楊 峰，李躍建，李曉梅，雍小平，冉 科，陳 琳，覃海燕，冉茂林*

(1.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所，四川 德陽(yáng) 618000；2.蔬菜種質(zhì)與品種創(chuàng)新四川省重點(diǎn)實(shí)驗(yàn)室，四川 成都 610066；3.四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院，四川 成都 610066；4.四川省農(nóng)業(yè)技術(shù)推廣總站，四川 成都 610041)

【研究意義】蘿卜(RaphanussativusL.)在世界各地均有種植，其中歐美國(guó)家主要栽培小型四季蘿卜；亞洲國(guó)家則主要栽培大型蘿卜[1]。蘿卜也是我國(guó)重要的十字花科蔬菜作物，年種植面積在120萬(wàn)hm2左右，位居全國(guó)第三，在蔬菜生產(chǎn)和供應(yīng)上起到了重要作用[2]。在生產(chǎn)上，蘿卜比較容易發(fā)生“未熟抽薹”或“先期抽薹”現(xiàn)象，即蘿卜肉質(zhì)根在未完全膨大時(shí)就抽薹，從而降低或失去商品價(jià)值，造成經(jīng)濟(jì)損失。我國(guó)擁有眾多蘿卜種質(zhì)資源，但開(kāi)始耐抽薹品種選育的研究較晚，導(dǎo)致日本和韓國(guó)的耐抽薹品種大量進(jìn)入國(guó)內(nèi)，占據(jù)主要市場(chǎng)。因此，加強(qiáng)對(duì)耐抽薹蘿卜種質(zhì)資源的研究，不斷培育新的種質(zhì)資源，是加快耐抽薹蘿卜育種進(jìn)程的重要途徑?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】自20世紀(jì)70年代開(kāi)始，分子生物學(xué)研究開(kāi)啟了核酸時(shí)代，各類分子標(biāo)記技術(shù)被廣泛應(yīng)用于蔬菜作物的遺傳多樣性研究中[3-5]。簡(jiǎn)單序列重復(fù)(Simple sequence repeat, SSR)通常又稱為微衛(wèi)星或者STMS(Sequence-tagged microsatellites)，是基于PCR的分子標(biāo)記，普遍分布于真核生物基因組中，具有信息含量高、穩(wěn)定性好、多態(tài)性高、操作和分析簡(jiǎn)單等優(yōu)點(diǎn)，現(xiàn)被廣泛用于蔬菜種質(zhì)資源遺傳多樣性分析[6]及種質(zhì)資源鑒定[7]等研究。近幾年以蘿卜為材料，利用SSR標(biāo)記進(jìn)行的研究，主要包括圖譜構(gòu)建[8-10]、基因組學(xué)[11]、轉(zhuǎn)錄組學(xué)[12]、表觀遺傳學(xué)[13]、純度鑒定[14-15]、育性鑒定[16]和肉質(zhì)根色[17]等方面。簡(jiǎn)單序列重復(fù)區(qū)間擴(kuò)增多態(tài)性(Inter-simple sequence repeat, ISSR)是在SSR基礎(chǔ)上發(fā)展起來(lái)的一種新的標(biāo)記技術(shù)，其特點(diǎn)是快速、可靠，具有更好的穩(wěn)定性和重復(fù)性，已廣泛用于各類作物的遺傳多樣性分析[18]、品系鑒定[19]、遺傳作圖和基因定位[20]等研究中。隨著深入研究，發(fā)現(xiàn)單一標(biāo)記技術(shù)的支持率、分辨率均有限，難以通過(guò)單一標(biāo)記，對(duì)種質(zhì)分子遺傳特征的本質(zhì)進(jìn)行體現(xiàn)和鑒別。因此，利用多種分子標(biāo)記技術(shù)，進(jìn)行遺傳多樣性分析，以期獲得更可靠的聚類結(jié)果。而將以上2 種分子標(biāo)記技術(shù)相結(jié)合，進(jìn)行不同抽薹性蘿卜遺傳多樣性分析，至今未見(jiàn)報(bào)道。【本研究切入點(diǎn)】利用ISSR及SSR分子標(biāo)記，對(duì)64份不同抽薹性蘿卜材料進(jìn)行分析，研究其遺傳多樣性及親緣關(guān)系?！緮M解決的關(guān)鍵問(wèn)題】從分子水平上研究各材料遺傳背景和親緣關(guān)系，為選育耐抽薹蘿卜品種提供理論依據(jù)，以期實(shí)現(xiàn)分子標(biāo)記輔助育種。

