代麗珍，郭家洛，馮玉環(huán)，王 龍，郝少東，郭 力，楊寶東，任爭(zhēng)光，王進(jìn)忠

(北京農(nóng)學(xué)院植物科學(xué)技術(shù)學(xué)院/農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室,北京 102206)

植原體(Phytoplasma)原稱為類菌原體(Mycoplasma-Like Organism，簡(jiǎn)稱MLO)，無細(xì)胞壁，可寄生于昆蟲體內(nèi)和植物的韌皮部。取食韌皮部的昆蟲有可能感染并傳播植原體。然而，在取食寄主植物韌皮部昆蟲類群中，只有少部分種類確定是植原體介體昆蟲，目前主要分三組：第一組是所有已知介體種類最多的葉蟬科昆蟲；第二組為蠟蟬次目4個(gè)科昆蟲；最小一組是木虱科2個(gè)屬昆蟲[1]。在葉蟬科昆蟲中，已有很多種類被確認(rèn)為植原體介體昆蟲[2]。如條沙葉蟬(PsammotettixstriatusLinnaeus)為小麥藍(lán)矮病植原體的介體昆蟲，可將該植原體傳播給翠菊、長(zhǎng)春花、番茄等多種植物[3-4]。黑面葉蟬(Graminellanigrifrons)可同時(shí)將CandidatusPhytoplasma asteris和CandidatusPhytoplasma fraxini這2種植原體傳播給桃、杏、李子和梨等果樹[5]。另外，Euscelidiusvariegatus和Macrostelesquadripunctulatus這2種葉蟬可獲取并傳播菊花黃化植原體[6]。尖鼻葉蟬(ScaphytopiusmagdalensisProvancher)是傳播藍(lán)莓矮化植原體的介體昆蟲[7]。新東方葉蟬(Orientusishidae)被確定為傳播葡萄金黃植原體Flavescence dorée的潛在介體[8]。

棗瘋病(Jujube witches’-broom disease JWB)又稱棗樹叢枝病，是一種危害嚴(yán)重的檢疫性病害，具有較強(qiáng)的侵染性和流行性，在中國棗產(chǎn)區(qū)普遍發(fā)生[9]。近年來該病害在北京地區(qū)流行并對(duì)古棗樹形成嚴(yán)重威脅，已對(duì)北京密云金絲小棗造成毀滅性的破壞[10]。棗瘋病由寄生于棗樹韌皮部的植原體引起[11-12]。凹緣菱紋葉蟬(HishimonussellatusUhler)是中國棗瘋病、桑矮縮病的重要介體昆蟲和傳染源[13-14]。盡管過去許多學(xué)者對(duì)棗瘋病的病原生物學(xué)和防治進(jìn)行大量探索[15-20]，但是目前對(duì)棗瘋病植原體介體昆蟲研究，特別是潛在介體葉蟬種類報(bào)道甚少。

介體昆蟲攜帶植物病原體的流行直接依賴于其介體種類及生態(tài)策略，例如其休眠時(shí)間，寄主特異性，攝食偏好性及其擴(kuò)散能力等[1]。然而，解決任何媒介傳播病害流行病學(xué)循環(huán)的基礎(chǔ)是對(duì)介體種類的準(zhǔn)確鑒定和檢測(cè)[21]。多年來，一些學(xué)者認(rèn)為中華擬菱紋葉蟬(H.chinensisAnufriev)和凹緣菱紋葉蟬(H.sellatus)是棗瘋病的主要介體昆蟲[14,22]。然而Hao等發(fā)現(xiàn)北京地區(qū)棗園菱紋葉蟬種群實(shí)際上是凹緣菱紋葉蟬(H.sellatus)和片突菱紋葉蟬(HishimonuslamellatusCai et Kuoh)的混合種群，二者僅從外部形態(tài)上難于區(qū)別[23]，所以弄清北京地區(qū)棗園葉蟬種類和類群，篩查感染植原體的種類，明確與棗瘋病流行相關(guān)的介體昆蟲種類，對(duì)于探索預(yù)防棗瘋病流行危害具有重要的實(shí)踐意義。

