周義杰，閆希煥，高亭豪，劉 芳，楊明峰，馬蘭青，3*

(1.北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 102206；2.生物與資源環(huán)境學(xué)院/農(nóng)業(yè)農(nóng)村部華北都市農(nóng)業(yè)重點實驗室，北京 102206；3.北京農(nóng)學(xué)院北京林果業(yè)生態(tài)環(huán)境功能提升協(xié)同創(chuàng)新中心，北京 102206)

樹莓(Raspberry)是薔薇科(Rusaceae)懸鉤子屬(RubusL.)小漿果類灌木的統(tǒng)稱，又名托盤、山莓、懸鉤子等，是世界公認(rèn)的第三代新興水果，有“黃金水果”“生命之果”之稱。樹莓在栽培上主要有空心莓亞屬(SubgenusIdeobatus)和實心莓亞屬(SubgenusEubatus)兩個亞屬，其主要區(qū)別是空心莓亞屬果實成熟時與花托分離而實心莓亞屬果實成熟時與花托同落?？招妮畞唽儆袣W洲紅樹莓(Rubusidaeus)、黑樹莓(Rubusoccidentalis)和紫樹莓(Rubusneglectus)3個種群，實心莓亞屬有黑莓、無刺黑莓、匍匐形黑莓和黑莓雜交種4個種群[1]。樹莓果實柔嫩多汁，色澤鮮艷，香氣濃郁，風(fēng)味獨特，富含多種對人體有益的活性成分，如超氧化物歧化酶、鞣花酸、黃酮、類黃酮、樹莓酮等，具有抗氧化、抗癌、抗菌消炎、抑制肥胖、預(yù)防心血管疾病等作用[2-5]。樹莓除了果實能夠鮮食外，還廣泛用于食品、制藥、保健品、化妝品生產(chǎn)等行業(yè)，發(fā)展前景廣闊[6]。近年來，中國樹莓產(chǎn)業(yè)推廣速度較快，種植的面積和產(chǎn)量逐漸增加，但樹莓果實采收時節(jié)氣溫較高，果實極不耐貯存，容易在運輸過程腐爛變質(zhì)，導(dǎo)致樹莓鮮果上市期短，常溫下貨架期只有1～2 d[7]，限制樹莓產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。

乙烯是一種重要的內(nèi)源性植物激素，存在于植物的各個器官和組織中，參與調(diào)控高等植物的許多生理過程，比如種子萌發(fā)，生根，葉片、花器官的衰老、果實成熟和逆境脅迫等[8]。乙烯在植物中合成途徑為：腺苷蛋氨酸合成酶催化蛋氨酸與腺苷酸(adenosine monophosphate, AMP)反應(yīng)生成腺苷蛋氨酸(s-adenosvlmeIhionine, SAM)；ACS催化SAM生成1-氨基環(huán)丙烷-1-羧酸(1-aminocyclopropane-1-carboxylate, ACC)；ACC氧化酶(1-aminocyclopropane-1-carboxylate oxidase, ACO)催化ACC氧化生成乙烯，其中ACS是整個合成途徑的限速酶[9]。自1990年從番茄果實的cDNA文庫中分離得到第一個ACS基因序列以來[10]，研究人員已經(jīng)在很多植物中分離出ACS基因，所有這些植物中都含有一個以上的ACS基因[11-15]，說明ACS是由多基因家族編碼的。

