張祺祺 - 程俊俠 - 王 琦 王浩鵬 -楊 娜 郭俊彤 - 邵紅軍 -

(1. 陜西師范大學(xué)食品工程與營養(yǎng)科學(xué)學(xué)院，陜西 西安 710119；2. 陜西省綠色食品制造與安全控制實驗室，陜西 西安 710119；3. 陜西省環(huán)境監(jiān)測中心站，陜西 西安 710043)

抹茶是采摘覆蓋遮陰栽培的優(yōu)質(zhì)鮮茶葉，經(jīng)蒸青、烘干和研磨而成的超細綠茶粉末[1]。相對普通綠茶，栽培期間的遮陰處理有利于茶葉中葉綠素和茶氨酸的積累，改善其風(fēng)味品質(zhì)。加之蒸青和低溫研磨處理，使得抹茶具有獨特的感官品質(zhì)和營養(yǎng)保健功效[2]。如Weiss等[3]報道，抹茶中高活性的表沒食子兒茶素沒食子酸酯(epigallocatechin-3-gallate，EGCG)含量是高品質(zhì)綠茶的137倍，比文獻報道的其他綠茶也高出2～3倍。這與抹茶以鮮嫩葉為加工原料直接相關(guān)，鮮嫩茶葉的EGCG含量比老葉的高，經(jīng)遮陰處理的葉片也比未經(jīng)遮陰的含有更多的茶多酚[4]。已有研究[5-7]表明，抹茶具有改善血液流動、改善心血管疾病、緩解壓力、降血糖和降血脂等作用。因此，近年來抹茶在全世界范圍內(nèi)受歡迎的程度和關(guān)注度不斷上升。

抹茶作為天然食品添加劑廣泛應(yīng)用于冰淇淋、奶茶、面條、餅干和蛋糕等高端食品加工[8-10]，其直接飲品在中國的消費量也逐年增加。與茶葉多次沖泡取茶湯飲用方式不同，抹茶通常用水沖泡之后形成茶湯和茶粉整體攝入，實現(xiàn)了從“飲茶”到“吃茶”的轉(zhuǎn)變。一般認為，抹茶的這種攝入方式可最大化地利用茶葉中的營養(yǎng)物質(zhì)，包括膳食纖維等大分子和與之結(jié)合的多酚等小分子物質(zhì)，但有關(guān)抹茶粉各類物質(zhì)在加工及攝入后的消化過程中變化研究甚少。就茶多酚而言，研究[11]表明不同茶葉成品形態(tài)及沖泡條件對其生物可及性以及生物利用度有重要的影響，如相同沖泡條件下袋泡茶比散茶葉的茶多酚更易溶出，從而具有更高的生物可及性。但抹茶作為粒徑為10～32 μm的超微茶粉，其茶多酚的溶出情況和抗氧化活性等尚未明確。

試驗擬通過分析抹茶湯pH值、可滴定酸、色差、VC等理化指標及感官品質(zhì)，利用UPLC分析多酚組成和含量及抗氧化活性，為抹茶營養(yǎng)功能的全面認知和深度開發(fā)提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

抹茶：宇治抹茶(YZM)、曹老爺抹茶(CLM)均購于陜西西安華潤萬家超市，置于密閉容器中并于4 ℃避光保存?zhèn)溆茫?/p>

沒食子酸(GA)、沒食子兒茶素(GC)、表沒食子兒茶素(EGC)、兒茶素(C)、表沒食子兒茶素沒食子酸酯(EGCG)、咖啡因(CAF)、表兒茶素(EC)、沒食子兒茶素沒食子酸酯(GCG)、表兒茶素沒食子酸酯(ECG)標準品：純度為98%，美國Sigma-Aldrich公司；