1 材料與方法

1.1 供試材料

供試64個(gè)不同抽薹性蘿卜材料，均由四川省農(nóng)業(yè)科學(xué)院水稻高粱研究所蘿卜課題組提供。抽薹等主要特性描述參照李錫香等[21]方法，略作修改，詳見(jiàn)表1。分子標(biāo)記所需的ISSR、SSR引物由成都擎科梓熙生物技術(shù)有限公司合成，Taq酶和dNTP購(gòu)自生工生物工程(上海)股份有限公司。

1.2 試驗(yàn)方法

1.2.1 DNA提取 穴盤(pán)育苗，待蘿卜幼苗長(zhǎng)至3片真葉時(shí)采嫩葉，用天根生化科技(北京)有限公司生產(chǎn)的高效植物基因組DNA 提取試劑盒提取基因組DNA，微量分光光度計(jì)(NanoDrop 2000)檢測(cè)DNA濃度和質(zhì)量，將DNA濃度調(diào)至10 ng/μl，-20 ℃冰箱(海爾醫(yī)用低溫保存箱)保存?zhèn)溆谩?/p>

1.2.2 ISSR擴(kuò)增 ISSR引物從哥倫比亞大學(xué)(University of British Columbia Biotechnology, UBC)[22]公布的100個(gè)通用引物序列中，通過(guò)預(yù)實(shí)驗(yàn)篩選出16個(gè)進(jìn)行多態(tài)性分析。用Applied Biosystems公司Veriti Thermal Cycler PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。ISSR-PCR反應(yīng)采用15 μl體系，其中含1×PCR buffer，2.5 μmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，1UTaq酶，0.2 μmol/L引物，20 ng DNA模板。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，56 ℃ 40 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.2.3 SSR擴(kuò)增 搜索蘿卜基因組數(shù)據(jù)庫(kù)(http://marker.kazusa.or.jp/Daikon/及http://ioinfo.ti.cornell.edu/ cgi-bin/radish/)中公布的與抽薹開(kāi)花相關(guān)的SSR引物序列信息，合成了206對(duì)，并從中篩選出21對(duì)擴(kuò)增條帶清晰、多態(tài)性明顯較好的引物。用Applied Biosystems公司Veriti Thermal Cycler PCR儀進(jìn)行擴(kuò)增。SSR-PCR反應(yīng)采用15 μl體系，其中含1×PCR buffer，2.5 μmol/L MgCl2，200 μmol/L dNTP，1UTaq酶，0.2 μmol/L引物，20 ng DNA模板。擴(kuò)增程序?yàn)椋?4 ℃預(yù)變性5 min；94 ℃ 40 s，55～62 ℃(不同SSR引物設(shè)不同退火溫度)45 s，72 ℃ 90 s，35個(gè)循環(huán)；72 ℃ 10 min；4 ℃保存。

1.2.4 PCR產(chǎn)物檢測(cè) 擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)10 %的非變性聚丙烯酰胺凝膠電泳(北京六一儀器廠DYCZ-24B型電泳儀及DYY-6D型電源)，銀染檢測(cè)。

1.2.5 數(shù)據(jù)統(tǒng)計(jì)分析 將銀染結(jié)果進(jìn)行統(tǒng)計(jì)，清晰且可重復(fù)條帶記為“1”，不重復(fù)且在同一位置上的弱帶或無(wú)條帶記為“0”，建立數(shù)據(jù)庫(kù)。統(tǒng)計(jì)PCR擴(kuò)增產(chǎn)物的條帶總數(shù)和多態(tài)性條帶數(shù)，計(jì)算多態(tài)性條帶百分率P=i/j×100 %，其中i為多態(tài)性條帶數(shù)，j為擴(kuò)增總條帶數(shù)。用POPGENE 1.32統(tǒng)計(jì)觀測(cè)等位基因數(shù)(Na)、有效等位基因數(shù)(Ne)、Nei基因多樣性指數(shù)(H)及shannon多樣性信息指數(shù)(I)[23]。利用NTSYS pc-2.10e分析數(shù)據(jù)，分別求ISSR、SSR和ISSR+SSR的遺傳相似系數(shù)(GS)矩陣，按非加權(quán)組平均法(UPGMA)進(jìn)行聚類分析[24]，并用TFPGA軟件進(jìn)行Mantel-test[25]相關(guān)性分析。