本研究目的是篩查北京地區(qū)棗園感染瘋病植原體葉蟬種類，確定棗瘋病植原體的潛在葉蟬介體，為預(yù)防和控制棗瘋病流行提供科學(xué)依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 研究地點(diǎn)

昆蟲標(biāo)本采集地點(diǎn)位于北京地區(qū)的昌平區(qū)流村鎮(zhèn)流村、海淀區(qū)西北旺鎮(zhèn)唐家?guī)X村、朝陽區(qū)奧林匹克森林公園、通州區(qū)永于路北京觀光南瓜園。

1.2 標(biāo)本采集

2016年9月中旬至2018年11月底期間在采集地點(diǎn)，使用20 cm×25 cm雙面黃色粘蟲板(北京格瑞碧源科技有限公司)進(jìn)行葉蟬誘集取樣。粘蟲板被放置樹冠處(地上1.5 m)。同時(shí)，在已發(fā)生棗瘋病癥狀的棗樹上，采用掃網(wǎng)法，每次掃網(wǎng)10余次，收集葉蟬科昆蟲。

1.3 種類鑒定

形態(tài)鑒定，對(duì)昆蟲標(biāo)本進(jìn)行分類，保留葉蟬。從黃色粘蟲板上取出葉蟬，用甲苯處理5 min，然后用無水乙醇處理5 min，以確保葉蟬中水分完全去除。將樣本保存在75%乙醇中直至鑒定。根據(jù)楊茂發(fā)等的《中國動(dòng)物志 昆蟲綱 第六十七卷》、崔俊芝等的《中國昆蟲模式標(biāo)本名錄 第2卷》、葛鐘麟的《中國經(jīng)濟(jì)昆蟲志 第十冊(cè)》、虞國躍等的《王家園昆蟲》對(duì)屬或物種水平進(jìn)行鑒定。其中，菱紋葉蟬種類鑒定采用雄性外生殖器解剖和分子鑒定相結(jié)合方法，采用本實(shí)驗(yàn)室已建立的多重PCR法區(qū)分棗園2種菱紋葉蟬[23]。

1.4 葉蟬感染棗瘋病植原體檢測(cè)

1.4.1 試劑及儀器 DNA Marker(DL2000)，購自寶生物工程(大連)公司；2×Taq MasterMix(Dye)購自北京康為世紀(jì)生物科技有限公司；微量標(biāo)本基因組提取試劑盒購自天根生化科技(北京)有限公司；引物委托生工生物工程(上海)有限責(zé)任公司合成；TE buffer購自北京索萊寶科技有限公司；其他生化試劑均為國產(chǎn)分析純；手持研磨器購于金銀杏生物科技(北京)有限公司，YLE-1000恒溫水浴鍋，Eppendorf Centrifuge 5417R離心機(jī)，DYY-8C型電泳儀(北京市六一儀器廠)，SN-Lab Transiluminator SN-NJ0601凝膠成像紫外分析儀(北京信諾萊伯儀器有限公司)，G-Storm 自動(dòng)熱循環(huán)儀(GRI公司)。

1.4.2 從昆蟲中提取DNA 取單頭葉蟬，放在加有適量液氮的1.5 mL 離心管中，用無菌研磨棒磨成粉末，按微量標(biāo)本基因組提取試劑盒說明書步驟進(jìn)行基因組DNA提取，用30 μL TE buffer融解DNA[24]。

1.4.3 PCR擴(kuò)增 使用植原體通用引物，P1(5′-AAGAGTTTCCTGGCTCAGGATT-3′)/P7(5′-CGTCCTTCATCGGCTCTT-3′)。在10 μL 2×Taq PCR Master Mix、0.6 μL每種引物(正向和反向)、7.8 μL ddH2O和1 μL模板DNA的20 μL反應(yīng)體系中進(jìn)行PCR擴(kuò)增。PCR反應(yīng)在G-Storm中進(jìn)行。95 ℃預(yù)變性5 min，35個(gè)循環(huán)(94 ℃變性30 s，52 ℃退火30 s，72 ℃延伸160 s)，最后延伸步驟72 ℃10 min。通過在1%瓊脂糖凝膠中電泳分離PCR產(chǎn)物，并用溴化乙錠染色[25-26]。