無水乙醇、碳酸鈉、氫氧化鈉、過硫酸鉀、氯化鐵：分析純，國藥集團化學(xué)試劑有限公司；

福林酚試劑：分析純，西安晶博生物科技有限公司；

2,2-二苯基-1-苦基肼基(DPPH)、2,2-連氮雙-(3-乙基苯并噻唑啉)-6-磺酸 (ABTS)、2,4,6-三(2-吡啶基)-s-三嗪(TPTZ)、VE(Trolox)：純度>98%，上海源葉生物科技有限公司。

1.2 儀器與設(shè)備

電熱恒溫水浴鍋：HH-S6A型，北京科偉永興儀器有限公司；

高速離心機：HC-3018型，安徽中科中佳科學(xué)儀器有限公司；

酸度計：PB-10型，賽多利斯科學(xué)儀器(北京)有限公司；

色彩色差計：CM-350D型,日本Mionha公司；

酶標儀：Multiskan GO型，美國熱電(西安)公司；

真空冷凍干燥機：LGJ-18C型，北京四環(huán)科學(xué)儀器廠；

高效液相色譜儀：U-3000型，美國Thermo Fisher公司。

1.3 試驗方法

1.3.1 樣品制備 根據(jù)文獻[12]，修改如下，稱取宇治抹茶及曹老爺抹茶各1.0 g與100 mL、80 ℃蒸餾水混合，水浴保溫30 min后離心、收集上清液定容至100 mL。與一泡方法相同，茶渣用80 ℃蒸餾水重復(fù)浸提兩次，從而得到二泡、三泡茶湯，置于4 ℃冰箱中保存?zhèn)溆谩?/p>

1.3.2 理化指標測定

(1) pH值：酸度計測定。

(2) 可滴定酸：氫氧化鈉滴定法[13]。

(3) 色差：色差儀測定。

(4) VC：碘量法[14]。

1.3.3 感官評分 由10名感官品評員組成評價小組，對上述沖泡的抹茶湯進行感官質(zhì)量評定。品評員培訓(xùn)及實驗室要求參照GB/T 16291.1—2012和GB/T 13868—2009相關(guān)要求，抹茶感官審評方法參照GB/T 23776—2018并稍作修改。評定項目包括湯色、香氣和滋味，滿分100分，取10人評分的平均值作為評分結(jié)果，評分標準見表1。

表1 抹茶湯的感官評分標準

1.3.4 總多酚含量測定 根據(jù)文獻[15]，略作修改。吸取50 μL茶湯與50 μL福林酚試劑混合、搖勻，然后再加入800 μL 蒸餾水，充分搖勻，室溫下靜置8 min后加入7.5% Na2CO3溶液800 μL，搖勻后于室溫下避光放置1 h，然后在765 nm下測其吸光度A，以沒食子酸制作標準曲線并計算樣品茶多酚的含量?？偠喾雍勘硎緸楹量藳]食子酸當(dāng)量每克干重，即mg GAE/g ·DW。

1.3.5 UPLC分析 色譜柱：C18柱，150 mm×3 mm，3 μm；流動相A：0.1%甲酸水；流動相B：100%甲醇；洗脫程序：0～2 min，18% B；2～5 min，18%～34% B；5～8 min，34%～35% B；8～16 min，35%～38% B；16～17 min，38%～60% B；17～22 min，60% B；22～24 min，60%～18% B；24～26 min，18% B。流動相流速1.0 mL/min，檢測波長280 nm，柱溫30 ℃。

1.3.6 抗氧化活性

(1) 清除DPPH自由基能力：參照Celep等[16]的方法，略作修改。準確吸取500 μL濃度為2×10-4mol/L的DPPH工作液與100 μL待測茶湯樣品溶液混合搖勻，室溫下避光反應(yīng)30 min，于517 nm下測定混合反應(yīng)液吸光度A1。樣品對照組用無水乙醇代替DPPH工作液測定其吸光度A2；空白組用無水乙醇代替樣品液測定吸光度A0，按式(1)計算DPPH自由基清除率。

(1)

