牟斐斐　焦倩　杜希恂　畢明霞　姜宏

[摘要]目的探討縫隙連接蛋白43（Cx43）及其磷酸化蛋白在過表達(dá)α-突觸核蛋白（α-Syn）的帕金森病細(xì)胞模型表達(dá)及其意義。方法分別在SH-SY5Y細(xì)胞中過表達(dá)空載（空載組）、野生型α-Syn（WT α-Syn組）以及人突變型A53T α-Syn（A53T α-Syn組），應(yīng)用Western Blot技術(shù)檢測各組Cx43蛋白及磷酸化Cx43蛋白（p-Cx43）的表達(dá)。結(jié)果與空載組相比較，WT α-Syn組以及A53T α-Syn組的細(xì)胞內(nèi)Cx43蛋白表達(dá)增加（F=6.37，q=4.04、5.76，P<0.05），p-Cx43/Cx43升高，差異有顯著性（F=23.43，q=5.73、9.65，P<0.01）;與WT α-Syn組相比，A53T α-Syn組的細(xì)胞內(nèi)p-Cx43/Cx43升高（q=3.61，P<0.05）。結(jié)論Cx43及p-Cx43蛋白表達(dá)水平的改變可能參與了帕金森病的發(fā)病過程。

[關(guān)鍵詞]縫隙連接蛋白43;帕金森病;α突觸核蛋白

[中圖分類號]R742.5[文獻(xiàn)標(biāo)志碼]A[文章編號] 2096-5532（2019）04-0379-04

[ABSTRACT]ObjectiveTo investigate the expression and significance of connexin 43 （Cx43） and its phosphorylated form （p-Cx43） in Parkinson disease （PD） cell model with overexpression of α-Synuclein （α-Syn）. MethodsOverexpression of empty vector， wild-type α-Syn， and human mutant A53T α-Syn was performed in SH-SY5Y cells （named empty vector group， WT α-Syn group， and A53T α-Syn group， respectively）. Western Blot was used to determine the expression of Cx43 and p-Cx43 proteins. ResultsCompared with the empty vector group， the WT α-Syn group and A53T α-Syn group had significantly higher Cx43 expression and p-Cx43/Cx43 ratio （F=6.37，q=4.04-5.76，P<0.05;F=23.43，q=5.73-9.65，P<0.01）; the A53T α-Syn group had a significantly higher p-Cx43/Cx43 ratio than the WT α-Syn group （q=3.61，P<0.05）. ConclusionThe changes in Cx43 and p-Cx43 levels may be involved in the development of PD.

[KEY WORDS]connexin 43; Parkinson disease; alpha-synuclein

帕金森病（PD）是一種好發(fā)于中老年人的神經(jīng)退行性疾病[1-2]，其主要病理改變是中腦黑質(zhì)致密部（SNpc）多巴胺（DA）能神經(jīng)元的選擇性丟失，及殘存的神經(jīng)元內(nèi)形成α-突觸核蛋白（α-Syn）聚集為主的路易小體[3-4]。到目前為止，PD的病因尚未完全明確，但是α-Syn異常聚集參與了PD中DA能神經(jīng)元退行性病變過程[5-6]。縫隙連接（GJ）是將相鄰的兩個細(xì)胞的細(xì)胞膜上的連接小體對接形成的直徑約為1.5 nm的細(xì)胞通道，每個連接小體由6個相同或不同的桿狀的連接蛋白（Cx）構(gòu)成[7-9]。迄今為止，已經(jīng)發(fā)現(xiàn)的在人類中表達(dá)的Cx有20余種，其中在中樞神經(jīng)系統(tǒng)中表達(dá)的有13種[10]。大多數(shù)的Cx為磷蛋白并且處于不同的磷酸化水平，根據(jù)其分子質(zhì)量的差異而命名為Cx31、Cx32、Cx36、Cx37、Cx40、Cx43、Cx45、Cx46、Cx50和Cx56等[11-12]，其中細(xì)胞間分布最廣泛的是Cx43[13]。Cx43的磷酸化影響廣泛，它能夠影響GJ的通透性及門控特性等，從而對細(xì)胞間連接產(chǎn)生作用，進(jìn)而在體內(nèi)外影響生理或者病理過程[14-15]。大量研究表明，Cx43及其磷酸化可能參與了諸多疾病的發(fā)生及發(fā)展[16-17]。但是Cx43作為細(xì)胞間通訊的重要調(diào)節(jié)蛋白，對PD的作用尚未明確。本文研究選取具有DA能神經(jīng)元特性的SH-SY5Y細(xì)胞，過表達(dá)野生型α-Syn以及人突變型A53T α-Syn，通過檢測Cx43蛋白及磷酸化Cx43蛋白（p-Cx43）的表達(dá)，探討Cx43及p-Cx43在PD中的作用，從而闡明PD的發(fā)病機(jī)制，為藥物干預(yù)治療提供可能的作用靶點。

