莫景康，黎紹基

（廣州工商學(xué)院，廣東廣州 510000）

益生菌是指寄生在人體內(nèi)，與人體形成共生關(guān)系并對(duì)人體健康有利的微生物。常見(jiàn)的益生菌有乳桿菌、雙歧桿菌、芽孢桿菌以及球菌等[1]。益生菌能在宿主腸道內(nèi)定植并產(chǎn)生乳酸、細(xì)菌素和過(guò)氧化氫等物質(zhì)，抑制腸道內(nèi)的有害微生物，促進(jìn)宿主腸道健康。目前，它們被廣泛應(yīng)用于食品和醫(yī)藥領(lǐng)域[2-3]。

益生菌在食品生產(chǎn)過(guò)程中和進(jìn)入消化道后都可能經(jīng)歷各種環(huán)境壓力，因此良好的環(huán)境壓力耐受性對(duì)益生菌至關(guān)重要。靳志強(qiáng)等[4]采用MRS培養(yǎng)基模擬胃酸環(huán)境以及膽鹽環(huán)境，分離提取出一種可以承受pH=3的環(huán)境以及膽鹽濃度為0.3%的環(huán)境的植物乳桿菌。李利等[5]從酸奶中分離出的2株乳桿菌具有優(yōu)良的抗酸性以及抗膽鹽能力。李一娟等[6]發(fā)現(xiàn)從健康家禽新鮮糞便中分離出來(lái)的羅伊氏乳桿菌在經(jīng)過(guò) pH=2.5、1.5 g·L-1膽鹽以及 1 mmol·L-1H2O2接種處理6 h后，活菌數(shù)基本能維持初始濃度。

為了解市面上的益生菌沖劑所含的益生菌在不同環(huán)境壓力下的活性，本研究以市場(chǎng)上在售的3種益生菌沖劑產(chǎn)品為研究對(duì)象，檢驗(yàn)其中的益生菌對(duì)酸、膽鹽以及抗氧化性壓力的耐受性。

1 材料與方法

1.1 材料與試劑

將有效期內(nèi)的3種益生菌沖劑產(chǎn)品（表1）接種于MRS液體培養(yǎng)基中，于37 ℃培養(yǎng)活化，每24 h傳代。實(shí)驗(yàn)時(shí)將OD在0.5～1.0的3種細(xì)菌培養(yǎng)液在4 000 r·min-1離心10 min，離心后去掉上清液，用生理鹽水懸浮，重復(fù)以上離心、懸浮、離心，然后將菌體懸浮于新鮮的MRS液體培養(yǎng)基中，使OD≈1.0待用。

表1 實(shí)驗(yàn)用益生菌沖劑信息

MRS固體培養(yǎng)基和豬膽鹽購(gòu)自北京奧博星生物技術(shù)有限公司，過(guò)氧化氫溶液購(gòu)自廈門(mén)安永博科技有限公司，MRS液體培養(yǎng)基購(gòu)自杭州百思生物技術(shù)有限公司。

1.2 實(shí)驗(yàn)方法

1.2.1 對(duì)環(huán)境壓力條件篩選

借鑒袁琨等[7]實(shí)驗(yàn)方法，將OD≈1.0的3種產(chǎn)品的益生菌用膽鹽、酸和過(guò)氧化氫處理，具體濃度如下，每個(gè)處理重復(fù)3次。A：膽鹽濃度0%、0.1%、0.2%、0.3%和0.4%（w/v）；B：pH值為1.5、2.0、2.5、3.0、3.5和6.5；C：H2O2濃度0%、0.003 3%、0.006 7%、0.010 0%、0.0133%（v/v）；37 ℃恒溫培養(yǎng)12 h，測(cè)量3種益生菌產(chǎn)品在600 nm的OD值。

1.2.2 環(huán)境壓力耐受能力測(cè)定

借鑒袁琨等[7]實(shí)驗(yàn)方法，將OD=0.5～1.0的3種產(chǎn)品培養(yǎng)液按上述方法清洗并懸浮于MRS中，使OD≈1.0，立刻對(duì)菌液進(jìn)行以下4種處理，每個(gè)處理重復(fù)3次。A：0.3%膽鹽作為膽鹽壓力；B：pH值為2作為酸性壓力；C：0.01% H2O2作為氧化壓力；D：無(wú)壓力的對(duì)照。菌液在37 ℃培養(yǎng)，在第4 h、8 h、12 h、24 h和48 h測(cè)OD。以時(shí)間為橫坐標(biāo)，以O(shè)D為縱坐標(biāo)作各壓力組和對(duì)照組的生長(zhǎng)曲線(xiàn)。

2 結(jié)果與分析

2.1 無(wú)環(huán)境壓力下生長(zhǎng)情況

由圖1知，在無(wú)壓力環(huán)境中，A、C產(chǎn)品益生菌在24 h時(shí)菌落達(dá)到穩(wěn)定期并持續(xù)到48 h。而B(niǎo)產(chǎn)品益生菌在24 h時(shí)正處于穩(wěn)定期，在48 h時(shí)進(jìn)入衰亡期。

