謝玉鋒，韓雪梅，路福平*

(1.省部共建食品營養(yǎng)與安全國家重點實驗室，天津科技大學生物工程學院，天津 300457；2.哈爾濱學院食品工程學院，哈爾濱學院食品生物技術重點實驗室，黑龍江 哈爾濱 150086)

【研究意義】α-葡萄糖苷酶是評價糖尿病的重要指標，糖尿病是一種以血糖量偏高為特征的可以導致以糖代謝為主的糖、脂肪和蛋白質物質的一種代謝紊亂綜合癥[1-2]。是一種不能徹底治愈的疾病，一般以緩解病情為主，目前，糖尿病預防和治療主要依賴于藥物治療，但目前藥物治療通常易發(fā)生胰島素過敏、耐藥性等副作用，對肝、腎等器官損傷也較為嚴重[3-5]，因此有效的糖尿病管理策略是最重要的。通過抑制α-葡萄糖苷酶活性，從而可以減緩腸道生成葡萄糖的速度，緩解餐后血糖上升癥狀和高胰島素血癥，同時還可改善糖耐受量，從而預防和治療糖尿病及其并發(fā)癥。因此通過克服α-葡萄糖苷酶活性表達以達到對糖尿病患者保健作用的研究也得到了廣泛關注?！厩叭搜芯窟M展】乳酸菌作為世界公認的可安全使用的微生物，已經用于多種發(fā)酵食品的加工。國內外在研究乳酸菌降血糖有很多涉足。范文婭等[6-8]研究表明，乳酸菌對有效抑制α-葡萄糖苷酶活性，緩解糖尿病具有非常重要的意義。Otieno等[9-11]研究結果表明，乳酸菌發(fā)酵大豆制品具有預防心腦血管疾病，降低血脂和血糖的功能。因此，乳酸菌在糖尿病中的應用和研究已成為糖尿病新的研究熱點。開發(fā)具有α-葡萄糖苷酶抑制活性、保健功能、有一定降糖效果的日用功能性產品非常有必要?！颈狙芯壳腥朦c】本研究擬從傳統(tǒng)發(fā)酵食品中分離篩選具有抑制α-葡萄糖苷酶活性特性的乳酸菌。對其進行菌種鑒定及對α-葡萄糖苷酶抑制活性進行檢測，將其應用于發(fā)酵豆?jié){產品并進行α-葡萄糖苷酶抑制活性驗證?！緮M解決的關鍵問題】以期得到能緩解糖尿病的日用功能性食品。

1 材料與方法

1.1 材料與儀器

1.1.1 材料 傳統(tǒng)發(fā)酵食品(酸粥、奶豆腐、大醬、酸菜、酸面團)；RCM培養(yǎng)基；MRS培養(yǎng)基；TaqDNA聚合酶、α-PNPG、DNA Marker、細菌基因組提取試劑盒、α-葡萄糖苷酶。

1.1.2 儀器與設備 TCL-12 臺式高速冷凍離心機(Sigma)，SHA-B水浴恒溫振蕩器(江蘇國華儀器廠)，SCD-II型高純水裝置(Millipore)，HH-B11-420型電熱恒溫培養(yǎng)箱(上海智城)，PTC-200型PCR基因擴增儀(Eppendorf)，全自動凝膠成像儀(SYNGENE)，SP-2012UV型紫外可見分光光度計(北京普析儀器)，NanoDrop(Thermo)，光學顯微鏡M102(Motic)，超低溫冰箱(Forma Scientific)。

1.2 實驗方法

1.2.1 乳酸菌分離篩選 富集培養(yǎng)：稱取1 g樣品(或液體1 mL)，直接加入到無菌的10 mL RCM富集培養(yǎng)基中，37 ℃富集培養(yǎng)24 h。

平板初篩：采用十倍稀釋傾注法[12]實驗操作后于37 ℃條件下培養(yǎng)48 h，觀察，挑取溶鈣圈較大的單菌落進行3次劃線分離純化。

抑制α-葡萄糖苷酶乳酸菌篩選：將初篩菌種接入RCM液體培養(yǎng)基中增殖，取出100 μl加于酶標板中，再向酶標板中加入0.2 U/mL的α-葡萄糖苷酶100 μl，37 ℃溫育10 min，點接于含α-PNPG的平板培養(yǎng)基培養(yǎng)，選擇菌落周圍形成黃色色澤較淺的菌株進行編號，初步篩選出抑制α-葡萄糖苷酶活性的乳酸菌菌株。

