袁 鷹,王 程,韓 俊,張 鑫,仝 瀟,馮凡育,謝 皓
(北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206)
株高對(duì)作物生長(zhǎng)的群體結(jié)構(gòu)和產(chǎn)量來(lái)說(shuō)是很重要的農(nóng)藝性狀[1]。近年來(lái),隨著分子生物學(xué)和基因組學(xué)的飛速發(fā)展,對(duì)作物高產(chǎn)性狀、高產(chǎn)機(jī)理及其相關(guān)基因的研究愈加深入,培育理想株型已成為作物育種的重要目標(biāo)[2]。合理株型是高產(chǎn)品種的生育基礎(chǔ)和形態(tài)特征,其中矮稈是理想株型的一個(gè)重要性狀[3],矮稈基因的利用對(duì)于20世紀(jì)“綠色革命”起到?jīng)Q定性作用[4]。例如,將大豆中抗倒伏的有限結(jié)莢習(xí)性基因dt1轉(zhuǎn)育到無(wú)限結(jié)莢習(xí)性的北方高產(chǎn)品種中,育成Elf、Sprite、Hobbit、Gnome等半矮稈品種,在高產(chǎn)環(huán)境下采取高密度種植實(shí)現(xiàn)超高產(chǎn),并得到大面積推廣應(yīng)用[5]。
前人曾用傳統(tǒng)的統(tǒng)計(jì)分析方法研究大豆株高的遺傳規(guī)律,認(rèn)為株高是多基因控制的數(shù)量性狀,遺傳力較高,受1~2對(duì)主效基因和微效多基因控制[6-7],陳恒鶴等[8]研究指出“矮源矬”的株高性狀受1對(duì)隱性主效基因和多個(gè)修飾基因共同控制,而Kilen等研究表明大豆品種PI227224的矮稈性狀是由單個(gè)隱性基因控制[9-10]。Hwang等[11]在輻照大豆種子的快速鑒定中得到1個(gè)矮稈突變體,通過(guò)全基因組關(guān)聯(lián)分析表明,存在1個(gè)803 bp的缺失區(qū)域可能與矮稈表現(xiàn)型相關(guān)。Cheng等[12]用γ射線誘變M2群體大豆得到2個(gè)都是隱性遺傳方式的突變體Gmdwf1和Gmdwf2。Li等[13]用EMS誘變大豆栽培品種中品661,得到1對(duì)隱性核基因控制能明顯降低株高和縮短莖節(jié)尖的DW突變體。
本課題組在育種工作中,利用海系13為母本與父本北農(nóng)103雜交,在(海系13×北農(nóng)103)F4部分剩余雜合體分離群體(RHL)中發(fā)現(xiàn)高稈/矮稈性狀分離明顯。北農(nóng)103為北京市審定的夏播品種,從中黃18種子60Co-γ輻照的衍生后代選育而成,而中黃18的雜交組合為中品661×Century-2。Century-2是優(yōu)良品種Century(不含脂肪氧化酶-Lox)的近等基因系,推測(cè)分離后代中的矮源可能來(lái)自Century-2,而對(duì)Century-2和Century株高方面的研究尚無(wú)報(bào)道。
本研究擬通過(guò)對(duì)(海系13×北農(nóng)103)F4RHL的F2高稈/矮稈分離群體的遺傳分析,解析高稈/矮稈性狀的遺傳規(guī)律,并利用F2∶3分離群體對(duì)其中北農(nóng)103中控制矮稈RHL性狀的基因進(jìn)行分子標(biāo)記與定位,為該基因精細(xì)定位奠定基礎(chǔ)。
1套(海系13×北農(nóng)103)F4RHL的F2分離群體,由北京農(nóng)學(xué)院大豆課題組選育。其中,海系13為南京菜用春大豆品種,株高90 cm;北農(nóng)103為北京市審定的夏播品種,株高55 cm;F2分離群體中高株平均90 cm,矮株平均35 cm。SSR引物,由北京鼎國(guó)昌盛有限公司合成。
1.2.1 高稈/矮稈分離群體鑒定與遺傳分析 在大豆鼓粒期對(duì)(海系13×北農(nóng)103)F4RHL的F1和F2代高稈/矮稈田間鑒定,并對(duì)F2中表現(xiàn)高稈/矮稈分離株系的鑒定結(jié)果進(jìn)行卡方檢驗(yàn)。
1.2.2 大豆基因組DNA提取及分子標(biāo)記 采用CTAB法對(duì)(海系13×北農(nóng)103)F4RHL中F2∶3群體的單株葉片進(jìn)行基因組DNA的提取。采用BSA法,根據(jù)田間調(diào)查結(jié)果,分別用F2∶3群體中6個(gè)高稈和6個(gè)矮稈單株構(gòu)建DNA高稈池和矮稈池,初步篩選控制矮稈基因的分子標(biāo)記;利用(海系13×北農(nóng)103)F4RHL中F2∶3群體對(duì)初選標(biāo)記進(jìn)行驗(yàn)證。