圖1 3種益生菌沖劑內(nèi)所含益生菌在無(wú)環(huán)境壓力下的生長(zhǎng)情況

2.2 耐膽鹽能力

在12 h內(nèi)，3種產(chǎn)品對(duì)不同膽鹽濃度的適應(yīng)能力都較強(qiáng)，在0.4%膽鹽濃度下3種產(chǎn)品都能成功繁殖生長(zhǎng)。其中在0.1%膽鹽濃度下A、C產(chǎn)品益生菌耐受能力優(yōu)于無(wú)膽鹽對(duì)照組，在0.4%膽鹽濃度下B產(chǎn)品益生菌耐受能力優(yōu)于無(wú)膽鹽組（圖2）。依據(jù)此結(jié)果，選取0.3%膽鹽濃度用于動(dòng)態(tài)活性研究。

圖2 3種益生菌沖劑內(nèi)所含益生菌在不同膽鹽濃度的活性

3種產(chǎn)品在0.3%膽鹽濃度下培養(yǎng)48 h的動(dòng)態(tài)活性如圖3所示。3種產(chǎn)品在4 h測(cè)定時(shí)菌落總數(shù)已經(jīng)達(dá)到頂峰，往后開(kāi)始進(jìn)入衰亡期。與無(wú)壓力對(duì)照組相比可以看出，0.3%濃度膽鹽對(duì)3種產(chǎn)品的菌株都具有較強(qiáng)的促進(jìn)生長(zhǎng)能力。

圖3 膽鹽濃度為0.3%時(shí)3種益生菌沖劑內(nèi)所含益生菌的生長(zhǎng)情況

2.3 耐酸能力

在pH值為1.5～3.0培養(yǎng)12 h時(shí)，3種產(chǎn)品的益生菌均處于抑制狀態(tài)，而在pH值為3.5時(shí)A、C產(chǎn)品益生菌能進(jìn)行少量繁殖且C產(chǎn)品益生菌比A產(chǎn)品益生菌繁殖稍強(qiáng)，而B(niǎo)產(chǎn)品益生菌仍被抑制，無(wú)法繁殖。說(shuō)明A、C產(chǎn)品益生菌的耐酸能力比B產(chǎn)品好（圖4）。依據(jù)此結(jié)果，選取pH=2.0用于動(dòng)態(tài)活性研究。

圖4 3種益生菌產(chǎn)品內(nèi)所含益生菌在不同pH值下的實(shí)驗(yàn)結(jié)果

在pH值為2.0下，在培養(yǎng)的48 h內(nèi)，A、B產(chǎn)品益生菌被全程抑制，C產(chǎn)品益生菌能進(jìn)行少量繁殖。說(shuō)明在胃酸強(qiáng)度的pH下（pH=2.0），3種產(chǎn)品益生菌的耐受能力一般（圖5）。

圖5 pH=2.0時(shí)3種益生菌沖劑所含益生菌的生長(zhǎng)情況

2.4 抗氧化能力

在H2O2濃度為0.003 3%時(shí)培養(yǎng)12 h，對(duì)3種產(chǎn)品的益生菌抑制作用不明顯，H2O2濃度高于0.006 7%時(shí)，3種產(chǎn)品益生菌生長(zhǎng)受限。可以說(shuō)明3種益生菌具有一定的抗氧化能力（圖6）。依據(jù)此結(jié)果，選取0.010 0% H2O2濃度用于動(dòng)態(tài)活性研究。

圖6 3種益生菌沖劑所含益生菌在不同H2O2濃度下的生長(zhǎng)情況

在0.010 0% H2O2中的動(dòng)態(tài)生長(zhǎng)情況如圖7所示。3種益生菌沖劑所含益生菌在0.010 0%固定濃度的H2O2中培養(yǎng)48 h，A、B產(chǎn)品的益生菌全程被抑制，無(wú)生長(zhǎng)。而C產(chǎn)品益生菌在48 h監(jiān)測(cè)時(shí)，發(fā)現(xiàn)成功繁殖并達(dá)到最高菌落濃度。

圖7 3種益生菌沖劑所含益生菌在0.010 0% H2O2中的生長(zhǎng)情況

3 結(jié)論

3種益生菌產(chǎn)品在膽鹽濃度為0.1%、0.2%、0.3%和0.4%下均能保持活性，且A和C產(chǎn)品在0.1%的濃度下出現(xiàn)益生菌生長(zhǎng)速度超過(guò)無(wú)壓力對(duì)照組的情況，說(shuō)明低濃度膽鹽能促進(jìn)部分益生菌產(chǎn)品的生長(zhǎng)繁殖。在pH值低于3.5時(shí)，3種產(chǎn)品的益生菌生長(zhǎng)活性受限，無(wú)法大量繁殖，說(shuō)明3種益生菌產(chǎn)品耐酸性一般。使用低濃度的H2O2處理后，發(fā)現(xiàn)3種益生菌在低濃度的H2O2（0.003 3%）濃度下能進(jìn)行生長(zhǎng)繁殖，可以說(shuō)明3種益生菌產(chǎn)品都有一定的抗氧化性能。如何提高產(chǎn)品益生菌的耐消化活性，是各個(gè)廠家研發(fā)人員需要重點(diǎn)解決的問(wèn)題。對(duì)益生菌沖劑產(chǎn)品的探究，能為市場(chǎng)監(jiān)管部門(mén)提供數(shù)據(jù)支撐，幫助研發(fā)人員更好地開(kāi)發(fā)該類(lèi)產(chǎn)品。