復篩：將編號菌株接入MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃培養(yǎng)24 h，再轉入MRS液體培養(yǎng)基中同等條件下培養(yǎng)，當乳酸菌種達到穩(wěn)定期的時候，離心培養(yǎng)液，取離心后的上清液進行α-葡萄糖苷酶抑制酶活力的測定，進行3次平行實驗，取其平均值，通過α-PNPG與α-葡萄糖苷酶作用顯色后在405 nm處光吸收的比較，進一步確定能較強抑制α-葡萄糖苷酶酶活的乳酸菌菌株。

1.2.2 乳酸菌的鑒定 16S rDNA測序分析：采用 16S rDNA 檢測與 Biolog 檢測結合作為菌株鑒定手段。16S rDNA 擴增使用引物V3-4F和V3-4R，委托上海派森諾公司測序，測序結果在GeneBank中對比分析。

乳酸菌形態(tài)學和生理生化鑒定：菌株的生理生化鑒定參照《常見細菌鑒定手冊》[13]。

1.2.3 乳酸菌特性分析 乳酸菌生長曲線的測定：將經活化后的乳酸菌按10 %(v/v)的接種量接入到裝有100 mL MRS培養(yǎng)基的錐形瓶中，放置于恒溫恒濕培養(yǎng)箱中，溫度控制在37 ℃。每2 h取樣測OD600值。

乳酸菌活菌計數：將發(fā)酵后的酸豆?jié){用無菌生理鹽水進行適當稀釋，然后采用十倍稀釋傾注法計數。

體外模擬耐胃酸實驗[14]：將活化后的乳酸菌按 10 %(v/v)的接種量接種于pH 2.0和pH 3.0的 MRS液體培養(yǎng)基中，37 ℃分別培養(yǎng)0和2 h 后，用十倍梯度稀釋法稀釋后傾注處理進行菌落計數，計算乳酸菌存活率。

(1)

體外模擬耐膽鹽實驗：將活化后的乳酸菌按 10 %(v/v)的接種量接種于含0.3 %牛膽酸鈉的 MRS 液體培養(yǎng)基中，37 ℃分別培養(yǎng)0 和4 h 后，用十倍梯度稀釋法稀釋后傾注處理進行菌落計數，計算乳酸菌存活率。

(2)

1.2.4 α-葡萄糖苷酶活性抑制分析 將凍干樣品用少量DMSO溶解，用0.1 mol/L pH 6.8磷酸鉀緩沖液稀釋定容。取不同濃度的稀釋樣品50 μl，加入50 μl α-葡萄糖苷酶(以0.1 mmol/L pH 6.8磷酸鉀緩沖液溶解稀釋)在37 ℃下溫育5 min，再加入30 μl 0.2 mmol/L α-PNPG(以0.1 mol/L pH 6.8磷酸鉀緩沖液稀釋)，37 ℃條件下培養(yǎng)30 min，最后加入100 μl 0.1 mol/L pH 9.8的碳酸鈉溶液終止反應，在波長為405 nm下測定吸光度。以阿卡波糖做為IC50對照，同時設立陰性對照和陽性對照。

α-葡萄糖苷抑制率=

(3)

2 結果與分析

2.1 乳酸菌的分離篩選

2.1.1 乳酸菌平板分離篩選 由圖1顯示，在篩選平板上挑選有較大溶鈣圈的單菌落 46個，經3次3區(qū)劃線分離出單菌落，培養(yǎng)基活化培養(yǎng)后保存于20 %甘油中，置于-80 ℃冰箱，以上述菌株為原始菌株，進行進一步實驗。

