何芳，伍佰鑫，周望平，浣成，羅陽

（湖南省畜牧獸醫(yī)研究所，長沙 410131）

奶牛乳房炎是目前奶牛群中發(fā)病率最高、花費最多、淘汰率最高、損失最嚴重的疾病，嚴重制約著奶牛業(yè)的發(fā)展。據(jù)統(tǒng)計我國奶牛場乳房炎疾病的發(fā)病率為46%～70%，造成的經(jīng)濟損失可達30億美元，且每年用于乳房炎防控經(jīng)費支出約2080萬美元，嚴重影響著我國奶牛養(yǎng)殖業(yè)的發(fā)展[1]。李樹梅等[2]在河北地區(qū)720份乳樣中檢測出182份隱性乳房炎，發(fā)病率為25.3%，其中主要致病菌為金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、無乳鏈球菌和溶血葡萄球菌。楊興斌[3]利用LMT法對甘肅地區(qū)6家奶牛場共240份乳樣進行檢測，發(fā)現(xiàn)有118份為隱性乳房炎，平均檢出率49.17%，且檢出率與其胎次呈正相關。目前，奶牛乳房炎主要使用抗生素以乳頭灌注的方法給藥進行治療，長期使用抗生素導致了奶牛乳腺泌乳能力下降，還造成了嚴重的耐藥性和藥物殘留，嚴重影響著人們的健康[4]。有試驗表明，奶牛乳房炎病原菌對青霉素等常用抗菌藥產(chǎn)生了不同程度的耐藥性，耐藥率最高(青霉素)達61.64%[5]。

中草藥富含多種抑菌或者殺菌的活性物質，對病原菌有直接或者間接的殺滅作用，具有無殘留、無耐藥性等多種優(yōu)點，廣泛應用于畜禽疾病防治[6]。研究表明中藥對防治奶牛乳房炎有著殘留低、刺激性小、效果好的優(yōu)點。張寶靜等[7]認為中草藥在治療乳腺炎時療效高于抗生素，而抗生素組療效較低的原因，可能與長期使用抗生素而產(chǎn)生抗藥性有關。但是目前，中草藥制劑穩(wěn)定性較差，方劑種類較少、配方?jīng)]有明確標準，操作較麻煩。本研究旨在克服現(xiàn)有技術的不足，研制一種中藥噴霧劑，為中草藥在防治奶牛乳房炎方面的研究提供參考。

1 材料

1.1 藥品

半枝蓮、蒲公英、木芙蓉、蘇木、黃柏、青皮，八角楓、木別子、熟地、皂刺、木貝母、赤芍、野菊花、夏枯草、暮草、八角蓮、兩面針、金銀花藤、青皮樹枝葉、白花、腫節(jié)風連錢草、地丁草、八角楓葉、號桐桿等25種中草藥，均購置于湖南中藥材市場。

1.2 主要培養(yǎng)基

血瓊脂培養(yǎng)基，普通瓊脂培養(yǎng)基，麥康凱瓊脂培養(yǎng)基，蛋白胨、牛肉浸粉、酵母浸膏（均為分析純），購自杭州天和微生物試劑有限公司。

1.3 奶牛乳房炎病原菌

金黃色葡萄球菌、大腸桿菌、停乳鏈球菌、乳房鏈球菌，為湖南省畜牧獸醫(yī)研究所分離、保存的菌株。

1.4 試驗動物

試驗動物均來自湖南省畜牧獸醫(yī)研究所奶牛原種場。

2 方法

2.1 防治奶牛乳房炎中草藥的體外篩選方法

2.1.1 中草藥的提取

將中草藥用75%的醫(yī)用酒精浸泡3～4d，再用旋轉蒸發(fā)儀濃縮，回收酒精。重復3次，將三次得到的藥液混合。將浸泡后的藥物殘渣再進行水煎提取3次。最后將醇提液和水煎藥物合并用旋轉蒸發(fā)儀濃縮至100mL（1g生藥/mL），過濾，滅菌，放置冰箱備用。

2.1.2 菌液的制備

取生長于普通營養(yǎng)瓊脂培養(yǎng)基（鏈球菌為血液培養(yǎng)基）上的試驗菌，用接種環(huán)蘸取少量菌落，接種于4～5mL的普通肉湯中，35℃孵育2～6h。增菌后的對數(shù)生長期菌液用生理鹽水或肉湯校正濃度至0.5麥氏比濁標準，使其含菌1～2×108CFU/mL。