1.2.3 PCR擴(kuò)增與電泳 用Bio-Rad PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。PCR反應(yīng)體系為10 μL,包括正向引物0.5 μL(0.2 μm/L),反向引物0.5 μL(0.2 μm/L),PCR Mix 5 μL,DNA模板2 μL(15~25 ng/μL),ddH2O 2 μL。PCR反應(yīng)程序?yàn)椋?5 ℃預(yù)變性10 min;95 ℃變性30 s,55 ℃退火30 s,72 ℃延伸45 s,35個(gè)循環(huán),最后72 ℃延伸10 min。
PCR擴(kuò)增產(chǎn)物用8%非變性聚丙烯酰胺凝膠(丙烯酰胺∶甲叉雙丙烯酰胺=39∶1)電泳的方法進(jìn)行檢測(cè)。點(diǎn)樣量為1.8 μL,150 V電泳1.5~2 h。采用快速銀染法染色顯帶,照相后統(tǒng)計(jì)帶型。
1.2.4 數(shù)據(jù)分析和遺傳作圖 將統(tǒng)計(jì)的帶型用Mapmaker3.0軟件(LOD值取3.0)計(jì)算篩選出的分子標(biāo)記與矮稈基因間遺傳距離;采用MapDrawV2.1軟件構(gòu)建遺傳連鎖圖譜;參照大豆遺傳連鎖圖譜(www.soybase.org)進(jìn)行基因定位。
注:左為高稈植株,右為矮稈植株。Note:Left is tall plant, Right is dwarf plant.圖1 (海系13×北農(nóng)103)F4RHL的F2株高分離表現(xiàn)Fig.1 (HaiXi 13×BeiNong 103) F2 of F4RHL plant height separation performance
以大豆(海系13×北農(nóng)103)F4RHL的F2分離群體為分析材料,從中各選取6個(gè)髙稈單株和6個(gè) 矮稈單株,采用BSA法,建立高稈和矮稈2個(gè)近等基因池,利用大豆630對(duì)SSR引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增,在8%非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳圖譜中,分析篩選2個(gè)近等基因池間具有多態(tài)性的SSR引物。經(jīng)多次PCR篩選,在630對(duì)SSR引物中,獲得25對(duì)具有多態(tài)性的引物,占總引物的4%,擴(kuò)增產(chǎn)物表現(xiàn)出2~3條電泳譜帶,在150~300 bp之間。在此基礎(chǔ)上,利用RHLF2高矮稈分離材料中的30個(gè)髙稈和30個(gè)矮稈單株,繼續(xù)對(duì)25對(duì)引物的擴(kuò)增結(jié)果進(jìn)行驗(yàn)證,發(fā)現(xiàn)在25對(duì)引物中,9個(gè)引物所產(chǎn)生標(biāo)記與GmD1具有連鎖關(guān)系,分別為Satt527,Satt166、Sat_340、Satt481、Sat_150、Sat_245、Satt076、Satt229和Satt664。為進(jìn)一步分析這9對(duì)引物產(chǎn)生的標(biāo)記與GmD1的連鎖距離,以(海系13×北農(nóng)103)RHLF2分離群體共201個(gè)單株進(jìn)行PCR檢測(cè),其中高稈139個(gè),矮稈62個(gè)。檢測(cè)結(jié)果表明,9個(gè)SSR引物(表1)擴(kuò)增產(chǎn)生標(biāo)記均與矮稈基因GmD1緊密連鎖(表2),其中3對(duì)引物的PCR結(jié)果見(jiàn)圖2。
表1 SSR引物序列Tab.1 The SSR primer for analysis
表2 9個(gè)SSR標(biāo)記對(duì)(海系13×北農(nóng)103)RHLF2的檢測(cè)結(jié)果和與GmD1的遺傳距離Tab.2 Analysised results of HaiXi13×BeiNong103 RHLF2 by 9 SSR markers and genetic distance of GmD1
注:A為高稈純合型;B為矮稈純合型;H為雜合帶型。
Note:A is high plant homozygous genotype; B is dwarf plant homozygous genotype; H is heterozygous genotype.
