程連強(qiáng)　施春英　郭恩慧　邱魯陽　夏玉軍

[摘要] 目的 通過膠原蛋白肽-透明質(zhì)酸負(fù)載表皮生長(zhǎng)因子（EGF-CP-HA）水凝膠在大鼠全層皮膚缺損傷口的應(yīng)用來探討其對(duì)皮膚傷口愈合的影響。方法 90只SD大鼠，麻醉后制備傷口創(chuàng)面動(dòng)物模型，隨機(jī)分為生理鹽水（NS）組、透明質(zhì)酸（HA）水凝膠組、膠原蛋白肽-透明質(zhì)酸（CP-HA）水凝膠組、透明質(zhì)酸負(fù)載表皮生長(zhǎng)因子（EGF-HA）水凝膠組和EGF-CP-HA水凝膠組，每組18只。后4組大鼠在其皮膚傷口處分別貼敷相應(yīng)水凝膠治療。觀察并記錄創(chuàng)面愈合情況。分別在相應(yīng)時(shí)間點(diǎn)麻醉大鼠后取傷口及其周緣1 cm的組織，行蘇木精-伊紅、Masson、免疫組化染色來觀察損傷區(qū)域不同時(shí)間的組織病理變化、膠原纖維分布、血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-α（VEGF-α）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）的表達(dá)。結(jié)果 EGF-CP-HA水凝膠組大鼠皮膚傷口愈合時(shí)間最短（F=6.46，P<0.01）。蘇木精-伊紅染色顯示，EGF-CP-HA水凝膠組創(chuàng)面炎性反應(yīng)較NS組輕，毛細(xì)血管及膠原纖維生成較其他組多;Masson染色顯示，EGF-CP-HA水凝膠組膠原纖維較其他組多，排列規(guī)則、有序，更接近正常皮膚;免疫組化染色顯示，EGF-CP-HA水凝膠組TGF-β1和VEGF-α的表達(dá)強(qiáng)度均顯著高于NS組（F=12.51～18.64，P<0.05）。結(jié)論EGF-CP-HA水凝膠可減輕皮膚創(chuàng)面的炎癥反應(yīng)，提高VEGF-α和TGF-β1的表達(dá)水平，明顯促進(jìn)傷口愈合。

[關(guān)鍵詞] 水凝膠類;透明質(zhì)酸;表皮生長(zhǎng)因子;膠原;傷口愈合;皮膚;大鼠

[中圖分類號(hào)] R977.6;R944.15 ?[文獻(xiàn)標(biāo)志碼] A ?[文章編號(hào)] ?2096-5532（2019）04-0451-05

[ABSTRACT] Objective To explore the effect of collagen peptide-hyaluronic acid loaded epidermal growth factor （EGF-CP-HA） hydrogel on skin wound healing in rats with full-thickness skin defect. ?Methods Ninety Sprague-Dawley rats were randomly divided into saline （NS） group， hyaluronic acid （HA） hydrogel group， collagen peptide-hyaluronic acid （CP-HA） hydrogel， hyaluronic acid-loaded epidermal growth factor hydrogel （EGF-HA） group， and EGF-CP-HA hydrogel group， with 18 rats in each group. The rats in the latter four groups were treated with corresponding hydrogels on their skin wounds. Wound healing was observed and recorded. After the rats were anesthetized at the corresponding time point， tissue samples at the wound and 1 cm from the wound were taken and subjected to hematoxylin-eosin， Masson， and immunohistochemical staining to observe the histopathological changes， the distribution of collagen fibers， and the expression of vascular endothelial growth factor-α （VEGF-α） and transforming growth factor-β1 （TGF-β1） in the injured area at different time points. ?Results The wound healing time of rats in EGF-CP-HA hydrogel group was the shortest （F=6.46，P<0.01）. Hematoxylin-eosin staining showed that the EGF-CP-HA hydrogel group had milder inflammatory reaction of wound surface than the NS group， and had more formation of capillaries and collagen fibers than other groups; Masson staining showed that collagen fibers were more regularly arranged and closer to normal skin in the EGF-CP-HA hydrogel group than in other groups. Immunohistochemical staining showed that the expression of TGF-β1 and VEGF-α was significantly higher in the EGF-CP-HA hydrogel group than in the NS group （F=12.51-18.64，P<0.05）. ?Conclusion EGF-CP-HA hydrogel can alleviate the inflammatory reaction of skin wounds， increase the expression levels of VEGF-α and TGF-β1， and significantly promote wound healing.