2.1.2 α-PNPG篩選平板篩選 通過α-PNPG篩選平板篩選，共選出8株黃色色澤較淺的菌株，通過觀察各菌株發(fā)現，1-1號乳酸菌菌株菌落色澤最淺。

將8株菌株進行三角瓶發(fā)酵復篩，經37 ℃發(fā)酵培養(yǎng)24 h，將上清培養(yǎng)液與α-葡萄糖苷酶溫育，加入α-PNPG反應30 min，在405 nm 下進行OD值測定，OD值見表1。得到OD相對較低的菌株1-1，和平板初篩結果相一致。將菌株1-1保存菌種，進行菌種鑒定和進一步發(fā)酵特征研究。

2.2 乳酸菌的鑒定

2.2.1 菌株1-1形態(tài)學特征 由圖2顯示，菌株1-1在瓊脂培養(yǎng)基上形成表面光滑濕潤、微微隆起狀、色乳白、呈圓形的菌落；鏡檢下菌體呈桿狀，革蘭氏染色呈陽性。

2.2.2 菌株1-1生理生化特征 在菌種鑒定中，應用最廣泛的是分子生物學技術中的16S rDNA序列同源性分析，而表型實驗以生理生化實驗為主要顯形。檢測細菌生理生化反應可以了解其對自然界中營養(yǎng)物質分解利用特性，細菌代謝類型的差異反映了細胞內酶系統(tǒng)的差異，因此，生理生化反應成為細菌分類鑒定的重要依據之一。如表2所示，表中特征與文獻[15]中描述的副干酪乳桿菌特征相同，初步將菌株1-1化為副干酪乳桿菌。2007年副干酪乳桿菌直接劃分為干酪乳桿菌菌群[16]。

圖1 乳酸菌平板初篩Fig.1 Plate selection method for lactic acid bacteria

圖2 菌株1-1的菌體形態(tài)(10×100)Fig.2 Mycelial morphology of strain 1-1

鑒定項目結果鑒定項目結果碳源利用氮源利用D-葡萄糖+蛋白胨+棉籽糖-牛肉膏+果糖+酵母粉+乳糖+硝酸銨+麥芽糖+硫酸銨+D-甘露糖+氯化銨+D-木糖-精氨酸-纖維二糖+脲+生理生化反應 酶反應明膠液化-接觸酶-H2S生成-蛋白酶+聯苯胺反應+脲酶+

注：“+”代表結果呈陽性，“-”代表結果呈陰性。

2.2.3 菌株1-1分子生物學鑒定 由圖3顯示，取擴增反應完畢后的 PCR 產物 2 μl，加樣品于0.8 %瓊脂糖凝膠點樣孔中進行電泳，電泳液為 1×TAE。電泳后，用溴化乙錠溶液染色(3～5 min)，在紫外凝膠成像儀下觀察并拍照，在250～500 bp之間出現了長度約為480 bp條帶的瓊脂糖凝膠電泳圖。

將 PCR 產物送到上海派森諾生物測序公司測序，利用 BLAST軟件鑒定其種屬。

由圖4可以看出，應用BLAST功能將序列與GenBank中已有的16s rDNA序列進行相似性比對并構建系統(tǒng)進化樹，菌株1-1與菌株L.paracaseiN1115的相似性為99 %。因此，結合菌株1-1菌落、菌體形態(tài)和生理生化實驗結果，可以鑒定菌株1-1為副干酪乳桿菌，并命名為L.paracaseiTK1501，將該菌株保于中國微生物菌種保藏中心，編號為CGMCC13130。

M：DNA marker；1：菌株1-116S rDNA PCR產物圖3 16S rDNA的PCR擴增產物Fig.3 Production of 16S rDNA amplification by PCR

圖4 菌株1-1的系統(tǒng)進化關系圖Fig.4 Phylogenetic tree of strain 1-1

2.3 乳酸菌特性分析

2.3.1 乳酸菌生長曲線的測定 由圖5可以看出，按照實驗方法測定OD600，以培養(yǎng)時間為橫坐標，以對應的菌體的生物量(吸光度)為縱坐標，繪制得到了L.paracaseiTK1501的生長曲線。