電子克隆(insilicocloning)是隨著基因組計劃和EST(Expressed Sequence Tag)計劃發(fā)展起來的基因克隆新技術(shù)。與傳統(tǒng)的圖位克隆、轉(zhuǎn)座子標(biāo)簽技術(shù)、遞減雜交技術(shù)等方法相比具有成本低、速度快、操作簡單、目的性強的優(yōu)勢[16-18]。利用電子克隆技術(shù)進(jìn)行樹莓ACS基因家族成員的克隆，從中尋找與果實成熟相關(guān)的ACS基因，可以推進(jìn)樹莓果實成熟衰老機制的研究和應(yīng)用，改善樹莓果實不耐貯藏的特性，對于樹莓產(chǎn)業(yè)的發(fā)展具有重要意義。然而傳統(tǒng)的電子克隆技術(shù)依賴大量EST序列進(jìn)行推測、組裝和拼接來獲得基因的電子序列[19]，所以對于EST資料不夠豐富的物種無能為力。與一些模式植物和其他薔薇科經(jīng)濟植物相比，樹莓的EST資料遠(yuǎn)遠(yuǎn)達(dá)不到傳統(tǒng)電子克隆技術(shù)的要求。本研究使用一種新的電子克隆方案，通過ACS家族蛋白質(zhì)保守結(jié)構(gòu)域與樹莓基因組比對獲得基因的電子序列，然后進(jìn)行基因組PCR驗證，最終獲得6條ACS基因，并對基因序列和其編碼蛋白的理化性質(zhì)、蛋白結(jié)構(gòu)、同源性等進(jìn)行預(yù)測和分析，為后續(xù)研究樹莓ACS基因家族成員的差異表達(dá)和樹莓果實成熟機制奠定基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1.1 試驗材料

樹莓植物材料為本實驗室組織培養(yǎng)保存，品種為‘托拉蜜’(Tulameen)。主要試劑有：植物DNA提取試劑盒(Magen，Guangzhou，China)，金牌Mix高保真PCR酶(Tsingke，Beijing，China)，膠回收試劑盒(Magen，Guangzhou，China)，pClone007克隆載體(Tsingke，Beijing，China)，DH5-α感受態(tài)細(xì)胞(Tsingke，Beijing，China)，質(zhì)?？焖偬崛≡噭┖?Magen，Guangzhou，China)。

1.2 試驗方法

1.2.1 樹莓ACS基因家族成員的電子克隆 以NCBI登錄的薔薇科ACS蛋白序列XP_004306735、XP_024176223、XP_021807957和XP_007219056與已知的擬南芥ACS蛋白家族序列[20]進(jìn)行比對，得到薔薇科ACS蛋白的7個保守結(jié)構(gòu)域序列，將之分別與GDR(Genome Database for Rosaceae)數(shù)據(jù)庫(https://www.rosaceae.org/)中樹莓基因組進(jìn)行tblastn比對，得到樹莓ACS基因家族成員的電子序列及其所在染色體的位置信息。

1.2.2 樹莓ACS基因家族成員的分子克隆及序列分析 根據(jù)所得電子序列使用Primer Premier 5.0軟件設(shè)計引物(表1)，由北京瑞博興科生物技術(shù)公司合成。取樹莓組培苗葉片200 mg使用植物DNA提取試劑盒提取基因組DNA，然后進(jìn)行PCR擴增，PCR體系為：金牌mix 45 μL，上游引物(10 μmol/L)2 μL，下游引物(10 μmol/L) 2 μL，模板(100 ng/μL) 1 μL。PCR條件為：98 ℃，2 min；98 ℃ 10 s，Tm (RiACS1-6分別為：54、55、57、52、57、56 ℃) 15 s，72 ℃，45 s，35個循環(huán)；72 ℃，5 min。PCR產(chǎn)物經(jīng)膠回收后連接到pClone007克隆載體并轉(zhuǎn)化大腸桿菌感受態(tài)細(xì)胞，經(jīng)過夜培養(yǎng)后挑取單克隆搖菌并進(jìn)行菌液PCR，使用PCR呈陽性的菌液提取質(zhì)粒，提取的質(zhì)粒送北京睿博興科生物技術(shù)有限公司測序。測序所得基因序列使用SnapGene軟件分析GC含量，使用Augustus程序(http://bioinf.uni-greifswald.de/augustus/)分析開放閱讀框(ORF，Open Reading Frame)和內(nèi)含子，并獲得CDS(Coding Sequences)序列和其所編碼的蛋白序列[21]，使用DNAMAN軟件比較基因序列和蛋白序列之間的相似性。