[KEY WORDS] hydrogels; hyaluronic acid; epidermal growth factor; collagen; wound healing; skin; rats

皮膚是身體的第一道防線，大多數(shù)的皮膚輕微損傷可以自我修復(fù)，當(dāng)皮膚損傷嚴(yán)重時(shí)，不能完全再生，創(chuàng)面形成瘢痕甚至延遲愈合或者不愈合。大面積或深層的皮膚損傷嚴(yán)重威脅人類健康，因此促進(jìn)傷口愈合和減少瘢痕形成顯得尤為重要[1]。皮膚損傷后的愈合過程是一個(gè)由多種組織細(xì)胞、細(xì)胞因子、炎性細(xì)胞等共同參與且互相作用的極其復(fù)雜的生物學(xué)過程[2-3]。水凝膠是由親水性聚合物交聯(lián)而成的三維網(wǎng)狀結(jié)構(gòu)，能夠承載細(xì)胞，并依靠其各種理化生物特性為處于其中的細(xì)胞營(yíng)造微環(huán)境，從而促進(jìn)傷口愈合。本研究根據(jù)透明質(zhì)酸（HA）和膠原蛋白肽（CP）的理化性質(zhì)，用丙烯酸酐加成的方法對(duì)狹鱈魚皮CP-HA進(jìn)行處理制成負(fù)載重組人表皮生長(zhǎng)因子（EGF）的水凝膠材料，將其貼敷于模型大鼠皮膚創(chuàng)面，觀察水凝膠對(duì)傷口愈合及瘢痕形成的影響，以探索一種使用安全、成本低廉的促進(jìn)傷口愈合及減少瘢痕形成的組織工程材料。

1 材料與方法

1.1 材料

1.1.1 實(shí)驗(yàn)動(dòng)物 出生60 d左右的清潔級(jí)雄性SD大鼠90只，體質(zhì)量220～250 g，購(gòu)于青島大任富城畜牧有限公司。大鼠單籠飼養(yǎng)，環(huán)境溫度15～22 ℃、濕度50%～60%，實(shí)驗(yàn)前適應(yīng)環(huán)境飼養(yǎng)1周。

1.1.2 主要試劑 狹鱈魚皮CP粉由青島福生食品公司和青島大學(xué)醫(yī)學(xué)院饋贈(zèng);HA粉末、透析袋購(gòu)自北京索萊寶科技有限公司;MTT、甲基丙烯酸酐（MA）、三乙胺、N-二甲基甲酰胺（DMF）、光引發(fā)劑I2959均購(gòu)自美國(guó)Sigma-aldrich公司;兔抗血管內(nèi)皮生長(zhǎng)因子-α（VEGF-α）和轉(zhuǎn)化生長(zhǎng)因子-β1（TGF-β1）單克隆抗體購(gòu)自英國(guó)Abcam公司，山羊抗兔二抗購(gòu)自北京中杉金橋公司。

1.2 CPMA和HAMA的合成

①CPMA的合成：將4 g CP粉加入到100 mL蒸餾水中，攪拌至充分溶解，將溶液的pH值調(diào)至7.4。加入30 mL的DMF，溶解后再加入4 g三乙胺攪拌至充分溶解，再加入10 mL的MA，在持續(xù)攪拌中反應(yīng)48 h，并在反應(yīng)過程中加入0.5 g碳酸氫鈉，最后調(diào)節(jié)pH值至7.4。反應(yīng)結(jié)束后的溶液用截留分子量為1 000的透析袋透析3 d，然后用真空冷凍干燥機(jī)凍干后儲(chǔ)存?zhèn)溆?。②HAMA的合成：將4 g的HA粉末加入到100 mL蒸餾水中，其余操作步驟同CPMA的合成。

