崔嘉晗　趙明　牛海濤　王新生

[摘要]目的探討生物信息學分析對乳頭狀腎細胞癌（PRCC）差異表達基因和通路的意義。方法分析癌癥基因組圖譜（TCGA）數(shù)據(jù)庫中PRCC的RNA測序數(shù)據(jù)，應用生物信息學分析篩選差異表達基因，并對候選基因依據(jù)功能和信號通路進行富集分析。結果 分析TCGA中PRCC和癌旁正常組織的RNA測序數(shù)據(jù)，篩選4 639個差異表達的基因。對篩選差異表達基因進行基因本體及代謝通路富集分析后得到818個基因本體術語（GO terms）和110條信號通路術語（pathway terms）。結論 運用edgeR包以及基因本體及信號通路分析，篩選了PRCC與癌旁正常組織差異表達基因及富集的信號通路。

[關鍵詞]癌，腎細胞;基因本體;信號通路;遺傳關聯(lián)研究;計算生物學

[中圖分類號]R730.26[文獻標志碼]A[文章編號] 2096-5532（2019）04-0402-05

[ABSTRACT]ObjectiveTo explore the significance of bioinformatics in the analysis of differentially expressed genes and pathways in papillary renal cell carcinoma （PRCC）.MethodsThe RNA sequencing data of PRCC in the Cancer Genome Atlas database （TCGA） were analyzed. Differentially expressed genes were identified by bioinformatics analysis， and candidate genes were then enriched according to their functions and the signaling pathways in which they were involved.ResultsRNA sequencing data of PRCC and adjacent normal tissues in TCGA were analyzed and 4639 differentially expressed genes were screened out. After enrichment analyses of gene ontology and metabolic pathways for these differentially expressed genes，818 gene ontology terms and 110 pathway terms were obtained.ConclusionUsing the edgeR package and gene ontology and pathway analyses， the differentially expressed genes and enriched signaling pathways between PRCC and adjacent normal tissues were screened out.

[KEY WORDS]carcinoma， renal cell; gene ontology; signaling pathway; genetic association studies; computational biology

腎細胞癌（RCC）是最常見的腎臟癌癥，占所有成人惡性腫瘤的2%～3%[1-2]。有20%～30%的病人被診斷為RCC時已經發(fā)現(xiàn)遠處轉移。此外，另有20%的病人接受腎切除術后會復發(fā)并發(fā)展成為轉移性RCC [3-4]。轉移性RCC病人生存率低，預后極差[5-6]。乳頭狀腎細胞癌（PRCC）是第二常見的RCC類型，占所有RCC的10%～20%[1]。PRCC可根據(jù)組織病理學特征進一步分為兩種主要亞型[7-9]。癌癥基因組圖譜（TCGA）是臨床信息和基因測序數(shù)據(jù)的大型綜合集合。既往RCC研究主要以透明細胞RCC為主，缺乏PRCC相關研究。為了探究PRCC涉及的信號傳導途徑和驅動基因并且進行系統(tǒng)分析，本文利用TCGA進行數(shù)據(jù)挖掘，篩選PRCC中差異表達基因及富集的信號通路?，F(xiàn)將結果報告如下。

1材料與方法

1.1實驗樣本信息收集

于 TCGA 數(shù)據(jù)庫（https：//cancergenome.nih.gov/）中收集與PRCC相關的RNA的測序數(shù)據(jù)（Level3），包括289例PRCC組織和32例癌旁非癌腎組織。

1.2篩選PRCC中異常表達的mRNAs

利用genecode數(shù)據(jù)庫篩選mRNA測序數(shù)據(jù)，共涵蓋20 271個mRNA數(shù)據(jù)。隨后以R語言包edgeR計算異常表達的mRNAs（差異倍數(shù)>2并且錯誤發(fā)現(xiàn)率（FDR）校正后P值<0.01）。排除超過75%的樣品中表達<2的mRNA。

1.3基因本體分析和富集途徑分析

使用在線數(shù)據(jù)庫DAVID（https：//david.ncifcrf.gov/）進行差異基因的基因本體分析和富集途徑分析。基因本體分析和富集途徑分析均以P值<0.05作為臨界標準。

1.4基因集富集分析

基因組富集分析使用Java GSEA軟件。基因組富集分析軟件及注釋基因集均由Broad研究所網(wǎng)站（http：//www.broadinstitute.org/gsea/index.jsp）下載?；蚣疨<0.05并且FDR<0.25被認為具有統(tǒng)計學差異。

