張名媛 韋東力 司景磊 郭曉萍 崔悅悅 瞿秋紅 綦文晶 蘭干球 郭亞芬

摘要：【目的】克隆廣西巴馬小型豬載脂蛋白A1（ApoA1）基因并進(jìn)行生物信息學(xué)分析，為后續(xù)開展ApoA1基因研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為制作廣西巴馬小型豬動(dòng)脈粥樣硬化疾病模型打下基礎(chǔ)。【方法】以提取的廣西巴馬小型豬肝臟組織總RNA為模板，運(yùn)用RT-PCR克隆廣西巴馬小型豬ApoA1基因序列，以實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）檢測ApoA1基因在廣西巴馬小型豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織中的表達(dá)情況，并利用MegAlign、ProtParam、SOPMA、NetPhos、SignalP和SWISS-MODEL等在線分析軟件對廣西巴馬小型豬ApoA1基因進(jìn)行生物信息學(xué)分析及構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹?！窘Y(jié)果】廣西巴馬小型豬ApoA1基因編碼區(qū)（CDS）序列長795 bp，與普通豬ApoA1基因序列的同源性為99.9%，僅第630處有1個(gè)堿基發(fā)生同義突變。ApoA1基因在廣西巴馬小型豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織中均有表達(dá)，且以肝臟中的相對表達(dá)量最高、脾臟中的相對表達(dá)量最低。廣西巴馬小型豬ApoA1由264個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其分子式為C1343H2136N376O409S5，蛋白分子量為30254.31 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為5.47，屬于親水性蛋白，存在跨膜結(jié)構(gòu)，不存在信號(hào)肽，有18處磷酸化位點(diǎn)（絲氨酸磷酸化位點(diǎn)有10處，蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)有6處，絡(luò)氨酸磷酸化位點(diǎn)有2處）。廣西巴馬小型豬ApoA1的二級(jí)結(jié)構(gòu)中，α-螺旋占79.92%，β-折疊占2.65%，無規(guī)則卷曲占11.12%，延伸鏈占6.31%，屬于全α類蛋白。廣西巴馬小型豬ApoA1氨基酸序列與普通豬的同源性最高，達(dá)99.6%;由基于ApoA1氨基酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也可看出，廣西巴馬小型豬與普通豬的親緣關(guān)系最近?！窘Y(jié)論】廣西巴馬小型豬ApoA1基因保守性強(qiáng)，以在肝臟中的表達(dá)量最高，是廣西巴馬小型豬抗動(dòng)脈粥樣硬化的重要因子，通過敲除該基因可制作廣西巴馬小型豬動(dòng)脈粥樣硬化疾病模型。

關(guān)鍵詞： 廣西巴馬小型豬;ApoA1基因;克隆;生物信息學(xué)分析;動(dòng)物模型

中圖分類號(hào)： S828.89? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ? ?文獻(xiàn)標(biāo)志碼： A 文章編號(hào)：2095-1191（2019）06-1339-08

Abstract：【Objective】The aim of this study was to clone the apoliprotein A1（ApoA1） gene of Guangxi Bama mini-pig， and analyze the biological information of ApoA1 gene， which would enrich the basic data for the follow-up study of ApoA1 gene and lay a foundation for the production of the atherosclerosis disease model of Guangxi Bama mini-pig.【Method】Total RNA extracted from the heart and liver of Guangxi Bama mini-pig was as template， and the sequence of ApoA1 gene was cloned by RT-PCR. The expression of ApoA1 gene in heart， liver， spleen， lung and kidney of Guangxi Bama mini-pig was detected by real-time fluorescence quantitative（qPCR）. Online analysis softwares including MegAlign， ProtParam， SOPMA， NetPhos， SignalP and SWISS-MODEL were used to analyze the bioinformatics of ApoA1 gene and construct phylogenetic tree. 【Result】The length of coding sequence（CDS） region of ApoA1 gene of Guangxi Bama mini-pig was 795 bp and the homology was 99.9% compared with the ApoA1 gene sequence of pigs with a synonymy mutation on one base at the 630 position. The ApoA1 gene was expressed in heart， liver， spleen， lung and kidney of Guangxi Bama mini-pig with the highest expression in liver and the lowest expression in spleen.The molecular formula of ApoA1 gene encoding 264 amino acid residues in Guangxi Bama mini-pig was C1343H2136N376O409S5， the molecular weight was 30254.31 Da， and the theoretical pI was 5.47， belonging to hydrophilic protein. There was transmembrane structure， no signal peptide. There were 18 phosphorylation sites， including 10 sites of serine， 6 sites of threonine and 2 sites of tyrosine. The secondary structure of coding protein belonged to all-alpha protein， which consisted of α-helix， β-fold， random coil and extended strand， accounting for 79.92%， 2.65%， 11.12% and 6.31%， respectively. It was found that the homology of ApoA1 amino acid sequence between Guangxi Bama mini-pig and ordinary pig was the highest（99.6%）. According to phylogenetic tree based on ApoA1 amino acid sequence homology， Guangxi Bama mini-pig had the closest genetic relationship with pig. 【Conclusion】The sequence of ApoA1 gene in Guangxi Bama mini-pig is strongly conservative and expresses the highest in liver. It is an important factor of anti-atherosclerosis in Guangxi Bama mini-pig. The model of atherosclerotic disease in Guangxi Bama mini-pig can be produced by knocking out the ApoA1 gene.