注:M是標(biāo)記,1是海系13,2 是北農(nóng)103,3-17是矮稈單株,18-32是高稈單株;箭頭指示標(biāo)記位置。Note: M is Maker, 1 is Haixi13, 2 is BeiNong103, 3-17 are Dwarf individuals, 18-32 are High individuals; The arrows indicated the SSR markers .圖2 標(biāo)記Satt481(A)、Sat_245(B)和Sat_150(C)的PCR結(jié)果Fig.2 PCR bySatt481(A), Sat_245(B) and Sat_150(C)
利用Mapmaker3.0連鎖分析軟件對(duì)表1中的9對(duì)SSR引物在(海系13×北農(nóng)103)RHLF2分離群體中的201個(gè)單株所產(chǎn)生的分子標(biāo)記與矮稈基因GmD1進(jìn)行連鎖分析,并繪制遺傳連鎖圖譜。結(jié)果表明:SSR標(biāo)記Satt527、Satt166、Sat_340、Satt481、Sat_150、Sat_245、Satt076、Satt229和Satt664與GmD1的遺傳距離分別為3.7、4.2、5.2、6.2、6.4、7.9、8.4、11.6、18.5 cM,從遺傳連鎖圖譜(圖3)上可以看出GmD1位于satt166與satt527之間,與9個(gè)標(biāo)記的連鎖位置為Satt664-Satt229-Sat_245-Sat_150-Satt481-Sat_340-Satt527-GmD1-Satt166-Satt076。通過(guò)對(duì)公布的大豆遺傳連鎖圖譜(www.soybase.org)上SSR位點(diǎn)分析,這9個(gè)SSR標(biāo)記均在大豆L連鎖群上,故GmD1基因也在L連鎖群上,對(duì)應(yīng)大豆第19號(hào)染色體。
本研究利用(海系13×北農(nóng)103)F4RHL的F2髙稈和矮稈植株構(gòu)建的分離群體,對(duì)其矮稈植株攜帶的矮稈基因進(jìn)行遺傳分析。矮稈性狀受1對(duì)隱性基因控制,暫命名為GmD1。進(jìn)而利用SSR分子標(biāo)記結(jié)合BSA方法對(duì)GmD1進(jìn)行遺傳連鎖分析,篩選出9個(gè)與GmD1連鎖的SSR標(biāo)記,分別為Satt527、Satt166、Sat_340、Satt481、Sat_150、Sat_245、Satt076、Satt229和Satt664,經(jīng)Mapmaker3.0軟件連鎖分析,與GmD1的遺傳距離分別為3.7、4.2、5.2、6.2、6.4、7.9、8.4、11.6、18.5 cM。依據(jù)公布的大豆遺傳連鎖圖譜上SSR標(biāo)記位點(diǎn)分析,GmD1位于大豆L連鎖群上,對(duì)應(yīng)大豆第19號(hào)染色體。
圖3 大豆矮稈基因GmD1遺傳連鎖圖Fig.3 Genetic linkage map of soybean dwarf gene GmD1
通過(guò)對(duì)海系13×北農(nóng)103雜交組合的親本株高的表現(xiàn)和系譜分析,GmD1來(lái)源于北農(nóng)103,而北農(nóng)103從中黃18種子60Co-γ輻照的衍生后代選育而成,中黃18的雜交組合為中品661×Century-2。Li等[13]用EMS誘變大豆品種中品661,得到1個(gè)能明顯降低株高和縮短莖節(jié)尖的DW突變體,認(rèn)為該突變體是由1對(duì)隱性核基因控制,定位在大豆8號(hào)染色體的460 kb區(qū)域。本研究發(fā)現(xiàn)該突變體基因與本研究發(fā)現(xiàn)的GmD1不在同一連鎖群(染色體)上,并非同一基因。推測(cè)GmD1可能是一個(gè)新的矮稈基因。
盡管目前關(guān)于大豆矮稈基因的研究有所報(bào)道,但發(fā)現(xiàn)的矮稈基因依然較少,本研究對(duì)GmD1的發(fā)現(xiàn),豐富大豆矮稈基因的類(lèi)型,同時(shí)獲得多個(gè)與GmD1緊密連鎖的分子標(biāo)記,為該基因的精細(xì)定位和利用奠定基礎(chǔ)。