2 結(jié)果與分析

2.1 棗園內(nèi)葉蟬種類分析

在2016年9月中旬至2018年11月期間，共收集999頭葉蟬，其中826頭已進(jìn)行分類。收集的葉蟬屬于6個(gè)亞科13個(gè)種，見表1。

海淀區(qū)西北旺鎮(zhèn)唐家?guī)X村以及昌平區(qū)流村鎮(zhèn)流村葉蟬種類中，分布如下：殃葉蟬亞科Euscelinae的片突菱紋葉蟬(HishimonuslamellatusCai et Kuoh)、凹緣菱紋葉蟬(H.sellatus)、一點(diǎn)木葉蟬(PhlogotettixcyclopsMulsant et Rey)、橫帶葉蟬(ScaphoideusfestivusMatsumura)，大葉蟬亞科Tettigellini的大青葉蟬(CicadellaviridisLinnaeus)和白邊大葉蟬(KollapaululaWalker)，小葉蟬亞科Typhlocybinae的小綠葉蟬(Empoascaspp.)、斑葉蟬(Erythroneurasp.)和紅閃小葉蟬(Zyginasp.)，葉蟬亞科Iassinae的新縣長(zhǎng)突葉蟬(BatracomorphusxinxianensisCai et Shen)，角頂葉蟬亞科Deltocephalinae的條沙葉蟬(P.striatusLinnaeus)，耳葉蟬亞科Ledrinae(Scarinae)的窗耳葉蟬(LedraaudituraWalker)。

片突菱紋葉蟬(H.lamellatus)，凹緣菱紋葉蟬(H.sellatus)在4個(gè)調(diào)查地點(diǎn)均有分布。海淀區(qū)西北旺唐家?guī)X村收集的菱紋葉蟬中，凹緣菱紋葉蟬(H.sellatus)的數(shù)量明顯多于片突菱紋葉蟬(H.lamellatus)，而朝陽區(qū)奧林匹克森林公園收集的菱紋葉蟬情況則與之相反，片突菱紋葉蟬(H.lamellatus)數(shù)量明顯多于凹緣菱紋葉蟬(H.sellatus)。

小綠葉蟬(Empoascaspp.)數(shù)量最多，其次是片突菱紋葉蟬(H.lamellatus)和凹緣菱紋葉蟬(H.sellatus)。橫帶葉蟬(S.festivus)和一點(diǎn)木葉蟬(P.cyclops)則相對(duì)較少。大青葉蟬(C.viridis)在海淀區(qū)西北旺鎮(zhèn)唐家?guī)X及昌平區(qū)流村鎮(zhèn)流村均有分布，且昆蟲數(shù)量高于白邊大葉蟬(K.paulula)。

葉蟬亞科Iassinae的新縣長(zhǎng)突葉蟬(B.xinxianensis)則只在昌平區(qū)流村鎮(zhèn)流村被誘集到。角頂葉蟬亞科Deltocephalinae的條沙葉蟬(P.striatus)雖然數(shù)量較少，但在海淀區(qū)西北旺鎮(zhèn)唐家?guī)X及昌平區(qū)流村鎮(zhèn)流村均有分布。耳葉蟬亞科Ledrinae(Scarinae)的窗耳葉蟬(L.auditura)則只在海淀區(qū)西北旺鎮(zhèn)唐家?guī)X村經(jīng)掃網(wǎng)收集到1頭

2.2 PCR檢測(cè)葉蟬體內(nèi)的棗瘋病植原體

在對(duì)棗瘋病植原體的調(diào)查中，誘集并鑒定12個(gè)葉蟬屬(表2)。使用通用植原體引物對(duì)P1/P7進(jìn)行PCR分析，擴(kuò)增子約為1 800 bp大小。在2個(gè)亞科的3個(gè)屬的標(biāo)本DNA提取物中檢測(cè)到與陽性樣品相同大小的產(chǎn)物。

