李飛高 張學琴 王好雨 劉國盛 王淑梅 李德強

摘 要 目的：研究辛伐他汀和利伐沙班聯(lián)合給藥對大鼠體內(nèi)利伐沙班藥動學的影響。方法：將30只大鼠隨機分為利伐沙班組（灌胃生理鹽水+利伐沙班2.6 mg/kg）和辛伐他汀+利伐沙班組（灌胃辛伐他汀5.3 mg/kg+利伐沙班2.6 mg/kg），每組15只。各組大鼠先連續(xù)灌胃生理鹽水/辛伐他汀5 d，每天給藥1次，第6天再灌胃利伐沙班+生理鹽水/辛伐他汀1次，分別于給藥前和末次給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、8、12、24 h自眼內(nèi)眥取血0.5 mL，采用液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜（LC-MS/MS）法測定大鼠血漿中利伐沙班的質(zhì)量濃度，繪制藥-時曲線，并用DAS 2.1.1軟件擬合藥動學參數(shù)。結(jié)果：利伐沙班組和辛伐他汀+利伐沙班組大鼠血漿中利伐沙班的AUC0-24 h分別為 （2 599.86±791.82）、（2 777.74±989.25） ng·h/mL，AUC0-∞分別為（3 053.28±1 116.06）、（3 396.78±1 409.80） ng·h/mL，t1/2分別為（8.06±3.52）、（9.25±4.18） h，tmax分別為（0.65±0.28） h、（0.60±0.13） h，CLZ分別為（0.95±0.32）、（0.88±0.34）L/（h·kg），Vd分別為（10.37±4.43）、（11.07±4.48） L/kg，cmax分別為（424.93±145.30）、（507.15±132.40） ng/mL；與利伐沙班組比較，辛伐他汀+利伐沙班組AUC0-24 h、AUC0-∞、t1/2、、Vd、cmax分別增加了6.40%、10.11%、12.86%、6.32%、16.21%，tmax、CLZ分別降低了8.33%、7.95%，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。結(jié)論：辛伐他汀（5.3 mg/kg）與利伐沙班（2.6 mg/kg）聯(lián)用后，利伐沙班在大鼠體內(nèi)的藥動學參數(shù)無顯著性變化。

關(guān)鍵詞 利伐沙班；辛伐他汀；藥動學；高效液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法；大鼠

Effects of Simvastatin Combined with Rivaroxaban on Pharmacokinetics of Rivaroxaban in Rats

LI Feigao，ZHANG Xueqin，WANG Haoyu，LIU Guosheng，WANG Shumei，LI Deqiang（Dept. of Pharmacy， the Second Hospital of Hebei Medical University， Shijiazhuang 050000， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the effects of simvastatin combined with rivaroxaban on pharmacokinetics of rivaroxaban in rats. METHODS： Thirty rats were randomly divided into rivaroxaban group （intragastric administration of normal saline+rivaroxaban 2.6 mg/kg）， simvastatin+rivaroxaban group （intragastric administration of simvastatin 5.3 mg/kg+rivaroxaban 2.6 mg/kg）， with 15 rats in each group. The rats were given normal saline/simvastatin intragastrically for 5 d， once a day， and then given intragastric administration of rivaroxaban+normal saline/simvastain once. The blood samples were collected from orbital cavity of rats before medication and 0.25， 0.5， 0.75， 1， 1.5， 2， 4， 8， 12， 24 h after medication. The plasma concentration of rivaroxaban was determined by LC-MS/MS. Plasma concentration-time curves were drawn， and the pharmacokinetic parameters were fitted by DAS 2.1.1 software. RESULTS： The pharmacokinetic parameters of rivaroxaban group and simvastatin+rivaroxaban group in rats included that AUC0-24 h were （2 599.86±791.82） and （2 777.74±989.25） ng·h/mL； AUC0-∞ were （3 053.28± 1 116.06） ng·h/mL and （3 396.78±1 409.80） ng·h/mL； t1/2 were （8.06±3.52） h and （9.25±4.18） h； tmax were（0.65±0.28） h and （0.60±0.13） h； CLZ were （0.95±0.32） L/（h·kg） and （0.88±0.34） L/（h·kg）； Vd were（10.37±4.43） L/kg and （11.07±4.48） L/kg； cmax were （424.93±145.30） ng/mL and （507.15±132.40） ng/mL. Compared with rivaroxaban group， AUC0-24 h， AUC0-∞， t1/2， Vd and cmax of simvastatin+rivaroxaban group increased by 6.40%， 10.11%， 12.86%， 6.32%， 16.21%； tmax and CLZ decreased by 8.33% and 7.95%. There was no significant difference （P>0.05）. CONCLUSIONS： There is no significant change in pharmacokinetic parameters of rivaroxaban in rats after combination of simvastatin （5.3 mg/kg） and rivaroxaban （2.6 mg/kg）.