表1 樹莓ACS基因家族成員克隆引物Tab.1 Cloning primers of raspberry ACS family genes

1.2.3 樹莓ACS家族蛋白序列的生物信息學(xué)分析 使用ExpPASYProtParam程序(https://web.expasy.org/protparam/)分析蛋白的理化性質(zhì)[22]，使用SignalP 4.1 Server程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/SignalP/)進(jìn)行蛋白質(zhì)信號肽預(yù)測[23]，使用TMHMMServer 2.0程序(http://www.cbs.dtu.dk/services/TMHMM/)進(jìn)行蛋白跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測[24]，使用PSORT程序(http://psort1.hgc.jp/form.html)進(jìn)行蛋白亞細(xì)胞定位預(yù)測，使用SOPMA程序(https://npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl?page=npsa_sopma.html)進(jìn)行蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測[25]，使用SWISS-MODEL軟件(https://swissmodel.expasy.org/)進(jìn)行蛋白三維結(jié)構(gòu)同源建模[26]，使用DNAMAN軟件進(jìn)行蛋白多序列比對，使用MEGA 7.0軟件生成系統(tǒng)進(jìn)化樹[27]。

2 結(jié)果與分析

2.1 樹莓ACS家族成員的序列獲得及分析

由薔薇科ACS蛋白與擬南芥ACS蛋白序列比對，得到7個薔薇科蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列如下：IQMGLAEN、FQDY、FCLADPGDAFL、NPSNPLGT、YSLSKDMG、KMSSFGLVSSQTQ、PGWFRVCFA，將其分別與樹莓基因組進(jìn)行比對后得到6條樹莓ACS基因家族成員的電子序列，將其按照染色體順序命名。根據(jù)電子序列設(shè)計引物進(jìn)行基因組PCR(圖1)，將PCR膠回收產(chǎn)物連接克隆載體測序，得到樹莓ACS家族成員的基因序列。所得基因序列已上傳至NCBI數(shù)據(jù)庫，序列號為 MK388675、

注：M. Marker；1. RiACS5；2. RiACS4；3. RiACS1；4. RiACS6；5. RiACS2；6. RiACS3。Note: M. Marker；1. RiACS5；2. RiACS4；3. RiACS1；4. RiACS6；5. RiACS2；6. RiACS3.圖1 樹莓ACS基因家族成員PCR擴增Fig.1 PCR amplification of raspberry ACS family genes

MK388676、MK388677、MK388678、MK388679、MK388680。對其進(jìn)行序列分析(表2)發(fā)現(xiàn)，RiACS1-6的GC含量均小于50%，與全基因組GC含量吻合[28]，ORF長度在1 657～2 432 bp之間，除了RiACS1和RiACS2外其余均包含部分5′非翻譯區(qū)和3′非翻譯區(qū)序列，RiACS1含有2個內(nèi)含子而其余均含有3個內(nèi)含子，內(nèi)含子的長度不等，最短的僅85 bp而最長的達(dá)713 bp，去除內(nèi)含子后得到的CDS序列長度在1 392～1 608 bp之間。

表2 樹莓ACS基因家族成員序列分析Tab.2 Sequence analysis of raspberry ACS family genes

使用DNAMAN軟件對所得的基因序列和翻譯而成的蛋白序列進(jìn)行比對，結(jié)果顯示樹莓ACS家族成員之間基因序列相似性為39%～70%，蛋白序列相似性為29%～68%，這一結(jié)果與擬南芥中的研究結(jié)果一致[20]，說明ACS家族成員的序列之間具有較大的差異性。