Key words： Guangxi Bama mini-pig; ApoA1 gene; cloning; bioinformatics analysis; animal model

0 引言

【研究意義】動(dòng)脈粥樣硬化是心腦血管疾病中非常嚴(yán)重的一種疾病，但其致病機(jī)理尚未完全明確（陳東和嚴(yán)激，2010）。載脂蛋白A1（Apoliprotein A1，ApoA1）是高密度脂蛋白（High density lipoprotein，HDL）的主要組成部分，能激活卵磷脂膽固醇脂酰轉(zhuǎn)移酶（Lecithin-cholesterol acyltransferase，LCAT），參與膽固醇的逆轉(zhuǎn)運(yùn)，是重要的抗動(dòng)脈粥樣硬化因子（田迪，2013;湯磊樂等，2017），即ApoA1特異性自身抗體在心血管疾病中具有重要價(jià)值（Chistiakov et al.，2016）。因此，研究廣西巴馬小型豬ApoA1基因及其調(diào)控機(jī)理，可進(jìn)一步豐富ApoA1基因的基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，并為制作廣西巴馬小型豬動(dòng)脈粥樣硬化疾病模型打下基礎(chǔ)?！厩叭搜芯窟M(jìn)展】血漿中脂蛋白的蛋白部分稱為載脂蛋白，ApoA1是載脂蛋白的一種，占蛋白總量的60%～70%（Heinecke，2013;劉培彬等，2014）。ApoA1主要存在于血漿中，其密度為1.063～1.210 g/mL（雷蕾和陳麗，2011），缺乏ApoA1會(huì)導(dǎo)致低HDL血癥。有研究證實(shí)，ApoA1水平與冠脈病變呈負(fù)相關(guān)，可能具有延緩冠脈病變進(jìn)展的作用，因此可用于預(yù)測冠脈病變進(jìn)展風(fēng)險(xiǎn)（湯磊樂等，2017），其反義轉(zhuǎn)錄本（Apoliprotein A1 Antisense transcript，ApoA1-AS）是診斷冠狀動(dòng)脈疾病的新生物標(biāo)志物（Zhang et al.，2019）。目前，已有研究報(bào)道了人類、黃鱔和鵝的ApoA1基因序列及其在各物種間的核苷酸序列結(jié)構(gòu)差異（麻延峰等，2015;闞延澤等，2016）。關(guān)于ApoA1基因的表達(dá)，張旭等（2011）研究表明，ApoA1轉(zhuǎn)基因小鼠的血液、腎臟、脾臟、肝臟、心臟和血管等組織中均有ApoA1基因表達(dá);闞延澤等（2016）、趙佳福等（2018）研究證實(shí)，ApoA1基因在黃鱔和從江香豬的肝臟中表達(dá)量最高。在生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)性研究中，已有學(xué)者分析了ApoA1基因多態(tài)性與兔、雞和鵝生產(chǎn)性狀間的關(guān)聯(lián)性，并驗(yàn)證其作為分子育種候選基因的可行性，即可開發(fā)成一種輔助選擇遺傳標(biāo)記（萬潔，2008;熊婷，2012;麻延峰等，2015）。張晶（2012）在篩選分析與豬脂肪沉積相關(guān)的關(guān)鍵基因時(shí)也發(fā)現(xiàn)有ApoA1基因;趙佳福等（2017）對從江香豬ApoA1基因進(jìn)行亞細(xì)胞定位，發(fā)現(xiàn)ApoA1基因的表達(dá)主要集中在細(xì)胞外基質(zhì)中，該結(jié)論為人類因肥胖引起相關(guān)疾病的研究奠定了基礎(chǔ)。【本研究切入點(diǎn)】廣西巴馬小型豬是在巴馬香豬的基礎(chǔ)上培育出的實(shí)驗(yàn)動(dòng)物品系，具有體型矮小、遺傳相似性高、與人類相近且遺傳穩(wěn)定性強(qiáng)等特點(diǎn)，是作為實(shí)驗(yàn)動(dòng)物模型的理想材料（李芳芳等，2014;李龍等，2017;Wu et al.，2018;Yan et al.，2018），且諸多基因信息已被深入發(fā)掘（吳丹等，2013;宋少銳等，2014;申玉建等，2017;張廣杰等，2018），但至今未見廣西巴馬小型豬ApoA1基因克隆及序列分析的相關(guān)文獻(xiàn)報(bào)道。【擬解決的關(guān)鍵問題】從廣西巴馬小型豬肝臟中克隆出ApoA1基因，并應(yīng)用在線生物信息軟件對其進(jìn)行分析學(xué)分析，為后續(xù)開展ApoA1基因研究提供基礎(chǔ)數(shù)據(jù)，同時(shí)為制作廣西巴馬小型豬動(dòng)脈粥樣硬化疾病模型打下基礎(chǔ)。