2 結(jié)果與分析

2.1 ISSR和SSR引物多樣性分析

分別對(duì)64份材料進(jìn)行PCR擴(kuò)增，16對(duì)ISSR引物的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖1(部分)和表2，共擴(kuò)增出90條帶，每對(duì)引物擴(kuò)增出2～10條帶，平均4.29條，其中具有多態(tài)性的68條，多態(tài)性條帶百分率為75.56 %；21對(duì)SSR引物的擴(kuò)增結(jié)果見(jiàn)圖2(部分)和表3，共擴(kuò)增出86條帶，每對(duì)引物擴(kuò)增出2～8條帶，平均4.10條，其中具有多態(tài)性的62條，多態(tài)性條帶百分率為72.09 %。表明本研究中篩選到的ISSR和SSR引物多態(tài)性良好，有較顯著的檢出效率，可用于后續(xù)的遺傳多樣性分析。

圖1 引物ISSR-802對(duì)64份試驗(yàn)材料的ISSR擴(kuò)增電泳圖Fig.1 ISSR-PCR amplification electrophoresis of 64 experimental materials by primer ISSR-802

圖2 引物SSR-068對(duì)64份試驗(yàn)材料的SSR擴(kuò)增電泳圖Fig.2 SSR-PCR amplification electrophoresis of 64 experimental materials by primer SSR-068

表2 ISSR引物序列及擴(kuò)增結(jié)果

2.2 遺傳多樣性分析

通過(guò)POPGENE 1.32軟件分析，得到(表4)。ISSR引物對(duì)64份供試材料擴(kuò)增結(jié)果中，平均觀測(cè)等位基因數(shù)為2.2719，平均有效等位基因數(shù)為1.7518，有效等位基因比例為77.11 %，平均Nei基因多樣性指數(shù)為0.4176，平均Shannon多態(tài)性指數(shù)為0.6045；SSR引物擴(kuò)增結(jié)果中，平均觀測(cè)等位基因數(shù)為1.9165，平均有效等位基因數(shù)為1.5951，有效等位基因比例為83.23 %，平均Nei基因多樣性指數(shù)為0.3493，平均Shannon多態(tài)性指數(shù)為0.5232。統(tǒng)計(jì)分析表明，兩類引物擴(kuò)增結(jié)果都反映出供試材料較高的遺傳多樣性。

2.3 聚類分析

2.3.1 ISSR聚類分析 應(yīng)用Nei等[26]的統(tǒng)計(jì)分析方法，計(jì)算遺傳相似系數(shù)(GS)，共獲得2016個(gè)兩兩不同材料間的遺傳相似系數(shù)，變幅為0.3382～0.8676，平均遺傳相似系數(shù)為0.5758，大于0.7的僅占3.22 %，其中30和34號(hào)材料間遺傳相似系數(shù)最大(0.8676)，說(shuō)明二者間親緣關(guān)系最近；1和24號(hào)間的遺傳相似系數(shù)最小(0.3382)，說(shuō)明他們兩兩之間的親緣關(guān)系最遠(yuǎn)。如圖3所示，以 0.55為閾值可以把64份材料分為4大類群：第Ⅰ類包括1、2號(hào)材料，為來(lái)源于德國(guó)的極晚抽薹材料；第Ⅱ類共有57份材料，來(lái)源于中國(guó)、韓國(guó)和日本，占所有供試材料的89.06 %；第III類為13、15、16號(hào)共3份，均來(lái)源于中國(guó)的自育材料；第Ⅳ類包括3、5號(hào)材料，為來(lái)源于德國(guó)和日本的極晚抽薹材料。進(jìn)一步分析可以把第Ⅱ類分為4個(gè)亞類(第2、3、4、5亞類)：第2亞類共有19份，第3亞類共有28份，第4亞類有2份，第5亞類有8份材料。

表4 4份試驗(yàn)材料的遺傳多樣性指數(shù)

圖3 64份試驗(yàn)材料基于ISSR標(biāo)記的聚類圖Fig.3 UPGMA dendrograms of 64 experimental materials based on ISSR markers