1.3 水凝膠的制備

①HA水凝膠：在無菌的條件下應(yīng)用PBS將HAMA配制成濃度為10 g/L的溶液。②CP-HA水凝膠：應(yīng)用PBS配制成CPMA濃度為30 g/L和HAMA濃度為10 g/L的溶液。③EGF-HA水凝膠：在濃度為10 g/L的HAMA溶液中加入終濃度為1 mg/L重組人EGF。④EGF-CP-HA水凝膠：用PBS配制成CPMA濃度為30 g/L和HAMA濃度為10 g/L的溶液，加入終濃度為1 mg/L的重組人EGF。在以上4種溶液中分別加入終濃度為1 g/L的光引發(fā)劑I2959，充分混勻后，加入到模具中，用365 nm波長(zhǎng)紫外線照射15 min，待其形成固體的水凝膠后取出備用。整個(gè)操作過程均在無菌環(huán)境下進(jìn)行。

1.4 動(dòng)物模型的制備及分組

用手術(shù)切割方法造模，在造模前2 d于大鼠背部脊柱兩側(cè)用80 g/L硫化鈉脫毛備皮。術(shù)前腹腔注射20 g/L戊巴比妥鈉40 mg/kg麻醉大鼠，取俯臥位暴露大鼠背部，鋪無菌巾，術(shù)區(qū)常規(guī)用碘附消毒后，在距脊柱正中兩側(cè)旁開1 cm處用直徑1.2 cm的角膜環(huán)鉆做全層皮膚缺損創(chuàng)面，左右各1個(gè)，止血并用生理鹽水沖洗傷口，消毒后備用。將90只SD大鼠，隨機(jī)分為NS組（A組）、HA水凝膠組（B組）、EGF-HA水凝膠組（C組）、CP-HA水凝膠組（D組）和EGF-CP-HA水凝膠組（E組），每組18只。后4組大鼠在傷口處貼敷相應(yīng)水凝膠治療，然后在傷口周緣縫合包扎涂抹凡士林的無菌紗布，遮蓋水凝膠及傷口，防止水凝膠脫落和傷口感染。

1.5 創(chuàng)面愈合情況觀察及實(shí)驗(yàn)樣本采集

從造模當(dāng)天（第0天）開始，每隔3 d使用佳能70D相機(jī)拍照，觀察創(chuàng)面愈合情況。用Image-pro plus 6.0圖像分析軟件測(cè)量傷口面積，計(jì)算傷口創(chuàng)面愈合率。傷口創(chuàng)面愈合率=（建模后傷口面積-現(xiàn)在剩余傷口面積）/建模后傷口面積×100%。以傷口創(chuàng)面愈合率>90%為愈合標(biāo)準(zhǔn)。分別于第3、7、11、14、21、28天每組隨機(jī)選取3只大鼠，麻醉后取傷口及其周緣1 cm的包含皮膚和皮下組織的標(biāo)本，用40 g/L多聚甲醛溶液固定。

1.6 組織學(xué)觀察

將組織標(biāo)本常規(guī)脫水后進(jìn)行石蠟包埋，制成5 μm厚的組織切片。根據(jù)標(biāo)準(zhǔn)流程進(jìn)行常規(guī)蘇木精-伊紅染色、Masson三色染色，光鏡下觀察。

1.7 免疫組化染色

將石蠟切片常規(guī)脫蠟至水;加入檸檬酸鈉溶液在微波爐中進(jìn)行抗原修復(fù);以PBS漂洗3次，每次5 min;用內(nèi)源性過氧化酶封閉液（體積分?jǐn)?shù)0.03 H2O2）37 ℃封閉10 min;室溫下以PBS漂洗3次，每次5 min;用體積分?jǐn)?shù)為0.10的山羊血清封閉10 min;分別滴加兔抗VEGF-α單克隆抗體（稀釋度1∶80）和兔抗TGF-β1單克隆抗體（稀釋度1∶100），4 ℃過夜;以PBS漂洗3次，每次5 min;加山羊抗兔二抗室溫孵育1 h;以PBS洗3次，每次5 min;加入二氨基苯乙胺在光學(xué)顯微鏡下控制顯色，用自來水沖洗終止顯色;蘇木精復(fù)染，脫水，中性樹膠封片。以棕黃色深染為免疫組化染色陽性，應(yīng)用OLYMPUS光學(xué)顯微鏡采集圖片，用ipp 6.0軟件進(jìn)行半定量分析。