2.1.3 中草藥體外抑菌作用的測定

采用藥物紙片瓊脂擴散法。將浸有中草藥的紙片（直徑為6mm）貼在平皿上，37℃培養(yǎng)箱中培養(yǎng)18h（鏈球菌培養(yǎng)24h）后測定抑菌圈直徑。并以0.1g/mL的氨芐西林鈉作為對照。

2.1.4 最低抑菌濃度（MIC）和最低殺菌濃度（MBC）的測定

對體外抑菌試驗效果明顯的幾種中草藥進行最低抑菌濃度和最低殺菌濃度的測定，采用管碟法：取9支試管，每支試管加液體培養(yǎng)基4.0mL，滅菌后備用。將滅菌的藥物4.0mL加入第一支試管中混勻，依次將藥物二倍稀釋，共稀釋成8個不同濃度后，第1～8管藥物濃度分別為20、2-1、2-2、2-3、2-4、2-5、2-6、2-7g/mL。第9支試管為液體培養(yǎng)基陰性對照。第1～8管每支試管再加入0.02mL菌懸液，培養(yǎng)24h。以肉眼觀察不顯示濁度、藥物濃度最小的一管作為MIC；分別取不顯示濁度試管中的肉湯0.05mL接種培養(yǎng)平板上，再培養(yǎng)24h，以無菌落或菌落生長數(shù)≤10的培養(yǎng)板所對應的最小藥物濃度為MBC。

2.2 防治奶牛乳房炎復方中草藥制劑的制備

2.2.1 中藥組方

在單味藥抗菌活性的基礎上，根據(jù)奶牛乳房炎的發(fā)病機理、中獸醫(yī)學理論和藥劑學理論，以傳統(tǒng)經(jīng)典組方瓜蔞散為基礎，進行加減，選用對四種病原菌表現(xiàn)出較好抑菌效果的中草藥組成復方。

2.2.2 復方中草藥噴霧劑的制備

中草藥復方經(jīng)醇提和水煮合并以后，加熱濃縮成浸膏。再緩慢加到配制好的復合溶媒（蒸餾水:無水乙醇:助溶劑）中，直至達到飽和為止。用3號耐酸過濾器濾去未溶解的藥物殘渣。最后加入2%的促滲劑和0.1%的高錳酸鉀。

2.3 復方中草藥噴霧劑對奶牛臨床型乳房炎的治療

表125種中草藥對四種病原菌的平均抑菌直徑 單位：mm

2.3.1 試驗方法

奶牛乳區(qū)臨床表現(xiàn)出紅、腫、熱、痛，奶汁稀薄，或帶有絮狀物、膿塊、血色的診斷為臨床型乳房炎患乳區(qū)。從2017年9～11月兩個月的時間內(nèi)，對在湖南省畜牧獸醫(yī)研究所奶牛原種場發(fā)現(xiàn)的患牛，一經(jīng)確診后馬上用試驗藥物進行治療，每天上下午各一次噴藥物于患乳房基部，連續(xù)用藥，未治愈的繼續(xù)給藥。共有18頭奶牛18個患乳區(qū)進入試驗。

2.3.2 判斷標準

痊愈判定標準：食欲正常，乳區(qū)的紅、腫、熱、痛消失，肉眼觀察乳汁正常，產(chǎn)奶量恢復至正常水平。無效判定標準：用藥5d后，乳區(qū)的紅、腫、熱、痛消失不明顯，乳汁仍異常，產(chǎn)奶量沒有恢復。

3 結果與分析

3.1 防治奶牛乳房炎中草藥篩選結果

3.1.125種中草藥體外抑菌試驗結果

從表1中可以看出半枝蓮、赤芍、蘇木、黃柏、木芙蓉、熟地、蒲公英7種中草藥對四種病原菌都表現(xiàn)出了較好的抑菌效果，而青皮、八角楓葉、八角蓮、兩面針、地丁草、八角楓根、號桐桿對四種病原菌體外抑菌效果不明顯。體外抑菌試驗是藥物篩選的初步條件，因此可將半枝蓮、赤芍、蘇木、黃柏、木芙蓉、熟地、蒲公英作為防治奶牛乳房炎制劑研制開發(fā)的主藥。

3.1.2 最低抑菌濃度和最低殺菌濃度測定結果

表27種中草藥對4種致病菌的MIC和MBC 單位：g/mL

特別觀察上述細菌抑菌圈實驗篩選出的7種藥的MIC與MBC，結果如表2所示。

3.2 中草藥復方噴霧劑治療奶牛臨床型乳房炎的臨床試驗結果

由表3顯示結果可以看出中草藥復方噴霧劑對奶牛臨床型治療乳房炎的治愈率達到88.9%，有效率為100%，表現(xiàn)出了較好的治療效果。在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，與抗生素聯(lián)合用藥可大大縮短治療療程。同時對于抗生素長期治療無效的頑固性乳房炎，改用試驗用的中草藥復方噴霧劑和抗生素聯(lián)合用藥治療，表現(xiàn)出了良好的治療效果。