2.3.2 SSR聚類分析 遺傳相似系數(shù)的變幅為0.3043～0.9348，平均遺傳相似系數(shù)為0.6451，大于0.7的占25.10 %，說(shuō)明同樣材料之間，基于SSR引物的GS要大于ISSR，所揭示的親源關(guān)系更近。其中22和50號(hào)、41和42號(hào)材料間遺傳相似系數(shù)最大(0.9348)，1和11號(hào)間的遺傳相似系數(shù)最小(0.3043)。如圖4所示，以 0.60為閾值把64份材料分為4大類群：第Ⅰ類包括1、3號(hào)材料，為來(lái)源于德國(guó)的極晚抽薹材料；第Ⅱ類共有59份材料，占所有供試材料的92.19 %；第III類僅有44號(hào)材料；第Ⅳ類包括5、6號(hào)材料，為來(lái)源于日本的極晚抽薹材料。進(jìn)一步分析把第Ⅱ類分為4個(gè)亞類：第2、3、4、5亞類，材料數(shù)量分別為5、46、6、2份。

2.3.3 整合ISSR與SSR聚類分析 遺傳相似系數(shù)，變幅為0.3772～0.8333，平均遺傳相似系數(shù)為0.6038，大于0.7的僅占5.36 %，其中26和35號(hào)、30和34號(hào)材料間遺傳相似系數(shù)最大(0.8333)，1和24號(hào)間的遺傳相似系數(shù)最小(0.3772)。由此可知64份材料的遺傳背景豐富，可作為育種資源。聚類結(jié)果如圖5所示，以 0.57為閾值把供試材料分為4大類群：第I類為1、2、3號(hào)材料，包含全部來(lái)源于德國(guó)的極晚抽薹材料；第 II 類共有59份材料；第 III 類僅有來(lái)源于韓國(guó)的10號(hào)材料；第Ⅳ類僅有來(lái)源于日本的5號(hào)材料。進(jìn)一步將第Ⅱ類分為4個(gè)亞類：第2亞類共有48份，占所有供試材料的75.00 %；第3亞類僅有來(lái)源于中國(guó)的20號(hào)自育材料；第4亞類有7份，其中85.71 %的為白圓蘿卜材料；第5亞類有13、15、16號(hào)共3份材料。

2.4 相關(guān)性分析

對(duì)ISSR、SSR和ISSR+SSR標(biāo)記的GS矩陣進(jìn)行Mantel-test相關(guān)性檢測(cè)。 結(jié)果表明：ISSR和SSR標(biāo)記的相關(guān)性不顯著(R= 0.171，P>0.05)；ISSR+ SSR與ISSR標(biāo)記呈顯著相關(guān)(R= 0.612，P<0.05)；ISSR+ SSR與SSR標(biāo)記呈顯著相關(guān)(R= 0.894，P<0.05)。

3 討 論

遺傳多樣性是生物所攜帶的遺傳信息總和，對(duì)分析重要性狀和輔助育種具有重要意義。本研究中，遺傳多樣性結(jié)果說(shuō)明，供試材料間遺傳相似程度較低，不同抽薹性蘿卜間遺傳差異較大，遺傳關(guān)系較遠(yuǎn)，這與Wang等[27]利用EST-SSR標(biāo)記進(jìn)行遺傳多樣性分析所得結(jié)果中引物多態(tài)性89.3 %，平均多態(tài)信息含量(PIC)值0.39相似。而與方平等[28]對(duì)肉質(zhì)色不同蘿卜遺傳多樣性的分析結(jié)果中，平均Na、Ne、I、GS值分別為8.7、5.1627、1.76、0.85相比較，本研究中兩種分子標(biāo)記的結(jié)果與其差異均較大。不同結(jié)果的產(chǎn)生，可能與材料來(lái)源的豐富程度，尤其是野生型材料的多少有關(guān)。由于研究目的性狀的不同，所選用的分子標(biāo)記差異較大，對(duì)遺傳多樣性結(jié)果的影響較大。

圖4 64份試驗(yàn)材料基于SSR標(biāo)記的聚類圖Fig.4 UPGMA dendrograms of 64 experimental materials based on SSR markers

圖5 64份試驗(yàn)材料基于ISSR+SSR標(biāo)記的聚類圖Fig.5 UPGMA dendrograms of 64 experimental materials based on SSR plus ISSR markers