1.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)處理

采用GraphPad Prism 7.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，計(jì)量數(shù)據(jù)以±s表示，多組間比較采用單因素和重復(fù)測(cè)量設(shè)計(jì)方差分析，以P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

2 結(jié) ?果

2.1 創(chuàng)面愈合時(shí)間和愈合率

EGF-CP-HA組創(chuàng)面愈合時(shí)間明顯短于NS組，差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.46，P<0.01）。時(shí)間與貼敷水凝膠無交互作用（F=2.19，P>0.05）。與NS組相比，應(yīng)用水凝膠各組術(shù)后第3、7、11天的創(chuàng)面面積均有不同程度減小，以EGF-CP-HA組減小最明顯。EGF-CP-HA組術(shù)后第3、7、11天的創(chuàng)面愈合率與NS組相比較差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=26.48～56.31，P<0.01）。見表1。

2.2 傷口創(chuàng)面的形態(tài)學(xué)變化

術(shù)后第3天，各組創(chuàng)面滲出液明顯減少，創(chuàng)面均被血痂皮覆蓋，傷口開始收縮變小，傷口周圍干燥，腫脹減輕。隨著時(shí)間的延長(zhǎng)，應(yīng)用水凝膠各組傷口創(chuàng)面減小的速度明顯快于NS組，其中以EGF-CP-HA組促進(jìn)傷口愈合的效果最明顯。術(shù)后第12天，EGF-CP-HA組傷口達(dá)到愈合標(biāo)準(zhǔn)，其余組未達(dá)到愈合標(biāo)準(zhǔn)。術(shù)后第28天，各組創(chuàng)面均已愈合，EGF-CP-HA組創(chuàng)面與周邊皮膚差別不明顯，無明顯瘢痕凸起，傷口愈合區(qū)域有大量新生毛發(fā);其他組傷口周緣清晰，可見瘢痕組織形成，無明顯毛發(fā)生長(zhǎng)。

2.3 組織學(xué)觀察

蘇木精-伊紅染色顯示，術(shù)后第3天，各組創(chuàng)面均有大量的肉芽組織形成并向傷口內(nèi)生長(zhǎng)，創(chuàng)面區(qū)域可見大量的毛細(xì)血管生成，大量的巨噬細(xì)胞和中性粒細(xì)胞浸潤(rùn)，膠原纖維生成，但尚無完整表皮覆蓋創(chuàng)面，EGF-CP-HA組炎性反應(yīng)較其他組輕，毛細(xì)血管及膠原纖維生成較其他組多。術(shù)后第14天，HA水凝膠組、EGF-HA水凝膠組和CP-HA水凝膠組創(chuàng)面炎性細(xì)胞浸潤(rùn)較NS組減少，膠原纖維相對(duì)雜亂，肉芽組織向瘢痕組織轉(zhuǎn)變，而EGF-CP-HA組創(chuàng)面有完整的表皮覆蓋創(chuàng)面，創(chuàng)面有少量炎性細(xì)胞，膠原纖維排列更加整齊、規(guī)則。術(shù)后第21天，各組均有完整的表皮覆蓋創(chuàng)面，增厚的再生表皮與真皮層之間有明顯的界限，膠原纖維較之前排列整齊，炎癥細(xì)胞浸潤(rùn)不明顯，未見明顯新生皮脂腺形成;與其他組相比，EGF-CP-HA組創(chuàng)面再生表皮形態(tài)更接近正常的表皮，有新生的毛囊形成，但其數(shù)量和密度較正常皮膚低。

Masson三色染色將結(jié)締組織和膠原纖維染成藍(lán)色，平滑肌染成紅色，細(xì)胞核染成褐色。術(shù)后第3、14、21天，各組均有膠原纖維在組織中生成;術(shù)后第14、21天，EGF-CP-HA組膠原纖維數(shù)量最多，對(duì)照組最少;術(shù)后第21天，EGF-CP-HA組膠原纖維數(shù)量較其他組多，排列規(guī)則、有序，更接近正常皮膚。