菱紋葉蟬屬Hishimonus的2個(gè)物種均存在感染棗瘋病植原體的情況。共檢測(cè)71頭片突菱紋葉蟬(H.lamellatus)，其中1頭PCR檢測(cè)呈陽性(圖A-7)，感染率為1.4%(表2)。在檢測(cè)的132頭凹緣菱紋葉蟬(H.sellatus)中，4頭呈陽性(圖A-10)，其感染率為3.0%(表2)。

表1 北京地區(qū)4個(gè)調(diào)查地點(diǎn)收集的葉蟬種類Tab.1 Leafhopper species collected at four survey sites in Beijing

注：部分標(biāo)本不完整，無法辨別雌雄。

Note： Some specimens are incomplete and cannot be distinguished from males and females.

表2 葉蟬感染棗瘋病植原體PCR檢測(cè)結(jié)果Tab.2 PCR detection of the Leafhoppers infected with jujube witches’-broom phytoplasma

共檢測(cè)大葉蟬屬Cicadella的大青葉蟬(C.viridis)(圖B-11)27頭，2頭標(biāo)本呈陽性，其感染率為7.4%(表2)。檢測(cè)邊大葉蟬屬Kolla的白邊大葉蟬(K.paulula) 12頭，其中1頭標(biāo)本呈陽性，感染率為8.3%(表2)。

注：(A)M，2 000 bp Marker，1-6凹緣菱紋葉蟬(H. sellatus)，7-10片突菱紋葉蟬(H. lamellatus)，11陰性對(duì)照，12陽性對(duì)照，1 800 bp棗瘋病植原體的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶；(B)M，2 000 bp Marker，1-5小綠葉蟬(Empoasca spp.)，6-7橫帶葉蟬(S. festivus)，8-10桃一點(diǎn)葉蟬(S. shinshana)，11大青葉蟬(C. viridis)，1 800 bp棗瘋病植原體的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶；(C)M，2 000 bp Marker，1-2紅閃小葉蟬(Zygina sp.)，3大青葉蟬(C. viridis)，4-6小綠葉蟬(Empoasca spp.)7-10白邊大葉蟬(K. paulula)，11陰性對(duì)照，12是陽性對(duì)照，1 800 bp棗瘋病植原體的擴(kuò)增產(chǎn)物條帶。Note:(A)M, 2 000 bp Marker, 1-6 H. sellatus, 7-10 H. lamellatus, 11 Negative control, 12 Positive control, amplicon of Phytoplasma of jujube (1 800 bp); (B)M, 2 000 bp Marker, 1-5 Empoasca spp., 6-7 S. festivus, 8-10 S. shinshana, 11 C. viridis, amplicon of Phytoplasma of jujube (1 800 bp); (C)M, 2 000 bp Marker, 1-2 Zygina sp., 3 C. viridis, 4-6 Empoasca spp., 7-10 K. paulula, 11 Negative control, 12 Positive control, amplicon of Phytoplasma of jujube (1 800 bp).圖1 幾種葉蟬DNA聚合酶鏈?zhǔn)椒磻?yīng)擴(kuò)增的瓊脂糖凝膠(1%)電泳Fig.1 Agarose gel electrophoresis (1%) of PCR products obtained from DNA extracts of several leafhopper species

3 討 論

對(duì)2016年9月中旬至2018年11月期間北京地區(qū)棗園中采集的葉蟬進(jìn)行鑒定和感染棗瘋病植原體的葉蟬進(jìn)行篩選，初步明確北京地區(qū)棗園棗瘋病植原體潛在介體葉蟬種類；在調(diào)查的4個(gè)地點(diǎn)中均有凹緣菱紋葉蟬(H.sellatus)及片突菱紋葉蟬(H.lamellatus)發(fā)生。這些結(jié)果與郝少東等[24]發(fā)現(xiàn)在北京地區(qū)棗園內(nèi)凹緣菱紋葉蟬(H.sellatus)及片突菱紋葉蟬(H.lamellatus)混同發(fā)生，且在兩者體內(nèi)已檢測(cè)出植原體結(jié)果相一致。一些學(xué)者認(rèn)為凹緣菱紋葉蟬(H.sellatus)是棗瘋病植原體的介體昆蟲[14]，但未對(duì)菱紋葉蟬種類和植原體進(jìn)行分子鑒定和檢測(cè)，本試驗(yàn)對(duì)采集的菱紋葉蟬成蟲逐一進(jìn)行PCR鑒定和雄性外生殖器確定，對(duì)每一葉蟬個(gè)體感染的植原體分別進(jìn)行分子檢測(cè)，明確棗園混合發(fā)生近緣物種菱紋葉蟬自然感染率，為進(jìn)一步確認(rèn)其傳播棗瘋病奠定基礎(chǔ)。

