陳建國，李周勇，李桂花，周曉娟，桑躍，俞偉祖

（1.內(nèi)蒙古蒙牛乳業(yè)（集團）股份有限公司，呼和浩特 011500；2.中國農(nóng)業(yè)大學(xué)食品科學(xué)與營養(yǎng)工程學(xué)院，北京 100083；3.河北省畜產(chǎn)食品技術(shù)創(chuàng)新中心，廊坊 065201）

隨著飲食結(jié)構(gòu)的改變及精神和社會壓力的增大，便秘已成為困擾現(xiàn)代人健康的主要問題之一，嚴重影響著人們的生活質(zhì)量。最近的調(diào)查顯示，在亞洲，便秘的發(fā)病率為9.6%，在歐美國家，便秘的發(fā)病率為8.1%[1]。在我國，便秘的發(fā)病率為5%～16%[2,3]。便秘的原因大多數(shù)為飲食不正常，通過改變飲食結(jié)構(gòu)來緩解便秘是一種安全又有效的方法。

研究表明，通過口服活的益生菌，對腸道菌群結(jié)構(gòu)進行平衡和調(diào)節(jié)，可帶來顯著的通便效果，這已成為近年來健康治療功能性便秘大量采用的方法[4,5]。但是對于熱滅活的益生菌是否也能緩解便秘，國內(nèi)外文獻還鮮有報道。Takii等[6]研究了泡菜中活的和死的植物乳桿菌對于便秘人群的作用，結(jié)果表明兩種菌都可以緩解便秘。Katayama等[7]研究表明，熱滅活的副干酪乳桿菌可以緩解人群的便秘。益生菌緩解人群的便秘具有一定的菌株特異性，副干酪乳桿菌Lc19 (Lactobacillus para casei Lc19)是一株從長壽老人糞便中分離得到的益生菌株。本研究的目的是通過建立便秘小鼠模型評價活的與熱滅活的副干酪乳桿菌Lc19的潤腸通便功能，為益生菌乳飲料的開發(fā)和利用提供理論依據(jù)。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

BALB/c雄性小鼠，6～8周齡，體重18～22g，SPF級，購自北京維通利華實驗動物技術(shù)有限公司。副干酪乳桿菌Lc19，由蒙牛乳業(yè)集團基礎(chǔ)科學(xué)部菌種中心提供。

復(fù)方地芬諾酯片（批號1109026），為常州康普藥業(yè)有限公司產(chǎn)品；活性炭粉，為鞏義市嵩山濾材活性炭廠產(chǎn)品；阿拉伯樹膠，為廣東汕頭市西隴化工廠產(chǎn)品；MRS培養(yǎng)基，為北京奧博星生物技術(shù)有限公司產(chǎn)品。

1.2 儀器與設(shè)備

SW-CJ醫(yī)用型潔凈工作臺（蘇州安泰空氣技術(shù)有限公司）；ZDX35BI高壓滅菌鍋（上海申安醫(yī)療器械廠）；DNP9082恒溫培養(yǎng)箱、DHG-9076A電熱恒溫鼓風干燥箱（上海精宏實驗設(shè)備有限公司）；3K30型低溫高速離心機、ACCULAB分析天平（德國Satorious公司）。

1.3 方法

1.3.1 溶液的配制

活菌菌懸液的配制：將副干酪乳桿菌Lc19菌株用MRS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12h，4500r/min離心15min，菌體沉淀重懸于MRS液體培養(yǎng)基中，用生理鹽水配制不同濃度的菌懸液。

熱滅活Lc19菌懸液的配制：將副干酪乳桿菌Lc19用MRS液體培養(yǎng)基37℃培養(yǎng)12h，121℃、15min滅菌，然后4500r/min離心15min，菌體沉淀重懸于MRS液體培養(yǎng)基中，用生理鹽水配制不同濃度的菌懸液。

墨汁的配制：準確稱取阿拉伯樹膠100g，加水800mL，煮沸至溶液透明，稱取活性碳 (粉狀) 50g加至上述溶液中煮沸3次，待溶液冷卻后加水定容到1000mL，于冰箱中4℃保存，用前搖勻。

復(fù)方地芬諾酯混懸液(0.05 g/100 m L及0.025g/100mL)的配制：分別取復(fù)方地芬諾酯片（每片含復(fù)方地芬諾酯2.5mg）20片、10片，用研缽研碎呈粉末后加水至50mL。臨用前配制。

1.3.2 實驗動物分組及處理

實驗小鼠分為死菌組、活菌組、空白組和模型組。死菌與活菌組分別設(shè)置高低兩個劑量組，分別灌胃4×109、4×1010CFU/mL的Lc19菌懸液0.1mL/（kg·d）（以體重計，下同），空白組和模型組小鼠灌胃質(zhì)量分數(shù)為9%的生理鹽水0.1mL/（kg·d）；每天一次，實驗期間自由進食，記錄各組小鼠體重變化。

1.3.3 小鼠排便實驗

給受試樣品7d后，各組小鼠禁食不禁水16h。模型組、死菌組與活菌組小鼠灌胃給予復(fù)方地芬諾酯（10mg/kg），空白組給予生理鹽水。8×109、8×1010CFU/mL的Lc19死菌的菌懸液和8×109、8×1010CFU/mL的Lc19活菌的菌懸液，均與墨汁等體積混合，給予復(fù)方地芬諾酯0.5h后，空白組和模型組小鼠灌胃墨汁0.1mL/kg，益生菌Lc19活菌組與死菌組給予含受試樣品的墨汁0.1mL/kg，動物均單籠飼養(yǎng)，正常飲水進食。從灌胃墨汁開始，記錄每只動物首次排黑便時間、5h內(nèi)排黑便粒數(shù)、質(zhì)量。收集的糞便在105℃烘干至恒重，按式(1)計算糞便含水率。