表3 中草藥復方噴霧劑治療奶牛臨床型乳房炎的效果

4 討論

奶牛乳房炎是奶牛的一種常見疾病，每年都會給全世界奶業(yè)及養(yǎng)殖業(yè)造成巨大的損失，包括產(chǎn)奶量降低、乳品質下降以及生產(chǎn)成本的提高[8]。造成奶牛乳房炎的因素很多，其中，病原微生物感染是其主要病因。多種病原菌均可以引起奶牛乳房炎，其中以鏈球菌、金黃色葡萄球菌、大腸桿菌（E.coli）為主，大腸桿菌引起的乳房炎多見于高產(chǎn)奶牛及產(chǎn)后泌乳高峰期奶牛[9,10]。

我國一般使用抗生素以乳頭灌注的方法治療奶牛乳房炎，但長期大量使用抗生素，不僅使奶牛的乳腺泌乳能力下降，使病原菌產(chǎn)生耐藥性，增加了治療的難度，同時造成了嚴重藥物殘留，影響牛奶的品質和人們的健康[11]。藥物殘留、環(huán)境污染等問題已引起全社會高度關注，研究可替代抗生素類的新型藥物已成為新課題。中草藥富含多種抑菌或者殺菌的活性物質，對病原菌有直接或者間接的殺滅作用，兼有藥物和營養(yǎng)雙重功效，具有低毒、低殘留，不易產(chǎn)生耐藥性、綠色環(huán)保等優(yōu)點，目前已成為國內(nèi)外學者研究的焦點。專家學者在應用中草藥防治奶牛乳房炎方面進行了大量研究，取得了一系列成果。研究發(fā)現(xiàn)，單味中草藥在防治奶牛乳房炎的過程中，常存在用量大、效果不明顯、利用率低等缺點[12]。而復方中草藥制劑可以提高治療效果，減少單味中草藥的毒性，彌補單味中草藥防治奶牛乳房炎的不足。復方中草藥制劑在機體內(nèi)不僅可以直接抑制或者殺滅導致乳房炎的病原菌，而且可以提高機體的免疫力，調節(jié)機體的新陳代謝，促進營養(yǎng)物質的消化與吸收。多項研究證實了中草藥及其復方制劑在防治奶牛乳房炎方面具有很好的效果。葉文初等[13]報道了苦豆草提取物對奶牛乳房炎致病菌具有很好的體外抑菌效果。郝景鋒等[14]研究表明蒲公英、魚腥草、益母草、紅花、金銀花等5味中藥對奶牛隱性乳房炎3種病原菌的綜合抑制效果較好。路孝兵[12]報道了中藥蒲和飲透皮劑對金黃色葡萄球菌和大腸桿菌引起的奶牛乳房炎具有很好的治療效果。曲家華等[15]報道，蒲公英、金銀花、連翹等組方的中草藥粉劑“乳康健”對奶牛隱性乳房炎有良好的治療作用，日糧中添加500g/（頭·d）飼喂7d，乳區(qū)陽性率由29.17%下降為8.33%。賈麗萍等[16]比較了灌服蒲公英散( 蒲公英、全瓜蔞、銀花等組方)與乳頭孔注入氯唑西林鈉治療乳房炎的療效，結果顯示3個療程（1個療程5d）的有效率和治愈率蒲公英散比氯唑西林鈉分別高了16.1和20.4個百分點（P＜0.05），復發(fā)率低了9.2個百分點（P＜0.05）。呂平等[17]研究發(fā)現(xiàn)，苦丁茶、蒲公英、丁香的提取物和溶菌酶組合的復合物對臨床型奶牛乳房炎病原菌金黃色葡萄球菌、大腸埃希氏菌、無乳鏈球菌有明顯體外抑制作用。

本臨床試驗結果表明：以半枝蓮、赤芍、蘇木、黃柏、木芙蓉、熟地、蒲公英等數(shù)味藥制備成的中草藥噴霧劑對臨床型奶牛乳房炎的治愈率達到88.9%，有效率為100%，表現(xiàn)出了較好的治療效果。在試驗過程中還發(fā)現(xiàn)，與抗生素聯(lián)合用藥可大大縮短治療療程。同時對于抗生素長期治療無效的頑固性乳房炎，改用試驗用的中草藥復方噴霧劑和抗生素聯(lián)合用藥治療，表現(xiàn)出了良好的治療效果。