L.paracaseiTK1501的生長規(guī)律為：延滯期為0～4 h，對數生長期為4～16 h，自16 h開始，菌體進入穩(wěn)定期。

2.3.2 乳酸菌活菌計數 按照實驗方法進行L.paracaseiTK1501的活菌計數，活菌數可達8.9×108CFU/mL。

2.3.3 體外模擬耐胃酸實驗 從表3顯示，按照實驗方法進行L.paracaseiTK1501的體外模擬耐胃酸實驗。

正常情況下，胃液pH 1.3～1.8，飯后胃液被稀釋，pH值可上升至3.5。人體食用的食物通過胃的時間一般在1～2 h。胃液中的胃酸能抑制或者殺死進入胃中的微生物。酸度越大，對菌體的抑制作用越明顯。L.paracaseiTK1501在模擬胃酸環(huán)境下存活率較高，在pH 3.0時達到84.93 %，符合作為益生菌的基本特性。

圖5 L.paracasei TK1501生長曲線Fig.5 Growth curve of L.paracasei TK1501

Table 3 Resistance ofL.paracaseiTK1501 to simulated stomach acid

pH胃液pH 2.0pH 3.0時間(h)0 2 0 2 活菌數(lg CFUmL-1)8.21±0.354.66±0.208.23±0.236.99±0.27存活率( %)56.76 84.93

2.3.4 體外模擬耐膽鹽實驗 從表4顯示，按照實驗方法進行L.paracaseiTK1501的體外模擬耐膽鹽實驗。

膽鹽(Bile salt)是由肝細胞分泌的膽汁酸與甘氨酸或?；撬峤Y合而形成的鈉鹽或鉀鹽。人體中膽汁含有75 %的甘氨膽酸鈉和25 %的?；悄懰徕c。人體小腸的膽鹽濃度一般在0.03 %～0.3 %，可以在細胞外產生高滲透壓，對菌體細胞造成影響。據了解，膽鹽的毒性作用對細胞膜和DNA都有一定程度的損傷。L.paracaseiTK1501在模擬胃膽鹽0.3 %環(huán)境下存活率達到80.59 %，符合作為益生菌的基本特性。

2.4 α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用分析

按實驗方法1.2.4 中的方法測定經L.paracaseiTK1501發(fā)酵豆?jié){前后樣品對α-葡萄糖苷酶活性的抑制作用。

由圖6可知，L.paracaseiTK1501發(fā)酵豆?jié){在其測試濃度范圍內均對α-葡萄糖苷酶有一定的抑制作用，并且隨著發(fā)酵豆?jié){產物提取液濃度增大，其α-葡萄糖苷酶活性抑制也隨之增大，當發(fā)酵產品提取液濃度為10 mg/mL時，發(fā)酵樣品對α-葡萄糖苷酶活性抑制率為85.38 %，高于未發(fā)酵空白對照70.35 %，發(fā)酵豆?jié){產品抑制α-葡萄糖苷酶的IC50為1.88 mg/mL，而同等條件下的降糖藥物阿卡波糖的IC50為0.40 mg/mL。未發(fā)酵的空白對照為2.37 mg/mL。

表4 L.paracasei TK1501在模擬膽鹽環(huán)境中的耐受性

圖6 α-葡萄糖苷酶活性抑制圖Fig.6 α-glucosidase inhibitory activities

3 討論與小結

采用α-PNPG平板初篩和三角瓶發(fā)酵復篩，從傳統(tǒng)發(fā)酵食品樣品中分離篩選到一株具有抑制α-葡萄糖苷酶酶活特性的副干酪乳桿菌。通過發(fā)酵豆?jié){對抑制α-葡萄糖苷酶活性進行驗證發(fā)現發(fā)酵豆?jié){產品對α-葡萄糖苷酶活性有較好的抑制作用，這可能是因為在發(fā)酵過程中L.paracaseiTK1501將豆?jié){中的某些大分子物質降解產生小分子的生物活性更強的降血糖成分[17-19]。對于糖尿病患者來說，抑制α-葡萄糖苷酶活性可以緩解其病癥。服用α-葡萄糖苷酶抑制劑后可以使得糖吸收面積減少，吸收時間后延，從而對降低餐后高血糖有益, 在長期使用后亦可降低空腹血糖, 估計與提高胰島素敏感性有關。

對該副干酪乳桿菌作為益生菌的基本特性進行了檢測，在模擬胃酸pH 3.0和膽鹽0.3 % 的環(huán)境下存活率分別達到84.93 % 和80.59 %，有較強的耐酸和耐膽鹽能力，其具有作為益生菌的基本特性。