2.4 創(chuàng)面組織TGF-β1和VEGF-α的表達(dá)

術(shù)后第3、7、11天，各組大鼠皮膚創(chuàng)面組織中TGF-β1和VEGF-α的表達(dá)比較，差異均有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義，以EGF-CP-HA組的表達(dá)最多，NS組的表達(dá)最少（F=12.51～18.64，P<0.05）。見表2。

2.5 新生血管數(shù)

取術(shù)后第11天的組織切片，應(yīng)用VEGF-α免疫組化染色法標(biāo)記毛細(xì)血管，結(jié)果顯示，NS組、HA水凝膠組、EGF-HA水凝膠組、CP-HA水凝膠組和EGF-CP-HA水凝膠組大鼠的毛細(xì)血管數(shù)分別為6.51±1.29、7.75±0.96、8.52±1.00、9.50±1.29和11.53±1.29（n=6），與NS組相比，應(yīng)用水凝膠各組新生血管數(shù)均有增加，以EGF-CP-HA組增加最明顯，差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義（F=6.53，P<0.01）。

3 討 ?論

傷口創(chuàng)面愈合是一個(gè)由多種細(xì)胞和組織成分參與的高度復(fù)雜、協(xié)同的過程，包括各種組織的再生、肉芽組織增生和瘢痕組織形成等，可分為急性炎癥期、炎癥反應(yīng)期、組織增生期和組織重塑期等4個(gè)主要階段[4-6]，但4個(gè)階段無明顯界限、互相重疊。參與創(chuàng)面修復(fù)的細(xì)胞包括巨噬細(xì)胞、中性粒細(xì)胞、血小板、血管內(nèi)皮細(xì)胞、表皮角質(zhì)形成細(xì)胞、真皮成纖維細(xì)胞、外根鞘細(xì)胞、神經(jīng)細(xì)胞及脂肪細(xì)胞等[7-8]。這些細(xì)胞所釋放出來的各種細(xì)胞因子和生長(zhǎng)因子直接參與了創(chuàng)面修復(fù)的各個(gè)階段[9-11]。

在全層皮膚傷口中，基底膜破裂，皮膚附屬器官（皮脂腺、汗腺和毛囊等）被破壞。創(chuàng)面愈合時(shí)，上皮細(xì)胞遷移至傷口邊緣，肉芽組織填充創(chuàng)面床，此時(shí)成纖維細(xì)胞迅速浸潤(rùn)皮膚傷口，成纖維細(xì)胞的浸潤(rùn)對(duì)于誘導(dǎo)早期炎癥反應(yīng)以促進(jìn)皮膚傷口再上皮化非常重要[12]。炎癥過程與創(chuàng)面愈合直接相關(guān)，炎癥細(xì)胞因子刺激創(chuàng)面再上皮化，促進(jìn)創(chuàng)面愈合[13]。EGF可通過促進(jìn)內(nèi)皮細(xì)胞和成纖維細(xì)胞的增殖，加速包括皮膚在內(nèi)的各種組織的傷口再生[14]。實(shí)驗(yàn)已證明，水凝膠負(fù)載重組人EGF的濃度為1 mg/L時(shí)最有利于皮膚傷口的恢復(fù)[15]。通過在CP-HA水凝膠中培養(yǎng)人臍帶間充質(zhì)干細(xì)胞實(shí)驗(yàn)，目前可以大致認(rèn)為CPMA濃度為30 g/L、HAMA濃度為10 g/L是一個(gè)較為適宜的制備凝膠濃度[16]。

本文創(chuàng)面愈合時(shí)間結(jié)果顯示，應(yīng)用水凝膠各組均可以不同程度加快創(chuàng)面愈合，以EGF-CP-HA組效果最明顯?？紤]原因可能為：EGF-CP-HA水凝膠能為創(chuàng)面保濕，在創(chuàng)面上形成保護(hù)層，防止皮膚缺損部位與外界的大面積接觸，減少創(chuàng)面感染的概率，為創(chuàng)面愈合創(chuàng)造更好的條件;EGF-CP-HA水凝膠可以持續(xù)緩慢釋放重組人EGF，其中的HA在組織生長(zhǎng)、發(fā)育、傷口愈合和消除炎癥等方面有巨大作用，且狹鱈魚皮CP具有良好的生物相容性，可通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖、蛋白合成，提高M(jìn)2型巨噬細(xì)胞含量，促進(jìn)大鼠傷口的愈合[17]。