1.5統(tǒng)計學處理

使用R語言（版本號3.5.1）中的edgeR包篩選PRCC和癌旁正常組織中不同表達的基因，篩選標準為FDR校正后P值<0.01和差異倍數(shù)>2的基因。對于GO和KEGG途徑分析，其中P<0.05的GO術語或途徑是有統(tǒng)計學差異的。

2結果

2.1癌與癌旁配對樣本差異表達的mRNA

對PRCC標本及癌旁正常組織的mRNA測序數(shù)據(jù)進行差異基因分析（差異倍數(shù)>2并且FDR校正后P值<0.01），篩選4 639個差異表達的基因，在樣品中2 638個mRNA轉錄物被上調并且2 001個mRNA轉錄物被下調?；鹕綀D見圖1。其中，PRCC及其癌旁正常組織中50種最具有表達差異的mRNA（從倍數(shù)變化最大到最小列出）見表1。

利用在線基因功能分類工具（https：//david.ncifcrf.gov/gene2gene.jsp），基于功能相似性對篩選出的50種最具有表達差異的基因進行分組。上調組篩選出1個功能相關基因組，基因為SIGLEC8、CNTN6、VSTM2A、VSTM2L。下調組篩選出2個功能相關基因組，其中一個基因組為SLC34A3、SCNN1B、SLC22A8、SLC9A4、SLC12A1，另外一個基因組為AQP2、MUC15、SLC22A8、SLC14A2。檢索相關文獻，我們發(fā)現(xiàn)SIGLEC8表達的增強預測了PRCC病人的不良預后[10]。另外，MUC15在PRCC中的表達降低[11]，但是其余大部分基因在PRCC中的作用仍不明確。

2.2差異表達基因的基因本體分析

利用在線數(shù)據(jù)庫DAVID分析差異表達基因，以P<0.05作為臨界標準?；虮倔w分析分為3個功能組：分子功能組、生物過程組和細胞成分組。在生物過程組中，上調的基因主要富集于信號轉導、免疫反應、炎癥反應等，下調基因主要富集于信號轉導、細胞黏附等。在細胞成分組中，上調基因主要富集在膜的組成部分、質膜、細胞外區(qū)域等，下調基因主要富集于膜的組成部分、質膜等。在分子功能組中，上調基因主要富集于鈣離子結合、受體結合等，下調基因主要富集于鈣離子結合、蛋白質同源二聚化活性等。其中，PRCC標本轉錄組上調基因最顯著富集的5個基因本體術語見圖2A～C，下調基因最顯著富集的5個基因本體術語見圖2D～F。

2.3信號通路富集分析

使用KEGG PATHWAY在線網(wǎng)站進行差異基因的功能和信號傳導途徑富集。上調的基因主要富集于細胞因子-細胞因子受體相互作用、神經活性配體-受體相互作用等，下調的基因主要富集于代謝途徑、神經活性配體-受體相互作用、癌癥的途徑等。見圖2G、H。

2.4基因集富集分析

基因集富集分析通過關注具有共同生物功能、染色體定位或調節(jié)的基因組，從而篩選出可能與疾病表型相關的過量表達的基因或蛋白質。我們使用KEGG基因組作為基因集對PRCC及其癌旁正常組織的轉錄組數(shù)據(jù)進行基因集富集分析。確定了7個上調途徑以及12個下調途徑。見圖3A、B。

3討論

在過去的幾十年中，已經進行了大量的基礎和臨床研究，揭示PRCC形成和發(fā)展的原因和潛在機制[12-15]。已報道PRCC具有代表性遺傳基因突變和失調的途徑包括：MET基因突變、HIPPO途徑、NRF2途徑、染色質修飾基因突變等[9]。本研究應用生物信息分析技術深入分析TCGA數(shù)據(jù)集，并在第一步中確定了4 639個差異表達的基因（2 638個上調和2 001個下調）。在第二步中，對篩選差異表達基因進行基因本體分析及代謝通路分析，本研究中篩選的上調基因主要富集在信號轉導、免疫反應、炎癥反應、膜的組成部分和鈣離子結合等途徑中;下調基因主要富集在信號轉導、細胞黏附、膜的組成部分和鈣離子結合等途徑中。改變的基因和信號轉導途徑為理解PRCC的分子基礎提供相關數(shù)據(jù)，從細胞通路及代謝途徑更好揭示PRCC內在分子機制，探究預后的生物標志物及治療靶點。既往研究已提示上皮細胞黏附及其活化分子在高級別RCC中的過度表達可能是預后的有用標志[16]。在PRCC發(fā)生骨轉移病人的組織樣本和原代細胞中，檢測到鈣離子受體表達明顯增強[17-18]。本研究中，同樣觀察到鈣離子結合途徑發(fā)生明顯改變，與有關文獻報道相符合。以前研究表明，腫瘤的發(fā)生與炎癥狀態(tài)有密切關系[19]，這與本研究顯示免疫反應、炎癥反應相關基因集在PRCC上調具有一致性。此外，既往研究發(fā)現(xiàn)腫瘤可建立腫瘤內免疫抑制環(huán)境，以支持其生長并促進免疫逃避[20-21]，本研究結果同樣顯示腫瘤內免疫反應的改變。腫瘤內的代謝物水平的增加可以促進癌癥的發(fā)生和發(fā)展，可導致細胞信號、酶活性或代謝通量的改變[22]。散發(fā)性和家族性2型PRCC檢測到增強的有氧糖酵解，并且具有抗氧化反應的細胞表型[23-24]。