2.2 樹莓ACS家族蛋白理化性質(zhì)分析

ExpPASYProtParam的蛋白理化性質(zhì)分析結(jié)果表明，RiACS1-6的理論等電點集中在6.05～8.95；RiACS3和RiACS6正電荷殘基數(shù)小于負(fù)電荷殘基數(shù)，整體帶負(fù)電，其余整體帶正電；RiACS1-6不穩(wěn)定系數(shù)均大于40，可能不穩(wěn)定，總平均疏水性均小于0，可能是親水性蛋白[22]。

2.3 樹莓ACS家族蛋白信號肽、跨膜結(jié)構(gòu)及亞細(xì)胞定位預(yù)測

SignalP的信號肽預(yù)測結(jié)果顯示樹莓ACS家族蛋白均不含有信號肽，為非分泌蛋白。TMHMMServer的跨膜結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示RiACS4在第33—57個氨基酸位置具有一個跨膜結(jié)構(gòu)域，預(yù)測其為跨膜蛋白，其余蛋白都不含跨膜結(jié)構(gòu)域，為非跨膜蛋白，但RiACS6有部分氨基酸在膜內(nèi)。PSORT的亞細(xì)胞定位預(yù)測結(jié)果表明RiACS1定位于細(xì)胞核的概率最大，為76.0%，RiACS2定位于細(xì)胞核的概率最大，為88.0%，RiACS3定位于細(xì)胞核的概率最大，為60.0%，RiACS4定位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的概率最大，為60.0%，RiACS5定位于細(xì)胞質(zhì)的概率最大，為65.0%，RiACS6定位于高爾基體的概率最大，為90.0%。

2.4 樹莓ACS家族蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測

SOPMA的蛋白二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果(表3)表明樹莓ACS家族蛋白的二級結(jié)構(gòu)以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，分別占到36.26%～43.25%和33.76%～39.63%，各蛋白成員之間二級結(jié)構(gòu)組成區(qū)別不是很大。

表3 樹莓ACS家族蛋白的二級結(jié)構(gòu)預(yù)測Tab.3 Secondary structure prediction of raspberry ACS family proteins

2.5 樹莓ACS家族蛋白三級結(jié)構(gòu)預(yù)測

將樹莓ACS家族蛋白輸入SWISS-MODEL在線建模程序，以自動匹配模板方式進(jìn)行同源建模，結(jié)果顯示自動匹配到的模板均為ACS蛋白，GMQE值均在0.6～1.0之間，QMEAN值均大于0，覆蓋度均較高，說明建模結(jié)果較為可靠。ACS蛋白以同源二聚體或異源二聚體的形式行使蛋白功能[29]，建模結(jié)果預(yù)測RiACS1-6蛋白均以同源二聚體的形式存在，符合預(yù)期。由三維結(jié)構(gòu)圖(圖2)可以看出，RiACS1-6蛋白均以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，與二級結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果一致；RiACS1、RiACS2、RiACS4、RiACS6三級結(jié)構(gòu)相近，而RiACS3和RiACS5三級結(jié)構(gòu)相近。

注：A-F RiACS1-6三維結(jié)構(gòu)預(yù)測。Note: A-F three-dimensional structure prediction of RiACS1-6.圖2 樹莓ACS家族蛋白的三維構(gòu)預(yù)測Fig.2 Three-dimession prediction of raspberry ACS family proteins

2.6 樹莓ACS家族蛋白同源性分析及進(jìn)化樹構(gòu)建

使用NCBI的blastp工具對樹莓ACS家族蛋白進(jìn)行同源性分析，發(fā)現(xiàn)其與其他薔薇科植物的ACS蛋白序列均具有較高的相似性，其中與月季ACS蛋白序列相似性最高，RiACS1與月季ACS3序列相似性為91%，RiACS2與月季ACS1序列相似性為92%，RiACS5與月季ACS2序列相似性為89%。使用DNAMAN軟件對樹莓ACS家族蛋白和月季ACS家族蛋白進(jìn)行多序列比對發(fā)現(xiàn)，RiACS1-6均含有ACS蛋白典型的7個保守結(jié)構(gòu)域，而RiACS4和RiACS6在第6個結(jié)構(gòu)域處與其他蛋白成員差異較大，這一結(jié)果與擬南芥中ACS10和ACS12的特點類似[20](圖3)。