VEGF又稱為血管通透因子，是一種誘導(dǎo)血管生成的多功能生長(zhǎng)因子。它能特異性地促進(jìn)血管內(nèi)皮細(xì)胞分裂、增殖，增強(qiáng)血管通透性以及誘導(dǎo)血管生成等，而VEGF-α是目前已知的促進(jìn)血管生成效果最顯著的因子[18]。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，VEGF-α在大鼠皮膚創(chuàng)面及其周緣的中性粒細(xì)胞、巨噬細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、血管內(nèi)皮細(xì)胞、成纖維細(xì)胞、皮脂腺上皮細(xì)胞、毛囊中均有表達(dá)，但以在成纖維細(xì)胞中的表達(dá)為主，與NS組相比較，應(yīng)用水凝膠各組VEGF-α的表達(dá)量均明顯增加，且以EGF-CP-HA組的表達(dá)量最高。CORRAL等[19]的研究結(jié)果顯示，損傷后的皮膚中VEGF mRNA的表達(dá)量可提高6～7倍，提出VEGF在皮膚創(chuàng)傷修復(fù)過程中的作用重大。

TGF-β1是已知的效果最顯著的促纖維化因子，在傷口創(chuàng)面愈合整個(gè)過程中起著非常重要的作用，它不僅可促進(jìn)成纖維細(xì)胞快速增殖，而且能夠促進(jìn)多種細(xì)胞分泌膠原、HA等細(xì)胞外基質(zhì)成分，從而促進(jìn)肉芽組織的形成、肌成纖維細(xì)胞轉(zhuǎn)化及再上皮化[20]。本實(shí)驗(yàn)中，術(shù)后第3、7、11天，應(yīng)用水凝膠各組大鼠皮膚創(chuàng)面組織中TGF-β1的表達(dá)均較NS組顯著增高，且以EGF-CP-HA組的表達(dá)量最高，表明外源性應(yīng)用重組人EGF能夠提高創(chuàng)面周緣部位TGF-β1的分泌[20]，進(jìn)而協(xié)同其他生長(zhǎng)因子促進(jìn)膠原的產(chǎn)生，減輕炎癥反應(yīng)，促進(jìn)組織修復(fù)，最終加速傷口創(chuàng)面的愈合。

膠原蛋白作為一種重要的生物材料，已廣泛應(yīng)用于化妝品和醫(yī)用生物材料領(lǐng)域。水產(chǎn)膠原蛋白沒有口蹄疫、瘋牛病等傳染性疾病的病原，具有良好的生物相容性、無毒性、低抗原性和良好的生物降解性[21]。狹鱈魚皮含有大量的膠原纖維，其中主要為Ⅰ型膠原，并含有特定的抗凍蛋白，可以作為生產(chǎn)較好膠原蛋白的原料。CP用于創(chuàng)面可以與血液中的血小板接觸發(fā)生生化反應(yīng)，產(chǎn)生血纖維，堵住傷口，減少出血;可以提高血紅蛋白含量、紅細(xì)胞數(shù)、紅細(xì)胞體積和血小板數(shù);還能刺激細(xì)胞分裂增殖、分化，促進(jìn)傷口愈合。因此，狹鱈魚皮是較好的膠原蛋白醫(yī)用生物材料的來源。

綜上所述，本研究將狹鱈魚皮CP和HA通過丙烯酸酐接枝處理后，加入重組人EGF，在溫和的條件下交聯(lián)成凝膠，并將其覆蓋于大鼠全層皮膚缺損創(chuàng)面，結(jié)果顯示，該水凝膠能通過促進(jìn)成纖維細(xì)胞增殖以及膠原蛋白、VEGF-α、TGF-β1的表達(dá)，對(duì)傷口愈合起到促進(jìn)作用，并減少瘢痕形成，其臨床應(yīng)用價(jià)值值得進(jìn)一步深入研究。

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（本文編輯 馬偉平）