1 材料與方法

1. 1 試驗(yàn)材料

從廣西大學(xué)廣西巴馬小型豬繁育中心采集廣西巴馬小型豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟等組織樣品，迅速移到液氮中速凍后置于-80 ℃冰箱保存?zhèn)溆谩aq DNA聚合酶購自南京諾唯贊生物科技有限公司;Biospin膠回收試劑盒購自杭州博日科技有限公司;大腸桿菌DH5α感受態(tài)細(xì)胞購自北京全式金生物技術(shù)有限公司;瓊脂糖（Agrose）購自Biowest公司;胰蛋白胨和酵母浸出物購自德國OXIDO公司;氯化鈉、異丙醇和無水乙醇購自天津市永大化學(xué)試劑有限公司;氨芐青霉素購自北京天根生化科技（北京）有限公司;乙二胺四乙酸二鈉（EDTA-2Na）購自山東博盛生物科技有限公司;TRIzol試劑、反轉(zhuǎn)錄試劑盒和SYBR? Premix Ex TaqTM II購自TaKaRa公司。

1. 2 引物設(shè)計(jì)與合成

通過GenBank檢索從NCBI已公布的豬基因序列中尋找ApoA1基因序列（登錄號(hào)NP_999563.1），經(jīng)比對分析最終獲得廣西巴馬小型豬ApoA1相關(guān)基因片段，使用Oligo 6.22設(shè)計(jì)可用于ApoA1基因克隆及進(jìn)行實(shí)時(shí)熒光定量PCR（qPCR）分析的特異引物，委托北京六合華大基因科技有限公司合成，引物序列信息詳見表1。

1. 3 RNA提取

采用TRIzol法提取廣西巴馬小型豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織的總RNA，以核酸儀檢測RNA的濃度和純度，并用1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測其完整性。

1.4 cDNA合成

以廣西巴馬小型豬肝臟組織總RNA為模板，參照TransScript First-Strand cDNA Synthesis Supermix反轉(zhuǎn)錄說明合成cDNA，用于后續(xù)基因克隆。

1. 5 目的基因片段擴(kuò)增與驗(yàn)證

以廣西巴馬小型豬肝臟組織cDNA為模板進(jìn)行PCR擴(kuò)增，反應(yīng)體系20.0 μL：cDNA模板2.0 μL，ApoA1-F/ApoA1-R引物（10 μmol/L）各1.0 μL，Taq DNA聚合酶（5 U/μL）10.0 μL，ddH2O 6.0 μL。擴(kuò)增程序：95 ℃預(yù)變性5 min;95 ℃ 30 s，55 ℃ 30 s，72 ℃ 1 min，進(jìn)行34個(gè)循環(huán);72 ℃延伸5 min。PCR產(chǎn)物采用1.0%瓊脂糖凝膠電泳進(jìn)行檢測，切膠回收后克隆至pMD18-T載體，然后轉(zhuǎn)化DH5α感受態(tài)細(xì)胞，挑取陽性克隆進(jìn)行菌液PCR驗(yàn)證并送至深圳華大基因股份有限公司測序。

1. 6 qPCR檢測分析

以廣西巴馬小型豬的心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織RNA為模板，參照PrimeScript RT Reagent Kit with gDNA Eraser（Perfect Real Time）試劑盒說明進(jìn)行qPCR檢測，分析廣西巴馬小型豬ApoA1基因在各臟器組織中的表達(dá)情況。

1. 7 生物信息學(xué)分析

利用MegAlign、ProtParam、SOPMA、NetPhos、SignalP、SWISS-MODEL等在線分析軟件對廣西巴馬小型豬ApoA1基因及其編碼蛋白的理化性質(zhì)、蛋白磷酸化位點(diǎn)、前體蛋白信號(hào)肽、結(jié)構(gòu)域、二級(jí)及三級(jí)結(jié)構(gòu)等進(jìn)行預(yù)測分析，并基于ApoA1氨基酸序列同源性構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹。