1材料和方法

1.1實驗細(xì)胞

本實驗選用的SH-SY5Y細(xì)胞購自中國科學(xué)院典型培養(yǎng)物保藏委員會細(xì)胞庫，其來自于人神經(jīng)母細(xì)胞瘤細(xì)胞，具有DA能神經(jīng)元特性。將其置于溫度37 ℃、含體積分?jǐn)?shù)0.05 CO2的培養(yǎng)箱中，使用含RPMI-1640（1∶1）、體積分?jǐn)?shù)0.2胎牛血清、10 g/L青霉素和鏈霉素混合液的完全培養(yǎng)液進(jìn)行培養(yǎng)。

1.2試劑

RPMI-1640（1∶1）培養(yǎng)液、胎牛血清和Opti-MEM Ⅰ培養(yǎng)液均購于Gibco公司，LipotamineTM2000、BCA蛋白試劑盒均購于Thermo公司，兔源 β-tubulin、Cx43、p-Cx43抗體均購于CST公司，兔源α-Syn抗體購于Abcam公司，辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔IgG二抗購于Absin公司，RIPA （strong） 裂解液、分離膠緩沖液、濃縮膠緩沖液和丙烯酰胺均購于康為公司，ECL試劑盒購于美國Millipore公司。

1.3實驗儀器

CO2培養(yǎng)箱購于Thermo Electron Corporation公司，倒置熒光顯微鏡購于Olympus公司，臺式低溫離心機(jī)（5417R）購于Eppendorf公司，電泳槽、電泳儀、電轉(zhuǎn)儀（濕轉(zhuǎn)）均購于BIO-RAD公司。

1.4過表達(dá)α-Syn的細(xì)胞模型制備

待培養(yǎng)瓶中細(xì)胞生長良好，將細(xì)胞以1×108/L的密度接種至6孔板中，待板中的細(xì)胞融合度達(dá)到70%～90%時進(jìn)行轉(zhuǎn)染。取5 μL LipotamineTM2000溶于150 μL Opti-MEM Ⅰ無血清培養(yǎng)基中，同時取2 μg含有綠色熒光標(biāo)簽質(zhì)粒GV230-EGFP（對照組，A組）、GV230-EGFP-WT-α-Syn（WT α-Syn組，B組）、GV230-EGFP-A53T-α-Syn（A53T α-Syn組，C組）溶于150 μL Opti-MEM Ⅰ無血清培養(yǎng)基中，分別混勻后，室溫靜置5 min。將質(zhì)粒和 LipotamineTM2000混合均勻，在無菌操作臺中靜置30 min。置于培養(yǎng)箱中培養(yǎng)4 h后，棄去含 LipofectamineTM2000-DNA 混合物的Opti-MEM Ⅰ無血清培養(yǎng)液，換為含血清、抗生素的完全培養(yǎng)基培養(yǎng)24 h。使用倒置熒光顯微鏡觀察質(zhì)粒轉(zhuǎn)染效率。

1.5Western Blot檢測α-Syn、 Cx43及p-Cx43蛋白表達(dá)水平

待細(xì)胞處理完畢后吸除培養(yǎng)基，用預(yù)冷的 PBS洗細(xì)胞3次，完全去除培養(yǎng)基，向每孔加入120 μL細(xì)胞裂解液，在冰上進(jìn)行裂解，靜置30 min后將細(xì)胞刮下轉(zhuǎn)移至冰上預(yù)冷的EP管中， 4 ℃、12 000 r/min離心20 min，吸取上清置于新的EP管中，采用BCA法測蛋白濃度。按每孔25 μg蛋白上樣，經(jīng)SDS-PAGE電泳后，電轉(zhuǎn)移到PVDF膜上，室溫下使用100 g/L脫脂奶粉封閉2 h，加入相應(yīng)的一抗（Cx43、p-Cx4 及α-Syn稀釋滴度均為1∶1 000;β-tubulin稀釋滴度為1∶10 000），4 ℃搖床孵育過夜后，使用TBST洗脫3次，用1∶10 000稀釋辣根過氧化物酶標(biāo)記的山羊抗兔二抗于室溫孵育1 h，TBST洗脫3次后，ECL發(fā)光液顯影，UVP凝膠成像系統(tǒng)成像，Image J軟件讀取目的條帶的灰度值，對α-Syn、Cx43及p-Cx43蛋白表達(dá)水平進(jìn)行分析。

1.6統(tǒng)計學(xué)方法

應(yīng)用SPSS 17.0及GraphPad Prism軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，計量資料結(jié)果以±s表示，組間比較采用單因素方差分析（One-Way ANOVA）。以P<0.05表示差異有統(tǒng)計學(xué)意義。