本研究第三步中，利用基因集富集分析方法分析篩選的差異表達基因的代謝途徑，結果表明P53信號通路和DNA修復途徑在PRCC中上調。DNA損傷的修復在維持基因組完整性方面起著關鍵作用[25]。多種常規(guī)DNA修復途徑的多功能DNA修復中心經常在癌癥中被改變[26]。有研究表明，DNA損傷修復途徑中不利等位基因數(shù)量的增加，會增加RCC風險[27]。不過也有證據(jù)表明，DNA修復基因多態(tài)性可能不會影響RCC的易感性，但可能會導致DNA修復能力的改變，從而影響腫瘤的進展[28]。腫瘤抑制基因p53是人類癌癥中最常見的突變基因，在細胞凋亡、基因組穩(wěn)定性和抗血管生成中發(fā)揮作用，可以介導RCC細胞周期停滯和細胞凋亡[29]。研究表明，P53陽性表達與RCC病人預后不良和晚期臨床病理特征相關，這表明P53是一個潛在有效的治療靶點[30]。

綜上所述，利用生物信息學分析，我們共篩選了4 639個候選基因，其富集于信號轉導、鈣離子結合、細胞因子-細胞因子受體相互作用、代謝途徑、P53信號通路和DNA修復等途徑。這些發(fā)現(xiàn)可提高我們對PRCC病因和潛在分子事件的理解，這些候選基因和途徑有可能成為PRCC的治療靶點。

[參考文獻]

[1]COURTHOD G， TUCCI M， MAIO M D， et al. Papillary renal cell carcinoma： a review of the current therapeutic landscape [J].? Crit Rev Oncol Hematol， 2015，96（1）：100-112.

[2]SIEGEL R L， MILLER K D. Cancer statistics， 2019[J].? CA-Cancer J Clin， 2019，96（1）：7-34.

[3]LJUNGBERG B， CAMPBELL S C，CHO H Y， et al. The epidemiology of renal cell carcinoma[J].? European Urology， 2011，60（4）：615-621.

[4]KING S C， POLLACK L A， LI J， et al. Continued increase in incidence of renal cell carcinoma， ??? especially in young patients and high grade disease： United States 2001 to 2010[J].? J Urol， ??? 2014，191（6）：1665-1670.

[5]SHUCH B， HAHN A W， AGARWAL N. Current treatment landscape of advanced papillary renal cancer[J].? J Clin Oncol， 2017，35（26）：2981-2983.

[6]CONNOR W J， DONSkOV F， FRACCON A P， et al. Characterizing the outcomes of metastatic papillary renal cell carcinoma[J].? Cancer Medicine， 2017，6（5）：902-909.

[7]ALGABA F， AKAZA H， LOPEZ-BELTRAN A， et al. Current pathology keys of renal cell carcinoma[J].? Eur Urol， 2011，60（4） ：634-643.

[8]KLATTE T， PANTUCK A J， SAID J W， et al. Cytogenetic and molecular tumor profiling for type 1 and type 2 papillary renal cell carcinoma[J].? Clin Cancer Res， 2009，15（4）：1162-1169.

[9]LINEHAN W M， SPELLMAN P T， RICKETTS C J， et al. Comprehensive molecular characterization of papillary renal-cell carcinoma[J].? N Engl J Med， 2016，374（2） ：135-145.

[10]OU C， LIU L， WANG J， et al. Enhancement of Siglec-8 expression predicts adverse prognosis in patients with clear cell renal cell carcinoma [J].? Urol Oncol， 2017，35（10）：607-607.

[11]KING R J， YU F， SINGH P K. Genomic alterations in mucins across cancers[J].? Oncotarget， 2017，8（40）：67152-67168.