2 結(jié)果與分析

2. 1 廣西巴馬小型豬ApoA1基因克隆及序列分析結(jié)果

以廣西巴馬小型豬肝臟組織cDNA為模板、ApoA1-F和ApoA1-R為引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增，擴(kuò)增產(chǎn)物經(jīng)1.0%瓊脂糖凝膠電泳檢測，發(fā)現(xiàn)在800 bp附近有一條單一、明亮的條帶（圖1），與預(yù)期結(jié)果相符。利用MegAlign對擴(kuò)增獲得的廣西巴馬小型豬ApoA1基因與普通豬相應(yīng)基因序列（登錄號(hào)NP-999563.1）進(jìn)行比對分析，結(jié)果發(fā)現(xiàn)廣西巴馬小型豬ApoA1基因編碼區(qū)（CDS）序列長795 bp，與普通豬ApoA1基因序列的同源性為99.9%。相對于普通豬，廣西巴馬小型豬ApoA1基因序列第630處的堿基發(fā)生突變（圖2），導(dǎo)致密碼子CTA突變?yōu)镃TG。由于密碼子具有簡并性的特點(diǎn)，廣西巴馬小型豬ApoA1氨基酸序列與普通豬相比并未發(fā)生改變，即該基因突變屬于同義突變。

2. 2 廣西巴馬小型豬ApoA1基因在各臟器組織中的表達(dá)情況

采用qPCR對廣西巴馬小型豬心臟、肝臟、脾臟、肺臟和腎臟組織中的ApoA1基因表達(dá)情況進(jìn)行檢測，結(jié)果發(fā)現(xiàn)ApoA1基因在廣西巴馬小型豬各主要臟器組織中均有表達(dá)，且以肝臟中的相對表達(dá)量最高、脾臟中的相對表達(dá)量最低（圖3），二者差異顯著（P<0.05）。

2. 3 廣西巴馬小型豬ApoA1基因編碼蛋白的理化性質(zhì)預(yù)測結(jié)果

經(jīng)ProtParam在線預(yù)測分析得知廣西巴馬小型豬ApoA1由264個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其分子式為C1343H2136N376O409S5，蛋白分子量為30254.31 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為5.47，表明該蛋白為酸性蛋白，GRAVY為-0.666。采用ProtScale對ApoA1進(jìn)行親/疏水性預(yù)測分析，結(jié)果（圖4）表明廣西巴馬小型豬ApoA1屬于親水性蛋白;以TMHMM對ApoA1進(jìn)行前體蛋白跨膜螺旋預(yù)測，結(jié)果（圖5）顯示廣西巴馬小型豬ApoA1存在跨膜螺旋，屬于跨膜蛋白。

采用NetPhos對廣西巴馬小型豬ApoA1磷酸化位點(diǎn)的預(yù)測結(jié)果如圖6所示，目標(biāo)蛋白可能出現(xiàn)的磷酸化位點(diǎn)有18處，包括位于第16、30、47、71、77、115、165、190、211和260位的絲氨酸，對應(yīng)得分情況為0.70、0.97、0.98、0.58、0.69、0.62、0.92、0.51、0.85和0.79;位于第8、79、82、91、102和138位的蘇氨酸，對應(yīng)得分情況為0.61、0.64、0.73、0.51、0.62和0.75;位于第42和140位的酪氨酸，對應(yīng)得分情況為0.86和0.92。

運(yùn)用SignalP對廣西巴馬小型豬ApoA1的前體蛋白信號(hào)肽進(jìn)行預(yù)測分析，結(jié)果（圖7）顯示，自然分裂的位點(diǎn)分值（C-score）峰值位于第18位，對應(yīng)分值為0.711;組合分裂的位點(diǎn)分值（Y-score）峰值也位于第18位，對應(yīng)分值為0.786;但信號(hào)肽分值（S-score）在N端沒有明顯的峰值。綜合各分值結(jié)果判斷，廣西巴馬小型豬ApoA1中不存在信號(hào)肽。

2. 4 廣西巴馬小型豬ApoA1結(jié)構(gòu)預(yù)測分析結(jié)果

運(yùn)用SOPMA程序預(yù)測廣西巴馬小型豬ApoA1二級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果（圖8）顯示，α-螺旋（以h表示）占79.92%，β-折疊（以t表示）占2.65%，無規(guī)則卷曲（以c表示）占11.12%，延伸鏈（以e表示）占6.31%，表明廣西巴馬小型豬ApoA1主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲組成。由于α-螺旋占比大于45.00%，同時(shí)β-折疊占比小于5.00%，因此推測廣西巴馬小型豬ApoA1屬于全α類蛋白。

運(yùn)用SWISS-MODEL平臺(tái)預(yù)測廣西巴馬小型豬ApoA1可能存在的三級(jí)結(jié)構(gòu)，結(jié)果如圖9所示，同源模型為Apolipoprotein A-1（3k2s.1.A），其同源性為80.67%。

2. 5 廣西巴馬小型豬ApoA1氨基酸序列同源性及系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化分析

利用DNASTAR中的MegAlign對廣西巴馬小型豬、普通豬（登錄號(hào)NP_999563.1）、家鼠（登錄號(hào)NP_033822.2）、兔子（登錄號(hào)NP_001095157.1）、牛（登錄號(hào)NP_776667.2）、雞（登錄號(hào)NP_990856.1）、猴子（登錄號(hào)NP_001270674.1）及人類（登錄號(hào)NP_001304947.1）的ApoA1氨基酸序列進(jìn)行同源性比對分析，結(jié)果表明，廣西巴馬小型豬ApoA1氨基酸序列與普通豬的同源性最高，為99.6%（圖10）;與人類和猴子的同源性較低，分別為15.5%和15.1%。由基于ApoA1氨基酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹（圖11）可看出，廣西巴馬小型豬與普通豬的親緣關(guān)系最近，與人類和猴子的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，即ApoA1的發(fā)育進(jìn)化符合物種進(jìn)化規(guī)律。