KEYWORDS Rivaroxaban； Simvastatin； Pharmacokinetics； LC-MS/MS； Rats

利伐沙班（Rivaroxaban）是一種可直接抑制凝血因子Ⅹa的新型小分子口服制劑。由于其對凝血因子Ⅹa有高度的選擇性，且具有顯著的抗凝效果、良好的患者依從性和較少的不良反應而受到廣泛關(guān)注[1-3]。在預防心房顫動患者的卒中發(fā)生方面也取得了突破性的進展[4]。臨床研究表明[5-7]，利伐沙班能夠有效降低靜脈血栓栓塞和肺栓塞事件的發(fā)生率，且不增加大出血風險。與傳統(tǒng)抗凝藥物（華法林）相比，利伐沙班不必頻繁監(jiān)測凝血功能，生物利用度更高、效果更好[8-9]。肺栓塞（PE）是一種涉及心肺循環(huán)的臨床急危重癥，2012年美國FDA已批準利伐沙班用于治療PE。但PE發(fā)病機制較為復雜，包括血液粘稠度增加、多種炎癥介質(zhì)釋放等[10]。他汀類藥物具有降血脂、抗炎作用，能有效預防深靜脈血栓的發(fā)生。相關(guān)研究[10-11]發(fā)現(xiàn)，利伐沙班聯(lián)合他汀類藥物可顯著改善急性肺栓塞患者的臨床癥狀，且治療效果優(yōu)于單純?nèi)芩鼓委煛Ｐ练ニ∨c利伐沙班均為細胞色素P450（CYP）3A4酶的底物[12-14]，理論推測兩者在體內(nèi)可競爭CYP3A4酶，可能會導致利伐沙班代謝減慢、藥動學參數(shù)改變、血藥濃度升高、出血風險增加等。但目前，尚無辛伐他汀與利伐沙班聯(lián)用后利伐沙班藥動學特性的相關(guān)研究。因此，本研究建立液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜法，考察辛伐他汀和利伐沙班聯(lián)用后對大鼠體內(nèi)利伐沙班血藥濃度和藥動學參數(shù)的影響，為兩者在臨床上的聯(lián)合應用提供實驗支持。

1 材料

1.1 儀器

ABAPI4000三重四極桿串聯(lián)質(zhì)譜儀（美國 AB SCIEX公司）；CBM-20A高效液相色譜儀（日本島津公司）；高速離心機（德國ABBOTT公司）；XW-80 A渦旋混合器（上海醫(yī)科大學儀器廠）；CPA225D電子分析天平（德國Sartorius公司）；KQ-300B超聲波清洗器（昆山儀器有限公司）；KL 512J氮吹儀（北京康林科技有限責任公司）。

1.2 藥品與試劑

利伐沙班對照品（批號：274693-27-5，純度：99.94%）、替格瑞洛對照品（內(nèi)標，批號：366789-02-8，純度：99.6%）均購自成都思天德生物科技有限公司；利伐沙班片（拜爾醫(yī)藥保健有限公司，批號：BXHTT1，規(guī)格：10 mg）；辛伐他汀片（杭州默沙東制藥有限公司，批號：N023876，規(guī)格：20 mg）；甲酸、甲醇、乙腈、乙酸乙酯均為色譜純，水為實驗室自制純化水。