據(jù)報(bào)道，大青葉蟬(C.viridis)可傳播導(dǎo)致歐洲石果黃化病的歐洲石果黃化病植原體European stone fruit yellows，白邊大葉蟬(K.paulula)可傳播葡萄皮爾斯病(Pierce's disease)[25-27]。白邊大葉蟬(K.paulula)及黑尾大葉蟬(BothrogoniaferrugineaF.)已證明是葡萄黃化病和皮爾斯病的介體昆蟲[28]。本研究表明，大青葉蟬(C.viridis)和白邊大葉蟬 (K.paulula)均被檢測(cè)為陽性，是棗瘋病植原體的自然攜帶者，說明2種葉蟬可能為棗瘋病植原體潛在介體昆蟲，是否能傳播棗瘋病需要進(jìn)一步試驗(yàn)證明。

據(jù)報(bào)道，其他刺吸類昆蟲也發(fā)現(xiàn)是植原體的介體昆蟲。如馬鈴薯木虱(Bactericeracockerelli)是CandidatusLiberibacter solanacearum的介體昆蟲，可將其傳播到茄科植物如馬鈴薯、番茄、茄子中，導(dǎo)致馬鈴薯毀滅性斑馬片病害[29]。胡蘿卜木虱(BactericeratrigonicaHodkinson)可將葡萄黃化植原體傳播給胡蘿卜[30]。另外，梨木虱(Cacopsyllapyri)通過傳播梨衰退植原體引起梨樹衰退病[31]。另一木虱Cacopsyllapyricola被確定為桃黃化卷葉病植原體介體昆蟲[32]。FieberiellafloriiSt?l被證明為蘋果叢生植原體(CandidatusPhytoplasma mali)的介體昆蟲[33]。棗瘋病植原體的介體昆蟲是否存在其他潛在半翅目昆蟲還有待研究證實(shí)。

植原體的分化和分類依賴于保守基因的分子分析，特別是16S rRNA[34-35]。核糖體RNA操縱子成為測(cè)序的優(yōu)選靶標(biāo)[34,36]。聚合酶鏈反應(yīng)(PCR)為植原體檢測(cè)提供靈敏的工具[37-38]。雖然昆蟲物種中植原體的檢測(cè)不能證明兩者是否為媒介關(guān)系，但該技術(shù)可用于縮小對(duì)許多分類群中潛在介體葉蟬的搜索范圍。

4 結(jié) 論

北京地區(qū)棗園棗樹存在片突菱紋葉蟬(H.lamellatus)與凹緣菱紋葉蟬(H.sellatus)混同發(fā)生的情況，且在2種葉蟬體內(nèi)檢測(cè)到棗瘋病植原體，凹緣菱紋葉蟬(H.sellatus)、片突菱紋葉蟬(H.lamellatus)可能為潛在的棗瘋病植原體介體。

值得注意的是，經(jīng)PCR檢測(cè)本研究首次發(fā)現(xiàn)大青葉蟬(C.viridis)與白邊大葉蟬(K.paulula)呈陽性，很有可能是棗瘋病植原體潛在的介體葉蟬。其他葉蟬經(jīng)檢測(cè)未發(fā)現(xiàn)感染植原體。

致謝

感謝蔡平教授、戴武教授、戴仁懷教授鑒定葉蟬物種方面所做的工作。感謝農(nóng)業(yè)應(yīng)用新技術(shù)北京市重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室張卿、楊瑞和楊柳對(duì)顯微照相的幫助。