2結(jié)果

2.1成功構(gòu)建過表達(dá)α-Syn的SH-SY5Y細(xì)胞模型

將含GV230-EGFP、GV230-EGFP-WT-α-Syn和GV230-EGFP-A53T-α-Syn的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染至SH-SY5Y細(xì)胞24 h后，Western Blot檢測顯示，在過表達(dá)WT α-Syn和A53T α-Syn的SH-SY5Y細(xì)胞中，α-Syn的蛋白表達(dá)明顯增多（F=108.03，q=17.36、20.07，P<0.01）。見圖1、表1。

2.2過表達(dá)α-Syn后細(xì)胞內(nèi)Cx43及其磷酸化蛋白水平

Western Blot檢測顯示，與對照組相比，WT α-Syn組和A53T α-Syn組的細(xì)胞內(nèi)Cx43蛋白表達(dá)增加（F=6.37，q=4.04、5.76，P<0.05），p-Cx43/Cx43水平明顯升高（F=23.43，q=5.73、9.65，P<0.01）;與WT α-Syn組相比，A53T α-Syn組的細(xì)胞內(nèi)Cx43蛋白表達(dá)差異無統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）， p-Cx43/Cx43水平升高，差異有顯著性（q=3.61，P<0.05）。見圖2，表1。

3討論

PD的病理表現(xiàn)為SNpc DA能神經(jīng)元選擇性缺失，并且形成α-Syn聚集為主的路易小體[3]，α-Syn異常聚集可能參與了DA能神經(jīng)元退行性病變的過程[5-6，18]。在腦內(nèi)，各細(xì)胞間都存在著GJ，迄今為止發(fā)現(xiàn)了3個連接蛋白家族：Cx、pannexin和innexin[19]。其中，以Cx家族研究最為廣泛[9]，在細(xì)胞中表達(dá)最普遍及研究最多的是Cx43[13]。中樞神經(jīng)系統(tǒng)中Cx43廣泛分布在神經(jīng)元以及角質(zhì)細(xì)胞中[20]，它首先在細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)核糖體上合成，隨后被轉(zhuǎn)運到高爾基體中，最后在細(xì)胞膜上聚集形成了GJ[21-22]，從而起到及時清除神經(jīng)元周圍聚集的各類代謝產(chǎn)物以及減弱代謝產(chǎn)物對細(xì)胞自身損傷的作用[23]。正常情況下，細(xì)胞間可通過Cx43對DA產(chǎn)生一定的保護(hù)支持作用，而在腦卒中、癲癇等病理情況下會出現(xiàn)Cx43的異常表達(dá)[17]。Cx43蛋白及其組成的GJ在腦內(nèi)形成了細(xì)胞傳遞信號的重要通道，參與調(diào)控離子通道的啟閉，并且參與了多種神經(jīng)系統(tǒng)疾病的發(fā)生[24-25]。在細(xì)胞的生命周期中，Cx43發(fā)生著不同的磷酸化[22，26]，并且磷酸化是Cx43最主要的共價修飾[27]。Cx43的C端是磷酸化作用的區(qū)域，易受到大量絲氨酸（S）和酪氨酸激酶和磷酸酶的調(diào)節(jié)，其中包括蛋白激酶A（PKA）、蛋白激酶C（PKC）、酪蛋白激酶1（CK1）以促分裂原活化蛋白激酶（MAPK）等[28-31]，這些激酶和磷酸酶在其生命周期的所有階段產(chǎn)生多種作用，包括從內(nèi)質(zhì)網(wǎng)到高爾基體及質(zhì)膜的轉(zhuǎn)運、GJ的組裝及門控、GJ的降解和細(xì)胞周期調(diào)節(jié)[14，32-34]，影響Cx43正常生理功能及細(xì)胞間通訊，進(jìn)而影響各種疾病的發(fā)生與發(fā)展。

本文研究結(jié)果顯示，與空載組相比，WT α-Syn組以及A53T α-Syn組SH-SY5Y細(xì)胞的Cx43蛋白以及p-Cx43/Cx43水平均明顯升高，且A53T α-Syn組p-Cx43/Cx43水平與WT α-Syn組相比明顯升高，說明Cx43及p-Cx43/Cx43水平隨著PD病情進(jìn)展而增加，Cx43作為一種重要的調(diào)節(jié)蛋白，可能參與了PD的發(fā)病過程，為闡明PD的發(fā)病機(jī)制提供了實驗依據(jù)，進(jìn)而為藥物干預(yù)PD病程提供可能的作用靶點。

綜上所述，隨著PD病程的發(fā)展，Cx43蛋白及其磷酸化蛋白的表達(dá)水平發(fā)生異常，但是Cx43蛋白磷酸化對PD病程的影響還需進(jìn)一步研究。

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（本文編輯 黃建鄉(xiāng)）