在多種分子標(biāo)記對(duì)種質(zhì)資源遺傳多樣性的研究中，陳文輝等[29]利用ISSR和SRAP標(biāo)記，對(duì)36個(gè)耐抽薹大白菜品種進(jìn)行遺傳多樣性分析，2種標(biāo)記都擴(kuò)增出各自的多態(tài)性譜帶，其結(jié)果反映出供試材料豐富的遺傳多態(tài)性。對(duì)蘿卜而言，Zhu等[30]和周娜等[31]，分別利用RAPD、AFLP與SRAP，以及SSR、RAPD 與RAMP各3種分子標(biāo)記，對(duì)17份及32份不同蘿卜材料進(jìn)行種質(zhì)鑒定與遺傳多樣性分析，表明采用不同分子標(biāo)記獲得的遺傳距離存在差異，多種分子標(biāo)記綜合聚類分析，更能準(zhǔn)確反映出蘿卜材料之間的遺傳關(guān)系。本研究中，ISSR與SSR標(biāo)記的遺傳距離間不存在顯著相關(guān)，2種標(biāo)記的檢測(cè)水平和多態(tài)性各有不同。ISSR顯示出材料間具有一定的地域差異，SSR分析的多態(tài)性可能與蘿卜的重要表型性狀相關(guān)。ISSR與SSR標(biāo)記結(jié)合后，聚類結(jié)果既與表型性狀相關(guān)，又能在一定程度上反映出材料間的地理位置關(guān)系，稍優(yōu)于單獨(dú)的ISSR或SSR標(biāo)記。

抽薹性狀為數(shù)量性狀，受外界環(huán)境影響大，在十字花科蔬菜中的相關(guān)研究較多。高穎等[32]利用57個(gè)SSR和InDel標(biāo)記對(duì)大白菜抽薹開(kāi)花時(shí)間進(jìn)行關(guān)聯(lián)分析，將80份自交系及110份F1材料分為3個(gè)亞群體，發(fā)現(xiàn)13個(gè)標(biāo)記的17個(gè)位點(diǎn)與抽薹時(shí)間和開(kāi)花時(shí)間相關(guān)。在耐抽薹蘿卜研究上，柳李旺等[33]將甲基化敏感擴(kuò)增多態(tài)性技術(shù)(MSAP)應(yīng)用于蘿卜抽薹機(jī)制研究中，證明了DNA甲基化水平的變化影響蘿卜抽薹開(kāi)花，揭示了甲基化水平降低有利于抽薹開(kāi)花相關(guān)基因的表達(dá)。劉哲等[34]對(duì)蘿卜抽薹相關(guān)SRAP分子標(biāo)記進(jìn)行篩選與分析，獲得116對(duì)多態(tài)性引物組合，多態(tài)性40.3 %，多態(tài)性條帶范圍為0～5，得到1個(gè)與蘿卜晚抽薹基因緊密連鎖的標(biāo)記，遺傳距離為5.7 cM。

本ISSR+SSR標(biāo)記的聚類結(jié)果中，來(lái)源于德國(guó)的極耐抽薹蘿卜材料分在第I大類，日本的極耐抽薹材料“時(shí)大根”在第IV大類，第II大類中則包括了極耐抽薹的“藏蘿1號(hào)”和自育的C60223，而第III大類中僅有來(lái)源于韓國(guó)的“世農(nóng)”。其中，日本的“時(shí)大根”與“黑蘿卜”、“藏蘿1號(hào)”和C60223間的GS值分別為0.4737、0.5175和0.5351，遺傳差異大，可作為耐抽薹雜交親本材料加以利用。同時(shí)，本研究的聚類結(jié)果可將大部分地理來(lái)源相近的材料聚為一類，但與抽薹性狀之間仍存在差別。這可能是由于分子標(biāo)記體現(xiàn)的是種質(zhì)材料間分子水平上的差異，而表型性狀差異是環(huán)境與基因互作的結(jié)果。

4 結(jié) 論

不同抽薹性蘿卜材料所表現(xiàn)出的豐富多樣性，對(duì)蘿卜種質(zhì)資源管理和耐抽薹品種選育具有重要意義。本研究采用多種分子標(biāo)記相結(jié)合的方式，獲得更可靠的聚類結(jié)果，能在一定程度上反映出不同抽薹性蘿卜材料間親緣關(guān)系，后續(xù)選擇遺傳相似度低、親緣關(guān)系遠(yuǎn)的材料作為親本，應(yīng)用于育種，以提高后代遺傳重組率，增強(qiáng)雜種優(yōu)勢(shì)。