3 討論

ApoA1對減少膽固醇在血管內(nèi)壁沉積、降低動(dòng)脈粥樣硬化及冠心病的發(fā)病風(fēng)險(xiǎn)具有重要意義（Rader，2006;Ingelsson et al.，2007）。Berisha等（2015）研究表明，表達(dá)4WF亞型ApoA1轉(zhuǎn)基因小鼠的HDL喪失抗氧化功能。本研究結(jié)果表明，廣西巴馬小型豬ApoA1由264個(gè)氨基酸殘基構(gòu)成，其分子式為C1343H2136N376O409S5，蛋白分子量為30254.31 Da，理論等電點(diǎn)（pI）為5.47，且該蛋白為酸性蛋白，親水性較強(qiáng)，同時(shí)是一種重要的跨膜蛋白，主要承載著物質(zhì)轉(zhuǎn)運(yùn)進(jìn)出細(xì)胞的作用，能攝取細(xì)胞中游離的膽固醇和磷脂而形成新的HDL（Wang et al.，2017），使血漿中的脂質(zhì)和膽固醇維持動(dòng)態(tài)平衡。

蛋白磷酸化是經(jīng)蛋白激酶催化將ATP或GTPγ位磷酸基轉(zhuǎn)移至底物蛋白氨基酸殘基（絲氨酸、蘇氨酸、酪氨酸）上的過程，是生物體內(nèi)的一種普通調(diào)節(jié)方式，在細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)過程中發(fā)揮重要作用（王京蘭，2004;Alonzi et al.，2008;Hoofnagle and Heinecke，2009），具體表現(xiàn)為改變蛋白結(jié)構(gòu)，同時(shí)激活蛋白活力（Li et al.，2019;Luo et al.，2019）。本研究發(fā)現(xiàn)，廣西巴馬小型豬ApoA1上的絲氨酸磷酸化位點(diǎn)有10處、蘇氨酸磷酸化位點(diǎn)有6處、絡(luò)氨酸磷酸化位點(diǎn)有2處。蛋白磷酸化對蛋白活力及其功能具有極其重要的作用，尤其是通過變構(gòu)蛋白而激活蛋白活力，對機(jī)體內(nèi)酶活性調(diào)節(jié)起關(guān)鍵作用;蛋白磷酸化還能為結(jié)合蛋白提供結(jié)合位點(diǎn)，有利于與其他蛋白相互結(jié)合從而形成新的復(fù)合體。本研究還發(fā)現(xiàn)，廣西巴馬小型豬ApoA1不存在信號(hào)肽，其二級(jí)結(jié)構(gòu)預(yù)測結(jié)果顯示，α-螺旋占79.92%，β-折疊占2.65%，無規(guī)則卷曲占11.12%，延伸鏈占6.31%，表明廣西巴馬小型豬ApoA1主要由α-螺旋和無規(guī)卷曲組成。由于α-螺旋占比大于45.00%，同時(shí)β-折疊占比小于5.00%，因此推測廣西巴馬小型豬ApoA1屬于全α類蛋白。

同源性在很大程度上能反映各物種間的親緣關(guān)系。相對于普通豬，廣西巴馬小型豬ApoA1基因序列第630處的堿基發(fā)生突變，導(dǎo)致密碼子CTA突變?yōu)镃TG。但由于密碼子具有簡并性的特點(diǎn)，廣西巴馬小型豬ApoA1氨基酸序列與普通豬相比并未發(fā)生改變，即該基因突變屬于同義突變。廣西巴馬小型豬ApoA1氨基酸序列與普通豬的同源性最高，達(dá)99.6%;與人類和猴子的同源性較低，分別為15.5%和15.1%。由基于ApoA1氨基酸序列同源性構(gòu)建的系統(tǒng)發(fā)育進(jìn)化樹也可看出，廣西巴馬小型豬與普通豬的親緣關(guān)系最近，與人類和猴子的親緣關(guān)系相對較遠(yuǎn)，即ApoA1的發(fā)育進(jìn)化符合物種進(jìn)化規(guī)律（Hai et al.，2017;Boettcher et al.，2018），說明ApoA1基因編碼區(qū)在長期生物進(jìn)化過程中具有一定的保守性。

4 結(jié)論

廣西巴馬小型豬ApoA1基因保守性強(qiáng)，以在肝臟中的表達(dá)量最高，是廣西巴馬小型豬抗動(dòng)脈粥樣硬化的重要因子，通過敲出該基因可制作廣西巴馬小型豬動(dòng)脈粥樣硬化疾病模型。

參考文獻(xiàn)：

陳東，嚴(yán)激. 2010. 動(dòng)脈粥樣硬化中基質(zhì)金屬蛋白酶的研究進(jìn)展[J]. 安徽醫(yī)藥，14（8）：874-876. [Chen D，Yan J. 2010. Progress of matrix metalloproteinase research in atherosclerosis[J]. Anhui Medical and Pharmaceutical Journal，14（8）：874-876.]