1.3 動物

健康清潔級Wistar大鼠30只，♂，體質(zhì)量150～200 g，購自河北省動物實驗中心，動物生產(chǎn)許可證號：SCXK- （冀）2013-1-003。實驗前大鼠禁食12 h，自由飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 分組與給藥

將30只大鼠隨機分為利伐沙班組（灌胃生理鹽水+利伐沙班2.6 mg/kg，按人臨床用藥劑量換算而得，下同）和辛伐他汀+利伐沙班組[灌胃辛伐他汀5.3 mg/kg（按人臨床用藥劑量換算而得）+利伐沙班2.6 mg/kg]，每組15只。各組大鼠先連續(xù)灌胃生理鹽水/辛伐他汀5 d，每日1次；第6天再灌胃利伐沙班+生理鹽水/辛伐他汀1次。

2.2 血漿樣品的處理

將血漿樣品置于1.5 mL肝素化的離心管中，混勻，10 900 r/min離心（離心半徑為7.9 cm，下同）5 min，取上清液，-40 ℃冰箱中保存。于1.5 mL離心管中加入20 μL 0.5 μg/mL內(nèi)標溶液，50 ℃氮氣吹干，加入自然解凍的血漿樣品200 μL，渦旋30 s，使內(nèi)標與血漿混合均勻。加入1 mL乙酸乙酯提取劑，渦旋2 min，10 900 r/min離心2 min，取上清液，50 ℃氮氣吹干，加入500 μL流動相復溶，渦旋30 s，10 900 r/min離心1 min，取上清液進樣測定。

2.3 大鼠血漿中利伐沙班方法學考察

2.3.1 色譜條件 色譜柱：Diamonsil C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動相：乙腈-水（含0.1%甲酸）（60 ∶ 40， V/V）；柱溫：35 ℃；流速：0.8 mL/min；進樣量：10 μL。

2.3.2 質(zhì)譜條件 離子源：電噴霧（ESI）；檢測模式：多反應監(jiān)測方式（MRM）；離子源溫度：550 ℃；離子噴射電壓：5 500 v；氣簾氣（CUR）壓力：40 psi；源內(nèi)氣體1（GS1，氮氣）壓力：55 psi；源內(nèi)氣體2（GS2，氮氣）壓力：60 psi；碰撞氣（CAD）壓力：4 psi。利伐沙班解簇電壓（DP）：120 V，碰撞能量（CE）：30 eV；替格瑞洛DP：152.9 V，CE：54.2 eV；掃描時間：100 ms；定量離子：利伐沙班質(zhì)荷比（m/z）436.3→145.0和替格瑞洛（m/z）523.3→153.2。

2.3.3 溶液的制備 （1）利伐沙班對照品溶液：精密稱取利伐沙班對照品適量，乙腈溶解，配制成質(zhì)量濃度為1 mg/mL的標準儲備液，于-40 ℃條件下保存待用。精密量取利伐沙班儲備液適量置于不同量瓶中，用乙腈稀釋并定容成質(zhì)量濃度為0.1、0.2、0.5、1、2、4、8 μg/mL的系列溶液。（2）內(nèi)標溶液：精密稱取替格瑞洛對照品適量，乙腈溶解，配制成質(zhì)量濃度為0.5 mg/mL的標準儲備液。精密量取替格瑞洛儲備液適量，用乙腈稀釋成質(zhì)量濃度為0.5 μg/mL的標準工作溶液。

2.3.4 專屬性考察 分別取空白血漿、空白血漿+利伐沙班對照品（100 ng/mL）、給藥后1 h大鼠血漿樣品適量，按“2.2”項下方法處理樣品后，按“2.3.1”“2.3.2”項下色譜、質(zhì)譜條件進樣測定。結(jié)果表明，血漿中內(nèi)源性物質(zhì)以及利伐沙班的可能代謝產(chǎn)物不干擾利伐沙班和內(nèi)標的測定。液相色譜-串聯(lián)質(zhì)譜圖見圖1。