1.3.4 小腸推進實驗

給受試樣品15d后，各組小鼠禁食不禁水16h。模型組、死菌組與活菌組小鼠灌胃給予復(fù)方地芬諾酯（5mg/kg），空白組給予生理鹽水。給復(fù)方地芬諾酯0.5h后，Lc19活菌組與死菌組分別給予含受試樣品的墨汁0.1mL/kg（樣品劑量同1.3.3小鼠排便實驗），對照組灌胃墨汁0.1mL/kg。25min后立即脫頸椎處死小鼠，打開腹腔分離腸系膜，剪取上端自幽門、下端至回盲腸部的腸管，置于托盤上，輕輕將小腸拉成直線，測量腸管長度為“小腸總長度”，從幽門至墨汁前沿為“墨汁推進長度”。按式(2)計算墨汁推進率。

1.4 數(shù)據(jù)處理

墨汁推進率需進行數(shù)據(jù)轉(zhuǎn)換， ，式中：A為墨汁推進率，結(jié)果用小數(shù)表示。在進行方差分析時，先使用方差分析程序做方差齊性檢驗，方差齊后，計算F值，F(xiàn)＜0.05，則各實驗組平均數(shù)間不存在顯著性差異，若F≥0.05、P≤0.05，表明各組均數(shù)之間存在顯著性差異；用一個對照組同每個實驗組數(shù)據(jù)進行秩和t檢驗。

2 結(jié)果與討論

2.1 小鼠體重變化

表2 Lc19對便秘模型小鼠各排便指標的影響 (n＝10)

表1 實驗小鼠體重變化 (n＝10)

由表1可知，試驗期間小鼠的體重在各劑量試驗組與空白組間比較，均不存在顯著性差異（P＞0.05），表明試驗過程中副干酪乳桿菌Lc19對雄性小鼠的體重沒有顯著性影響，本研究是在小鼠生理常態(tài)條件下進行的。

2.2 小鼠排便實驗結(jié)果

實驗小鼠每天一次經(jīng)口灌胃副干酪乳桿菌Lc19的活菌體與死菌體，連續(xù)7d后測定對便秘模型小鼠首次排黑便時間、5h內(nèi)排黑便粒數(shù)、質(zhì)量及糞便含水率的影響，結(jié)果見表2。與空白組比較，模型組小鼠首次排黑便時間、5h內(nèi)排黑便粒數(shù)、排便質(zhì)量和糞便含水率均有極顯著性差異（P＜0.01），說明便秘小鼠模型成立。

由表2可知，Lc19的活菌體與死菌體經(jīng)口灌胃7d后，對于首次排黑便時間，活菌組、死菌組與模型組相比具有極顯著差異（P＜0.01），活菌組低于死菌組；對于5h內(nèi)黑便質(zhì)量，活菌組與死菌高劑量組與模型組相比具有極顯著差異（P＜0.01），死菌低劑量組與模型組具有顯著差異（P＜0.05），活菌組高于死菌組；對于5h內(nèi)黑便粒數(shù)，活菌組、死菌組與模型組相比具有極顯著差異（P＜0.01），活菌組高于死菌組；對于糞便含水率，活菌組、死菌組與模型組相比沒有顯著差異（P＞0.05）。

2.3 小腸推進實驗結(jié)果

小腸運動有3種方式，即張力收縮、分節(jié)運動和蠕動，主要以蠕動力推動腸內(nèi)容物運動為主要方式[10]。本實驗經(jīng)口灌胃給予小鼠止瀉劑復(fù)方地芬諾酯是一種便秘模型造模常用藥物[11]，其作用主要是直接作用于腸道平滑肌，通過抑制腸黏膜感受器，消除局部腸黏膜蠕動反射而使腸道蠕動減慢，使腸內(nèi)容物通過延遲，致使小鼠排便困難，與便秘臨床癥狀相近。經(jīng)灌胃建立小鼠小腸蠕動抑制模型后，再通過墨汁標記觀察Lc19活菌體與死菌體對便秘小鼠腸道蠕動的影響。實驗小鼠連續(xù)灌胃副干酪乳桿菌Lc19的活菌體與死菌體15d后，進行小腸推進實驗，結(jié)果見表3。

表3 Lc19對便秘小鼠小腸墨汁推進率的影響 (n＝10)

由表3可知，模型組墨汁推進率明顯低于空白組（P＜0.01），墨汁推進實驗小鼠便秘模型造模成功。灌胃15d后，活菌組、死菌高劑量組小腸推進率與模型組相比，極顯著增加（P＜0.01），死菌低劑量組顯著增加（P＜0.05），且出現(xiàn)劑量效應(yīng)，隨菌濃度的提高，便秘小鼠的墨汁推進率增加。

3 結(jié)論

本試驗通過灌胃復(fù)方地芬諾酯建立小鼠的便秘模型，以小鼠的首次排便時間、排便粒數(shù)和質(zhì)量、糞便水分含量和墨汁推進率等指標評價活的與熱滅活的副干酪乳桿菌Lc19對便秘模型小鼠的通便功能。綜合試驗數(shù)據(jù)可以看出，Lc19的活菌體與死菌體都可以改善便秘模型小鼠的排便能力。活菌體與死菌體相比可以顯著改善便秘模型小鼠的排便能力，活菌組與死菌組改善便秘的能力均存在劑量效應(yīng)，活菌高劑量組改善便秘的能力大于低劑量組，死菌高劑量組改善小鼠便秘的能力大于低劑量組。