闞延澤，江翱，孫文秀，李偉. 2016. 黃鱔載脂蛋白A1的基因結(jié)構(gòu)及表達(dá)譜分析[J]. 水產(chǎn)科學(xué)，35（6）：697-701. [Kan Y Z，Jiang A，Sun W X，Li W. 2016. Gene structure and expression of ApoA1 gene from swamp eel[J]. Fisheries Science，35（6）：697-701.]

雷蕾，陳麗. 2011. 血漿載脂蛋白與冠心病的相關(guān)性研究[J]. 當(dāng)代醫(yī)學(xué)，17（12）：13-14. [Lei L，Chen L. 2011. Study on the correlation between plasma apolipoprotein and coro-nary heart disease[J]. Contemporary Medicine，17（12）：13-14.]

李芳芳，郭亞芬，蘭干球，潘堂峰. 2014. 廣西巴馬小型豬GHRH成熟肽真核表達(dá)質(zhì)粒對小鼠生長效應(yīng)的影響[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，45（12）：2264-2269. [Li F F，Guo Y F，Lan G Q，Pan T F. 2014. Eukaryotic expression plasmid of GHRH mature peptide from Guangxi Bama Mini-pig and its influence on mouse growth effect[J]. Journal of Southern Agriculture，45（12）：2264-2269.

李龍，司景磊，夏攀潔，何劍雄，吳延軍，程曉芳，吳敏，徐文文，蘭干球. 2017. 廣西巴馬小型豬Neuritin基因克隆與生物信息學(xué)分析及真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 基因組學(xué)與應(yīng)用生物學(xué)，36（2）：557-563. [Li L，Si J L，Xia P J，He J X，Wu Y J， Cheng X F，Wu M，Xu W W，Lan G Q. 2017. Cloning and bioinformatics analysis of Neuritin gene from Guangxi Bama Mini-pig and construction of its eukaryotic expression vector[J]. Genomics and Applied Biology，36（2）：557-563.]

劉培彬，葉子璐，蔡潭溪，戴紹軍，楊福全. 2014. 脂蛋白質(zhì)組學(xué)研究進(jìn)展[J]. 生物化學(xué)與生物物理進(jìn)展，41（12）：1197-1206. [Liu P B，Ye Z L，Cai T X，Dai S J，Yang F Q. 2014. The research advances in lipoproteinomics[J]. Progress in Biochemistry and Biophysics，41（12）：1197-1206.]

麻延峰，方倩倩，王宏艷，田勇，唐軍旺，邵榮益，盧立志.2015. 鵝ApoA1、CD36和DGAT2基因的cDNA克隆與序列分析[J]. 浙江農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，27（10）：1710-1719. [Ma Y F，F(xiàn)ang Q Q，Wang H Y，Tian Y，Tang J W，Shao R Y，Lu L Z. 2015. cDNA cloning and sequence analysis of ApoA1，CD36 and DGAT2 genes from goose[J]. Acta Agriculturae Zhejiangensis，27（10）：1710-1719.]

申玉建，方程，邱慶慶，司景磊，吳延軍，楊祝良，楊秀榮，郭亞芬，蔣和生. 2017. 廣西巴馬小型豬PPARγ基因克隆及組織表達(dá)差異分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，48（10）：1884-1890. [Shen Y J，F(xiàn)ang C，Qiu Q Q，Si J L，Wu Y J，Yang Z L，Yang X R，Guo Y F，Jiang H S. 2017. Cloning of gene PPARγ from Guangxi Bama mini-pig and tissue expre-ssion difference analysis for it[J]. Journal of Southern Agriculture，48（10）：1884-1890.]

宋少銳，吳延軍，蔣世強(qiáng)，張名媛，郭亞芬，蘭干球，蔣欽楊. 2014. 廣西巴馬小型豬MCP-1基因克隆及序列分析[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，45（9）：1669-1673. [Song S R，Wu Y J，Jiang S Q，Zhang M Y，Guo Y F，Lan G Q，Jiang Q Y. 2014. Cloning and analysis of MCP-1 gene in Guangxi Bama mini-pig[J]. Journal of Southern Agriculture，45（9）：1669-1673.]

湯磊樂，黃卓山，鄭堅(jiān)銳，陳璘. 2017. 載脂蛋白A1和載脂蛋白B100在冠脈病變進(jìn)展中的作用[J]. 中山大學(xué)學(xué)報(bào)（醫(yī)學(xué)科學(xué)版），38（3）：395-400. [Tang L L，Huang Z S，Zheng J R，Chen L. 2017. Effects of APOA1 and APOB100 on progression of coronary artery lesion[J]. Journal of Sun Yat-sen University （Medical Sciences），38（3）：395-400.]