[12]ALBIGES L， GUEGAN J， FORMAL A L， et al. MET is a potential target across all papillary renal cell carcinomas： result from a large molecular study of pRCC with CGH array and matching gene expression array[J].? Clin Cancer Res， 2014，20（13）：3411-3421.

[13]LIU K， REN Y， PANG L， et al. Papillary renal cell carcinoma： a clinicopathological and whole-genome exon sequencing study[J].? Int J Clin Exp Pathol， 2015，8（7）：8311-8335.

[14]KOVAC M， NAVAS C， HORSWELL S， et al. Recurrent chromosomal gains and heterogeneous driver mutations characterise papillary renal cancer evolution[J].? Nat Commun， 2015，6（1）：6336.

[15]DURINCK S， STAWISKI E W， PAVIA-JIMENEZ A， et al. Spectrum of diverse genomic alterations define non-clear cell renal carcinoma subtypes[J].? Nat Genet， 2015，47（1）：13-21.

[16]ZIMPFER A， MARUSCHKE M， REHNS， et al. Prognostic and diagnostic implications of epithelial cell adhesion/activating molecule（EpCAM）expression in renal tumours：a retrospective clinicopathological study of 948 cases using tissue microarrays[J].? BJU Int， 2014，114（2）：296-302.

[17]BRENNER W， HABER T， JUNKER K， et al. Bone metastasis by renal cell carcinoma. Importance of Calcium and calcium-sensing receptor[J].? Urologe A， 2015，54（6）：839-843.

[18]FREES S， BREUKSCH I， HABER T， et al. Calcium-sensing receptor（CaSR）promotes development of bone metastasis in renal cell carcinoma[J].? Oncotarget， 2018，9（21）：15766-15779.

[19]KORNILUK A， KOPER O， KEMONA H， et al. From inflammation to cancer[J].? Ir J Med Sci， 2017，186（1）：57-62.

[20]BUSSE A， ASEMISSEN A， NONNENMACHER A， et al. Systemic immune tuning in renal cell carcinoma：favorable prognostic impact of TGF-beta1 mRNA expression in perip-

heral blood mononuclear cells[J].? J Immunother， 2011，34（1）：113-119.

[21]BINNEWIES M， ROBERTS E W， KERSTEN K， et al. Understanding the tumor immune microenvironment （TIME） for effective therapy[J].? Nature Medicine， 2018，24（5）：541-550.

[22]SULLIVAN L B， GUI D Y， VANDERHEIDEN M G. Altered metabolite levels in cancer：?? implications for tumour biology and cancer therapy[J].? Nat Rev Cancer， 2016，16（11）：680-693.

[23]OOI A， WONG J C， PETILLO D， et al. An antioxidant response phenotype shared between hereditary and sporadic type 2 papillary renal cell carcinoma[J].? Cancer Cell， Oct 18， 2011，20（4）：511-523.

[24]SRINIVASAN R， RICKETTS C J， SOURBIER C， et al. New strategies in renal cell carcinoma：targeting the genetic and metabolic basis of disease[J].? Clin Cancer Res， 2015，21（1）：10-17.

[25]MARGULIS V， LIN J， YANG H， et al. Genetic susceptibility to renal cell carcinoma：the role of DNA double-strand break repair pathway[J].? Cancer Epidemiol Biomarkers Prev， 2008，17（9）：2366-2373.

[26]DIETLEIN F， THELEN L， REINHARDT H C. Cancer-specific defects in DNA repair pathways ??? as targets for personalized therapeutic approaches [J].? Trends Genet， 2014，30（8），326-339.

[27]LIN J， PU X， WANG W， et al. Case-control analysis of nucleotide excision repair pathway and ??? the risk of renal cell carcinoma[J].? Carcinogenesis， 2008，29（11）：2112-2119.

[28]SAKANO S， HINODA Y， OKAYAMA N， et al.The association of DNA repair gene polymorphisms with the development and progression of renal cell carcinoma[J].? Ann Oncol， 2007，18（11）：1817-1827.

[29]LIU Q J， SHEN H L， LIN J， et al. Synergistic roles of p53 and HIF1alpha in human renal cell ??? carcinoma-cell apoptosis responding to the inhibition of mTOR and MDM2 signaling ?? pathways[J].? Drug Des Devel Ther， 2016，10（1）：745-755.

[30]WANG Z， PENG S， JIANG N， et al. Prognostic and clinicopathological value of p53 expression in renal cell carcinoma：a meta-analysis[J].? Oncotarget， 2017，8（60）：102361-102370.

（本文編輯 于國藝）