將樹莓ACS家族蛋白序列和擬南芥ACS家族蛋白序列導(dǎo)入MEGA軟件，進(jìn)行Clustalw 比對后使用鄰接法(NJ)生成系統(tǒng)進(jìn)化樹，bootstrap值設(shè)為1000(圖4)。擬南芥ACS家族蛋白根據(jù)C末端序列差異可以分為三個類型：Type I是ACS1、ACS2和ACS6；Type II是ACS4、ACS5、ACS8和ACS9；Type III是ACS7、ACS11，此外AtACS10和AtACS12執(zhí)行氨基轉(zhuǎn)移酶功能[12,20,30-31]。從進(jìn)化樹可以看出，樹莓ACS家族蛋白可分為3組，RiACS3、RiACS5與AtACS1、AtACS2、AtACS6聚集于同一分支，可能是Type Ⅰ型ACS蛋白；RiACS1、RiACS2與AtACS4、AtACS5、AtACS8、AtACS9聚集于同一分支，可能是Type Ⅱ型ACS蛋白；RiACS4、RiACS6與AtACS10、AtACS12聚集于同一分支，可能執(zhí)行氨基轉(zhuǎn)移酶功能。

圖3 樹莓ACS家族蛋白與月季ACS蛋白多序列比對Fig.3 Multiple sequence alignment of raspberry ACS family proteins with rose ACS protein

圖4 樹莓ACS家族蛋白進(jìn)化分析Fig.4 Phylogenetic analysis of raspberry ACS family proteins

3 討 論

樹莓是一種廣受歡迎的新興水果，具有較高的營養(yǎng)價值和經(jīng)濟價值，然而樹莓果實極不耐貯存的特點阻礙了樹莓產(chǎn)業(yè)的快速發(fā)展。乙烯在植物生長發(fā)育過程中起重要調(diào)控作用，根據(jù)成熟衰老過程乙烯釋放和呼吸強度變化的不同，果實可分為躍變型和非躍變型兩類，樹莓果實屬于非躍變型。20世紀(jì)乙烯被認(rèn)為在非躍變型果實成熟衰老中發(fā)揮的作用非常有限，然而近年來越來越多的研究結(jié)果表明，非躍變型果實的成熟衰老過程也受乙烯調(diào)控[32-34]。目前有研究表明乙烯參與樹莓果實成熟進(jìn)程[35]，然而其分子機理仍不清楚。乙烯合成的關(guān)鍵酶是ACS，因此，進(jìn)行樹莓ACS基因的克隆和分析有助于推進(jìn)樹莓果實成熟機制的研究，為改善樹莓果實不耐貯存的特性提供理論基礎(chǔ)。