田迪. 2013. 辛伐他汀聯(lián)合載脂蛋白A-I模擬肽L-4F對apoE基因缺失小鼠高密度脂蛋白抗炎抗氧化功能和動(dòng)脈粥樣硬化的影響[D]. 廣州：南方醫(yī)科大學(xué). [Tian D. 2013. Simvastatin combination with ApoA-I mimetic peptide L-4F improve the anti-oxidant and anti-inflammatory pro-perties of high density lipoprotein and reduce atherosclerosis in apoE knockout mice[D]. Guangzhou：Southern Me-dical University.]

萬潔. 2008. 兔Apo-A1基因多態(tài)性及其與部分生產(chǎn)性狀的關(guān)聯(lián)研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué). [Wan J. 2008. Correlation analysis of production trait and the polymorphism of Apo-A1 gene in rabbits[D]. Ya’an：Sichuan Agricultural University.]

王京蘭. 2004. 磷酸化蛋白質(zhì)分析方法研究及其在人胎肝磷酸化蛋白質(zhì)組研究中的應(yīng)用[D]. 北京：中國人民解放軍軍事醫(yī)學(xué)科學(xué)院. [Wang J L. 2004. Analysis of phosphorylated protein and its application in human fetal he-parin[D]. Beijing：Academy of Military Medical Sciences.]

吳丹，蘭干球，郭亞芬，陳寶劍，陳少梅，蔣欽楊. 2013. 廣西巴馬小型豬α干擾素基因克隆及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，44（9）：1558-1563. [Wu D，Lan G Q，Guo Y F，Chen B J，Chen S M，Jiang Q Y. 2013. Clo-ning interferon-α gene of Guangxi Bama mini-pig and constructing its eukaryotic expression vector[J]. Journal of Southern Agriculture，44（9）：1558-1563.]

熊婷. 2012. 雞ApoA-1和ApoA-V基因多態(tài)性與膽固醇含量及繁殖性狀的關(guān)聯(lián)研究[D]. 雅安：四川農(nóng)業(yè)大學(xué). [Xiong T. 2012. Polymorphisms of chicken ApoA-1 and ApoA-V gene and its association with cholesterol content and reproductive traits[D]. Ya’an：Sichuan Agricultural University.]

張廣杰，崔悅悅，邱慶慶，夏琴，李龍，司景磊，夏攀杰，鄒輝，蘭干球. 2018. 廣西巴馬小型豬SP1基因克隆測序及其真核表達(dá)載體的構(gòu)建[J]. 南方農(nóng)業(yè)學(xué)報(bào)，49（2）：360-366. [Zhang G J，Cui Y Y，Qiu Q Q，Xia Q，Li L，Si J L，Xia P J，Zou H，Lan G Q. 2018. Cloning sequencing of gene SP1 in Guangxi Bama mini pig and construction of its eukaryotic expression vector[J]. Journal of Southern A-griculture，49（2）：360-366.]

張晶. 2012. 豬脂肪沉積關(guān)鍵基因的初步篩選[D]. 鄭州：河南農(nóng)業(yè)大學(xué). [Zhang J. 2012. Preliminary screening of the key genes of pig fat depositio[D]. Zhengzhou：Henan A-gricultural University.]

張旭，高昆，張海濤，高翔，葛文平，張小娟，張連峰，董偉.2011. 人載脂蛋白A1 基因轉(zhuǎn)基因小鼠的建立[J]. 中國實(shí)驗(yàn)動(dòng)物學(xué)報(bào)，19（6）：461-464. [Zhang X，Gao K，Zhang H T，Gao X，Ge W P，Zhang X J，Zhang L F，Dong W. 2011. Establishment of a human ApoA1 transgenic mouse model[J]. Acta Laboratorium Animalis Scien-tia Sinica，19（6）：461-464.]

趙佳福，段志強(qiáng)，楊遠(yuǎn)青，嵇辛勤，王圓圓，孫成娟. 2017. 從江香豬ApoA1基因的克隆及亞細(xì)胞定位研究[J]. 中國畜牧獸醫(yī)，44（7）：1954-1960. [Zhao J F，Duan Z Q，Yang Y Q，Ji X Q，Wang Y Y，Sun C J. 2017. Cloning and subcellular localization of ApoA1 gene in Congjiang Xiang pig[J]. Chinese Animal Husbandry & Veterinary Medicine，44（7）：1954-1960.]

趙佳福，楊遠(yuǎn)青，段志強(qiáng)，阮涌，倪萌萌，嵇辛勤. 2018. 從江香豬ApoA1、ApoC3、ApoE基因在組織器官中表達(dá)差異分析[J].黑龍江畜牧獸醫(yī)，（3）：132-136. [Zhao J F，Yang Y Q，Duan Z Q，Ruan Y，Ni M M，Ji X Q. 2018. The analysis on the different expressions of ApoA1，ApoC3，ApoE genes in tissues and organs of Congjiang xiang pig[J]. Heilongjiang Animal Science and Veterinary Medicine，（3）：1954-1960.]