式中：

K——DPPH自由基清除率，%；

A1——樣品吸光度值；

A2——樣品對照吸光度值；

A0——空白對照吸光度值。

以不同摩爾濃度(2.0×10-5～2.0×10-4mol/L)的Trolox清除DPPH自由基的能力作標準曲線，以清除率為縱坐標，Trolox摩爾濃度為橫坐標。根據(jù)回歸方程計算待測茶湯樣品的Trolox當(dāng)量抗氧化能力，結(jié)果表示為微摩爾Trolox當(dāng)量每克干重，即μmol TE/g ·DW。

(2) 清除ABTS+自由基能力：根據(jù)劉薇等[17]的方法，略作修改。取7 mmol/L ABTS溶液和2.45 mmol/L K2S2O8溶液各5 mL，混合均勻，于避光處放置24 h。使用前用無水乙醇稀釋使A734為(0.70±0.20)即可。然后準確吸取750 μL ABTS工作液與100 μL待測茶湯樣品溶液混合搖勻，室溫下避光反應(yīng)6 min后，于734 nm處測其吸光度A1，同時用無水乙醇代替樣品液作為對照測定其吸光度A0，按式(2)計算ABTS+自由基清除率。

(2)

式中：

K——ABTS+自由基清除率，%；

A1——樣品吸光度值；

A0——空白對照吸光度值。

以不同摩爾濃度(4.0×10-5～1.6×10-4mol/L)的Trolox清除自由基的能力作標準曲線，以清除率為縱坐標，Trolox摩爾濃度為橫坐標。根據(jù)回歸方程計算待測茶湯樣品的Trolox當(dāng)量抗氧化能力，結(jié)果表示為微摩爾Trolox當(dāng)量每克干重，即μmol TE/g·DW。

(3) FRAP法測定總抗氧化能力：參考Zhou等[15]等的方法配制FRAP工作液，將pH 3.6醋酸緩沖液、20 mmol/L FeCl3·6H2O和10 mmol/L TPTZ溶液按比例(10∶1∶1)均勻混合。取900 μL FRAP工作液與100 μL一系列FeSO4·7H2O標準溶液(1.0×10-4～6.0×10-4mol/L)或者樣品液混合，搖勻，37 ℃下孵育30 min后，于593 nm下測定吸光度A，結(jié)果表示為微摩爾FeSO4當(dāng)量每克干重，即μmol FE/g·DW。

1.4 統(tǒng)計分析

所有試驗重復(fù)3次，結(jié)果表示為(平均值±標準偏差)。使用SPSS軟件進行分析其差異顯著性(P<0.05)。

2 結(jié)果與分析

2.1 抹茶湯pH、可滴定酸、色差和VC的測定

由表2可知：

(1) 兩種市售抹茶湯的pH值在(5.98±0.01)～(6.43±0.02)，與已報道[18]綠茶茶湯的pH值一致。同時隨著沖泡次數(shù)的增加，pH值略有升高，可能與沖泡過程中茶堿逐漸溶出和可滴定酸的含量逐次降低有關(guān)[19]。

(2) 隨著沖泡次數(shù)的增加，L值逐漸增加，一泡茶湯的明亮度顯著低于二泡、三泡茶湯，二泡和三泡茶湯的明亮度無顯著差異，可能是一泡茶湯水浸出物的茶多酚氧化產(chǎn)物迅速浸出，增加了茶湯的濁度，但隨著沖泡次數(shù)的增加，茶湯內(nèi)含物減少，明亮度增強。a值無顯著變化，b值逐漸降低，即黃度逐漸減弱，說明茶湯中呈現(xiàn)黃色的兒茶素和黃酮類物質(zhì)隨著沖泡次數(shù)增加溶出減少[20]。