隨著基因組計劃的進(jìn)行，越來越多的物種完成了全基因組測序。與此同時，其中很多物種的EST資料卻沒有大規(guī)模的增長。傳統(tǒng)的電子克隆利用EST數(shù)據(jù)庫來獲取電子序列，在EST資料不夠豐富的物種中無法應(yīng)用。本試驗使用蛋白保守結(jié)構(gòu)域序列與基因組數(shù)據(jù)庫比對的方法進(jìn)行電子克隆，避開EST數(shù)據(jù)庫的限制。試驗結(jié)果獲得6個樹莓ACS家族成員的基因序列和其蛋白序列，并進(jìn)行生物信息學(xué)分析。值得一提的是，在電子克隆過程中，發(fā)現(xiàn)推測的第7條ACS基因(數(shù)據(jù)未顯示)，其特點是基因分為前后兩段，兩段分別比對都具有ACS基因特征。在基因兩端設(shè)計特異性引物以基因組DNA為模板進(jìn)行PCR擴增，得到1條長度遠(yuǎn)小于原本電子序列的基因片段，使用Augustus程序進(jìn)行內(nèi)含子分析發(fā)現(xiàn)其不含內(nèi)含子，翻譯后的蛋白序列經(jīng)同源性分析屬于ACS蛋白片段。由此可以推測樹莓中存在第7條ACS基因，其電子序列由前后兩段ACS基因構(gòu)成的特點有可能是測序錯誤導(dǎo)致的。一般意義上的基因全長是指包含5′非翻譯區(qū)、ORF和3′非翻譯區(qū)的cDNA序列，現(xiàn)在的生物信息學(xué)手段無法通過基因組序列準(zhǔn)確預(yù)測mRNA的5′非翻譯區(qū)和3′非翻譯區(qū)序列，所以雖然從基因組克隆到RiACS3、RiACS4、RiACS5、RiACS6的ORF區(qū)兩端非翻譯區(qū)序列，但仍無法確定其是否為基因全長，后續(xù)試驗可以借助RT-PCR技術(shù)和RACE(rapid-amplification of cDNA ends)技術(shù)來獲取包括第7條ACS基因在內(nèi)的樹莓ACS多基因家族成員的cDNA全長序列。

對本試驗獲得的樹莓ACS家族基因序列和蛋白序列進(jìn)行相似性比較，發(fā)現(xiàn)其成員之間具有較大的序列差異性。此外，盡管屬于同家族基因，但其成員之間內(nèi)含子數(shù)目和長度都不盡相同，其中RiACS1包含2個較短的內(nèi)含子，RiACS3和RiACS5則含有兩短一長的3個內(nèi)含子，而RiACS4和RiACS6含有短-長-短3個內(nèi)含子，這一發(fā)現(xiàn)也從側(cè)面證明ACS多基因家族成員之間的序列差異性。樹莓ACS家族蛋白的生物信息學(xué)預(yù)測和分析表明其均為不穩(wěn)定的親水性蛋白，均不含信號肽。RiACS1、RiACS2和RiACS3可能是位于細(xì)胞核的非跨膜蛋白，RiACS4可能是位于內(nèi)質(zhì)網(wǎng)膜的跨膜蛋白，RiACS5可能是位于細(xì)胞質(zhì)的非跨膜蛋白，RiACS6可能是位于高爾基體的非跨膜蛋白。一般定位于內(nèi)膜系統(tǒng)的蛋白和跨膜蛋白均含有信號肽，但RiACS4和RiACS6的預(yù)測結(jié)果卻不含信號肽，可能是由于信號肽或亞細(xì)胞定位預(yù)測軟件結(jié)果不準(zhǔn)確導(dǎo)致的。RiACS1-6的二級結(jié)構(gòu)較為相似，均以α-螺旋和無規(guī)則卷曲為主，三級結(jié)構(gòu)均以同源二聚體形式存在，分為RiACS3、RiACS5和RiACS1、RiACS2、RiACS4、RiACS6兩組。它們均含有7個ACS蛋白保守結(jié)構(gòu)域，但RiACS4和RiACS6在第6個結(jié)構(gòu)域處與其他蛋白有所差異，并且在系統(tǒng)進(jìn)化樹中，RiACS4和RiACS6與擬南芥ACS10、ACS12聚集于同一分支，而擬南芥ACS10、ACS12是氨基轉(zhuǎn)移酶，所以推測RiACS4和RiACS6有可能是氨基轉(zhuǎn)移酶的一種而不是ACS。

研究表明，植物ACS基因的表達(dá)具有組織、器官特異性，時空特異性，且受外界環(huán)境的影響[36]。本試驗克隆到樹莓6條ACS基因家族成員，后續(xù)可以開展RT-qPCR等試驗來研究不同ACS基因家族成員在樹莓中的表達(dá)差異性，找到在樹莓果實成熟過程中特異性表達(dá)的ACS基因，為進(jìn)一步研究樹莓果實成熟機制奠定基礎(chǔ)。