Alonzi T，Mancone C，Amicone L，Tripodi M. 2008. Elucidation of lipoprotein particles structure by proteomic analysis[J]. Expert Review of Proteomics，5（1）：91-104.

Berisha S Z，Brubaker G，Kasumov T，Hung K T，Dibello P M，Huang Y，Li L，Willard B，Pollard K A，Nagy L E，Hazen S L，Smith J D. 2015. HDL from apoA1 transgenic mice expressing the 4WF isoform is resistant to oxidative loss of function[J]. Journal of Lipid Research，56（3）：653-664.

Boettcher A，Loving C，Cunnick J，Tuggle C K. 2018. Deve-lopment of severe combined immunodeficient（SCID） pig models for translational cancer modeling：Future insights on how humanized SCID pigs can improve preclinical cancer research[J]. Frontiers in Oncology，8：559. doi： 10.3389/fonc.2018.00559.

Chistiakov D A，Orekhov A N，Bobryshev Y V. 2016. ApoA1 and ApoA1-specific self-antibodies in cardiovascular di-sease[J]. Laboratory Investigation，96（7）：708-718.

Hai T，Guo W，Yao J，Cao C，Luo A，Qi M，Wang X，Wang X，Huang J，Zhang Y，Zhang H，Wang D，Shang H，Hong Q，Zhang R，Jia Q，Zheng Q，Qin G，Li Y，Zhang T，Jin W，Chen Z Y，Wang H，Zhou Q，Meng A，Wei H，Yang S，Zhao J. 2017. Creation of miniature pig model of human Waardenburg syndrome type 2A by ENU mutagenesis[J]. Human Genetics，136（11-12）：1463-1475.

Heinecke J W. 2013. HDL’s protein cargo：Friend or foe in cardioprotection？[J]. Circulation，127（8）：868-869.

Hoofnagle A N，Heinecke J W. 2009. Lipoproteomics：Using mass spectrometry-based proteomics to explore the a-ssembly，structure，and function of lipoproteins[J]. Journal of Lipid Research，50（10）：1967-1975.

Ingelsson E，Schaefer E J，Contois J H，Mcnamara J R，Sullivan L，Keyes M J，Pencina M J，Schoonmaker C，Wilson P W，D'Agostino R B，Vasan R S. 2007. Clinical utility of different lipid measures for prediction of coronary heart disease in men and women[J]. The Journal of the American Medical Association，298（7）：776-785.

Li Y，Cheng Y W，Zhu T Y，Zhang H，Li W，Guo Y S，Qi Y L，Chen X，Zhang J，Sha J H，Zhou Z M，Zhu H，Guo X J. 2019. The protein phosphorylation landscape of mouse spermatids during spermiogenesis[J]. Proteomics，19（11）. doi： 10.1002/pmic.201900055.

Luo F，Wang M，Liu Y，Zhao X M，Li A. 2019. DeepPhos：Prediction of protein phosphorylation sites with deep learning[J]. Bioinformatics. doi： 10.1093/bioinformatics/bty1051.

Rader D J. 2006. Molecular regulation of HDL metabolism and function：Implications for novel therapies[J]. The Journal of Clinical Investigation，116（12）：3090-3100.

Wang X P，He J，Guo H，Mu L，Hu Y H，Ma J L，Yan Y Z，Ma R L，Li S G，Ding Y S，Zhang M，Niu Q，Liu J M，Zhang J Y，Guo S X. 2017. Interactions of six SNPs in APOA1 gene and types of obesity on low HDL-C disease in Xinjiang pastoral area of China[J]. Lipids in Health and Disease，16：187.

Wu Y J，Zhang L，Liang J，Jiang Q Y，Guo Y F，Lan G Q. 2018. Comparative analysis on liver transcriptome profiles of different methods to establish type 2 diabetes mellitus models in Guangxi Bama mini-pig[J]. Gene，673：194-200.

Yan X Y，Wu Y J，Zhong F J，Jiang Q Y，Zhou T T，Guo Y F，Yang X R，Liang J，Liao J D，Lan G Q. 2018. iTRAQ and PRM-based quantitative proteomics in T2DM-susceptible and -tolerant models of Bama mini-pig[J]. Gene，675：119-127.

Zhang Y，Zhang L，Wang Y，Ding H，Xue S，Yu H，Hu L，Qi H，Wang Y，Zhu W，Liu D，Li P. 2019. KCNQ1OT1，HIF1A-AS2 and APOA1-AS are promising novel biomarkers for diagnosis of coronary artery disease[J]. Cli-nical and Experimental Pharmacology and Physiology，46（7）：635-642.

（責(zé)任編輯 蘭宗寶）