2.3.5 線性關(guān)系考察 分別取0.1、0.2、0.5、1、2、4、8 μg/mL的系列利伐沙班對照品溶液20 μL，50 ℃氮氣吹干，加入空白血漿樣品200 μL，制備成利伐沙班血漿質(zhì)量濃度分別為10、20、50、100、200、400、800 ng/mL的系列溶液，按“2.2”項下方法處理后，按“2.3.1”“2.3.2”項下色譜、質(zhì)譜條件進樣測定。以利伐沙班的質(zhì)量濃度為橫坐標（x）、利伐沙班與內(nèi)標峰面積的比值為縱坐標（y）進行線性回歸，得回歸方程為y=0.011 4x+0.009 9（r=0.997 0），利伐沙班檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為10～800 ng/mL。

2.3.6 精密度試驗 分別制備低、中、高（20、100、640 ng/mL）3個質(zhì)量濃度的利伐沙班血漿樣品各5份，按“2.2”項下方法處理后，按“2.3.1”“2.3.2”項下色譜、質(zhì)譜條件進樣測定。每個質(zhì)量濃度同日內(nèi)連續(xù)測定3次，考察日內(nèi)精密度；另每天測定1次，連續(xù)測定5 d，考察日間精密度。結(jié)果，利伐沙班的低、中、高3個質(zhì)量濃度樣品日內(nèi)精密度RSD分別為4.5%、8.5%、8.0%（n=5），日間精密度RSD分別為5.5%、4.5%、4.3%（n=5）。

2.3.7 穩(wěn)定性試驗 取空白血漿9份，按“2.3.5”項下方法制成利伐沙班質(zhì)量濃度為100 ng/mL的質(zhì)控（QC）樣品。按“2.2”項下方法處理后，分別對樣品進行隨即處理、-40 ℃低溫保存5 d后處理、-40 ℃反復凍融3次后處理，考察樣品穩(wěn)定性，每種處理方法制備3個樣品。結(jié)果，隨即處理后的利伐沙班峰面積的RSD為4.1%（n=3），經(jīng)過-40 ℃低溫保存5 d后的利伐沙班峰面積的RSD為1.3%（n=3），經(jīng)過-40 ℃反復凍融3次后的利伐沙班峰面積的RSD為2.1%（n=3）。

2.3.8 準確度試驗 取空白血漿200 μL，按“2.3.5”項下處理方法制備低、中、高不同質(zhì)量濃度的QC樣品，按“2.2”項下方法處理，按“2.3.1”“2.3.2”項下色譜、質(zhì)譜條件進樣測定，記錄色譜圖。以利伐沙班的峰面積計算的相應質(zhì)量濃度與真實質(zhì)量濃度的比值計算回收率。結(jié)果，利伐沙班低、中、高質(zhì)量濃度的回收率分別為97.0%、105.0%、113.0%，RSD分別為8.0%、4.5%、8.5%（n=3）。

2.3.9 基質(zhì)效應 取15份空白血漿200 μL，氮氣吹干后，加入20 μL低、中、高質(zhì)量濃度為200、1 000、6 400 ng/mL的利伐沙班對照品溶液和20 μL內(nèi)標溶液（每組5份），加入460 μL流動相，渦旋，離心，按“2.3.1”“2.3.2”項下色譜、質(zhì)譜條件進樣測定，記錄峰面積，并計算利伐沙班峰面積與內(nèi)標峰面積的比值A1；另取200 μL流動相代替空白血漿，同上述操作，得利伐沙班峰面積與內(nèi)標峰面積的比值A2?；|(zhì)效應公式為A1/A2×100%。結(jié)果，利伐沙班低、中、高質(zhì)量濃度的基質(zhì)效應為90.8%～98.3%（n=5）。