(3) YZM和CLM兩種抹茶的一泡茶VC含量分別為(10.45±0.95)，(13.3±0.95) mg/100 mL，而二泡、三泡的茶湯中未檢測到VC。

2.2 抹茶湯品質(zhì)感官審評結(jié)果分析

由表3可知，3次沖泡抹茶湯的審評總評分在72.8～95.2，兩種抹茶一泡茶湯感官評分得分最高，均在90分以上，其茶湯色彩鮮艷，香氣呈現(xiàn)為嫩香型，滋味醇厚甘爽，易被審評人員接受。隨著沖泡次數(shù)的增加，茶湯感官評分逐漸降低，色澤、香氣和滋味相應(yīng)地變差。三泡茶湯評分最低，具體表現(xiàn)在色澤較差、香氣老火、滋味濃澀和有顆粒感。

2.3 抹茶湯總多酚含量

由圖1可知，不同沖泡次數(shù)的茶湯多酚存在顯著差異(P<0.05)，一泡茶湯的多酚含量最高，隨著沖泡次數(shù)的增加，茶多酚含量急劇減少，二泡茶湯中茶多酚含量幾乎為一泡的1/2。說明茶多酚隨沖泡次數(shù)增加而溶出減少，與魏雪等[21]的結(jié)果一致。從釋放的總多酚來看，YZM和CLM兩種抹茶湯含量無顯著差異，分別為(203.48±5.91)，(210.38±1.49) mg GAE/g·DW，與Tontul等[22]對土耳其綠茶粉總多酚的報道(214.9～232.4 mg GAE/g·DW)一致。實際飲用過程中抹茶通常通過1次沖泡后茶湯和茶粉整體攝入，而試驗發(fā)現(xiàn)1次沖泡多酚含量約占3次沖泡抹茶茶湯總多酚含量的66%。說明有相當(dāng)比例的茶多酚仍存在于抹茶粉中，可能與茶粉基質(zhì)中難溶的多糖和蛋白質(zhì)等大分子一同進入機體，其在消化過程中的釋放情況有待進一步研究。

表2 沖泡次數(shù)對抹茶湯pH、色差、可滴定酸和VC的影響?

? YZM-1表示一泡，YZM-2表示二泡，以此類推；同列字母不同表示差異顯著(P<0.05)。

表3 沖泡次數(shù)對抹茶湯感官品質(zhì)的影響?

? YZM-1表示一泡，YZM-2表示二泡，以此類推。

2.4 抹茶湯多酚化學(xué)組成

由圖2可知，兩種抹茶湯的化學(xué)輪廓相似，8種兒茶素成分和咖啡因均有檢出。總體上看，CAF、EGCG、EGC、EC和ECG為茶湯中含量相對較高的5種化合物。其中YZM和CLM兩種抹茶茶湯3次提取的EGCG總含量分別為(14.84±0.61)，(30.44±1.24) mg/g·DW，與Weiss等[3]結(jié)果相比，其EGCG含量比綠茶含量[(0.42±0.05) mg/g·DW]高，但比甲醇提取的抹茶湯含量(57.4 mg/g·DW)低，可能與所用提取溶劑等條件不同有關(guān)。此外，抹茶茶湯中CAF含量也比一般綠茶含量高[2]，而GA、GC、C和GCG含量相對較少，其范圍在1～3 mg/g·DW。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

由圖2還可知，9種有效物質(zhì)的含量在3次沖泡茶湯中逐次降低。林春芳等[20]進行了白茶中酚類成分的提取動力學(xué)分析，結(jié)果顯示在某一特定溫度下，提取時間對酚類成分的釋放有顯著影響，各物質(zhì)的提取速率在前50 min明顯較快。而試驗中，3次沖泡茶湯各物質(zhì)差異較大。以CLM為例，一泡30 min沖泡茶湯中，9種有效成分全部檢出，其含量順序為：CAF>EGCG>EGC>EC>ECG>GC>GCG>GA>C，其中CAF含量高達(28.34±1.03) mg/g·DW；二泡茶湯中9種有效成分雖均被檢測到，但各物質(zhì)的含量顯著低于一泡茶湯(P<0.05)，其中GC含量由(2.40±0.10) mg/g· DW減至(0.17±0.02) mg/g·DW，EGC含量由(19.61±1.05) mg/g·DW減至(1.11±0.02) mg/g·DW，C含量則由(1.17±0.05) mg/g·DW 銳減至(0.15±0.02) mg/g·DW；隨后在三泡茶湯中，GC、EGC和C均未檢出，其他物質(zhì)含量也低于二泡茶湯。YZM和CLM兩種抹茶茶湯3次沖泡釋放總酚類化合物含量分別為68.10，106.60 mg/g·DW，稍低于Yang等[23]報道的不同粒徑范圍綠茶粉的總兒茶素含量[(156.39±2.90)～(162.57±1.17) mg/g·DW]，而高于Zaiter等[24]報道的綠茶粉的總兒茶素含量(20.0～33.5 mg/g·DW)，可能與不同研究中所采用的方法和原料差異有關(guān)。

