寧和VC來貢獻(xiàn)的，這些指標(biāo)可作為橙皮聚類的重要指標(biāo)。

根據(jù)8種不同產(chǎn)地甜橙彼此之間的差異性進(jìn)行聚類分析，結(jié)果見圖4。結(jié)合聚類分析結(jié)果可知：8種甜橙大致被分成了三類。由于永興冰糖橙、洪江冰糖橙、麻陽冰糖橙和瀏陽臍橙皮中的多酚、黃酮、單寧和VC含量最高，F(xiàn)RAP和ABTS抗氧化活性也最大，被歸為Ⅰ類；石門冰糖橙和石門臍橙皮中含有較多的多酚、黃酮和VC，被歸為Ⅱ類；麻陽臍橙和邵陽臍橙皮中的抗氧化活性物質(zhì)含量較低，被歸為Ⅲ類。8種甜橙由于產(chǎn)地和品種不同，橙皮中抗氧化活性物質(zhì)的含量和抗氧化活性大小不同。因此甜橙皮中抗氧化活性物質(zhì)的含量及其抗氧化活性可以作為區(qū)分不同產(chǎn)地甜橙的重要指標(biāo)。

表5 因子載荷陣

TT、TP、TF、VC分別為總單寧、總酚、總黃酮和VC；DPPH、ABTS、FRAP分別為DPPH、ABTS和FRAP抗氧化活性；A、B、C、D、E、F、G、H分別代表永興冰糖橙、洪江冰糖橙、石門冰糖橙、麻陽冰糖橙、石門臍橙、麻陽臍橙、邵陽臍橙和瀏陽臍橙

圖3 8種甜橙皮的得分圖

Figure 3 Score plot of 8 kinds of sweet orange peels

A、B、C、D、E、F、G、H分別代表永興冰糖橙、洪江冰糖橙、石門冰糖橙、麻陽冰糖橙、石門臍橙、麻陽臍橙、邵陽臍橙和瀏陽臍橙

圖4 聚類分析樹狀圖

Figure 4 Dendrogram for sweet orange peels obtained from the hierarchical cluster analysis

3 結(jié)論

抗氧化活性成分分析結(jié)果表明8種甜橙橙皮中多酚、黃酮、單寧和VC等抗氧化成分具有顯著性差異(P<0.05)。其中以麻陽冰糖橙皮中的黃酮含量、單寧含量和VC的含量都是最高，HPLC檢測結(jié)果顯示8種甜橙的橙皮中黃酮類化合物含量也有顯著性差異，其中含量最高的為橙皮苷，最低的為新橙皮苷?？寡趸钚越Y(jié)果也表明不同產(chǎn)地和不同品種的甜橙皮中的抗氧化活性具有顯著性差異(P<0.05)，綜合比較可知永興冰糖橙皮和麻陽冰糖橙皮具有相對較顯著的抗氧化活性，Spearman相關(guān)性分析表明甜橙皮的抗氧化能力與抗氧化活性成分之間存在顯著相關(guān)性(P<0.01)。通過系統(tǒng)聚類和綜合主成分分析法，8種甜橙大致可分成三類，第Ⅰ類：永興冰糖橙、洪江冰糖橙、麻陽冰糖橙和瀏陽臍橙；第Ⅱ類：石門冰糖橙和石門臍橙；第Ⅲ類：麻陽臍橙和邵陽臍橙。湖南作為柑橘生產(chǎn)大省，有著豐富的柑橘品種和產(chǎn)量，尤其是有著中國冰糖橙之鄉(xiāng)美譽(yù)的麻陽縣，冰糖橙產(chǎn)量全國第一，而大部分以鮮食為主，因此加大對冰糖橙和臍橙皮中抗氧化活性成分和黃酮類化合物的含量差異及抗氧化活性能力的研究，提高甜橙皮深加工很有必要。