2.4 統(tǒng)計學方法

采用SPSS 22.0軟件進行統(tǒng)計分析，結(jié)果以x±s表示，組間比較采用單因素方差分析，若服從正態(tài)分布，則采用t檢驗；若不服從正態(tài)分布，則采用Wilcox秩和檢驗。P<0.05表示差異有統(tǒng)計學意義。

2.5 藥動學實驗

利伐沙班組與辛伐他汀+利伐沙班組均于給藥前和給藥后0.25、0.5、0.75、1、1.5、2、4、8、12、24 h自大鼠眼內(nèi)眥取血0.5 mL（每次取血后給大鼠灌胃0.5 mL生理鹽水），分離血漿，按“2.2”項下方法處理后，按“2.3.1”“2.3.2”項下色譜、質(zhì)譜條件進樣測定。利用回歸方程計算各時間點對應的利伐沙班血藥濃度。利用DAS 2.1.1軟件處理數(shù)據(jù)，自動擬合統(tǒng)計矩，分別計算兩組大鼠的藥動學參數(shù)。結(jié)果，與利伐沙班組比較，辛伐他汀+利伐沙班組AUC0-24 h、AUC0-∞、t1/2、Vd、cmax分別增加6.40%、10.11%、12.86%、6.32%、16.21%，tmax、CLZ分別降低8.33%、7.95%，但差異無統(tǒng)計學意義（P>0.05）。大鼠體內(nèi)利伐沙班的藥-時曲線見圖2，利伐沙班在各組大鼠血漿中的藥動學參數(shù)見表1。

3 討論

CYP3A4酶是存在于人體肝臟中CYP酶（約占其總量的25%）的一種亞型，可以被多種藥物競爭性誘導或抑制，而且可能受某些蛋白受體的調(diào)控影響，從而改變藥物在體內(nèi)的代謝，影響藥效，這也是產(chǎn)生藥物相互作用的重要原因[15]。

利伐沙班有多種代謝途徑，包括以CYP3A4酶、CYP2J2酶參與的代謝途徑，以及非依賴CYP酶參與的代謝途徑，但主要代謝途徑為CYP3A4酶參與的代謝途徑[16-17]。辛伐他汀作為調(diào)血脂類藥物，是常用的3-羥-3-甲基戊二酰輔酶A還原酶抑制劑，辛伐他汀本無活性，但在體內(nèi)可水解為活性代謝產(chǎn)物辛伐他汀酸，從而發(fā)揮藥效，且辛伐他汀酸是CYP3A4酶的底物[18]。

本文探究辛伐他汀與利伐沙班合用后是否存在藥物相互作用，是否導致利伐沙班藥動學改變。因此，筆者建立了測定大鼠血漿中利伐沙班的LC-MS/MS法。結(jié)果，利伐沙班+辛伐他汀組與單用利伐沙班組的藥動學特征比較，主要藥動學參數(shù)（AUC0-24 h、AUC0-∞、t1/2、tmax、cmax）差異無統(tǒng)計學意義。雖然辛伐他汀與利伐沙班均為CYP3A4酶的底物，但本研究結(jié)果證實單次聯(lián)合應用辛伐他汀與利伐沙班2種藥物未發(fā)現(xiàn)明顯的相互競爭或抑制作用。

綜上所述，本研究結(jié)果表明，辛伐他?。?.3 mg/kg）與利伐沙班（2.6 mg/kg）在治療劑量范圍內(nèi)聯(lián)合應用后對利伐沙班在大鼠體內(nèi)的藥動學參數(shù)無顯著性影響，提示兩者可以聯(lián)合應用。由于藥物間的相互作用受多種因素影響，因此，本研究結(jié)果具有一定的局限性；另外，人與大鼠在吸收、代謝方面存在種屬差異，在人體內(nèi)單次或多次給藥后辛伐他汀對利伐沙班藥動學是否有影響還需進一步研究。

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（收稿日期：2018-10-08 修回日期：2019-01-24）

（編輯：唐曉蓮）