1. YZM 2. CLM

2.5 抹茶湯抗氧化活性測定

以YZM和CLM兩種抹茶的3次沖泡茶湯為樣品，分別測定DPPH自由基、ABTS+自由基的清除效果和FRAP法測定總抗氧化能力，綜合評價體外抗氧化活性，結(jié)果如圖3所示。

由圖3(a)可知，YZM和CLM兩種抹茶一泡茶湯對DPPH自由基清除能力較高，分別為(915.65±11.03)，(1 128.45±115.96) μmol TE/g·DW，說明抹茶茶湯多酚對DPPH自由基有較強的清除能力。與韓衛(wèi)娟等[25]對柿葉茶、杜仲雄花茶、綠茶和紅茶體外抗氧化活性研究結(jié)果相比，一泡抹茶茶湯的DPPH自由基清除能力比上述4種茶的能力都強。但隨著沖泡次數(shù)的增加，二泡茶湯的DPPH自由基清除能力分別減少了762.40，964.93 μmol TE/g·DW，三泡茶湯的DPPH自由基清除能力為二泡茶湯的1/2，與多酚含量變化趨勢一致。由圖3(b)可知，3次沖泡茶湯對ABTS+自由基也具有清除活性，且三者之間均存在顯著差異。一泡茶湯的ABTS+自由基清除能力仍最強[分別為(680.23±57.82)，(779.82±121.51) μmol TE/g·DW]，為二泡茶湯的8倍，三泡茶湯的20倍。由圖3(c)可知，F(xiàn)RAP法測得抗氧化活性大小為一泡>二泡>三泡，該結(jié)果與上述DPPH和ABTS+自由基清除能力一致?？傮w而言，抹茶湯具有較高的體外抗氧化活性，多酚含量與其抗氧化能力存在明顯的正相關(guān)。

字母不同表示差異顯著(P<0.05)

3 結(jié)論

試驗系統(tǒng)分析了宇治抹茶和曹老爺抹茶3次沖泡抹茶茶湯的pH、可滴定酸、色差、VC、總酚、兒茶素、咖啡因的含量及其抗氧化能力，并進行感官審評。結(jié)果表明，兩種抹茶間品質(zhì)差異不顯著，其活性成分均隨沖泡過程逐漸地溶出，3次沖泡茶湯間存在明顯差異。其中，一泡茶湯的色香味感官品質(zhì)最優(yōu)，總多酚和兒茶素等單體的含量也最高，其主要組分為表沒食子兒茶素沒食子酸酯、咖啡因和表沒食子兒茶素；同時表現(xiàn)出明顯的DPPH、ABTS+自由基清除活性和總抗氧化能力。然而，實際飲用中抹茶通常是1次沖泡整體攝入，研究表明1次沖泡茶湯中的多酚含量僅占3次沖泡抹茶茶湯總多酚含量的66%，說明實際飲用中抹茶粉中仍有相當(dāng)比例的茶多酚未能溶入茶湯，可能與茶粉基質(zhì)中難溶的多糖和蛋白質(zhì)等大分子一同進入機體，其在消化過程中的釋放情況有待深入研究。