孫錦 張鵬 彭勍 孟碩 任鈞國 劉建勛

摘 要 目的：建立同時(shí)測(cè)定雙參通冠膠囊中脫氫紫堇堿和丹酚酸B含量的方法。方法：采用HPLC-雙波長切換法。色譜柱為Waters symmetry C18，以乙腈-0.05%磷酸溶液為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫，檢測(cè)波長為286 nm（丹酚酸B）、336 nm（脫氫紫堇堿），流速為1.0 mL/min，柱溫為25 ℃，進(jìn)樣量為10 μL。結(jié)果：在建立的檢測(cè)條件下，脫氫紫堇堿和丹酚酸B均能達(dá)到基線分離，二者進(jìn)樣量線性范圍分別為 0.157～1.259 μg、0.391～3.131 μg（r均為0.999 9）；精密度、重復(fù)性和穩(wěn)定性試驗(yàn)（24 h 內(nèi)）的RSD均小于2.00%（n=6～10）；平均加樣回收率分別為101.61%、102.85%（RSD分別為3.59%、2.85%，n=6）。結(jié)論：建立的 HPLC-雙波長切換法可同時(shí)測(cè)定雙參通冠膠囊中脫氫紫堇堿和丹酚酸B含量，且方法操作簡便、快速，可用于雙參通冠膠囊的質(zhì)量控制。

關(guān)鍵詞 雙參通冠膠囊；HPLC-雙波長切換法；含量測(cè)定；丹酚酸B；脫氫紫堇堿

Simultaneous Determination of Dehydrocorydine and Salvianolic Acid B in Shuangshen Tongguan Capsules by HPLC-dual Wavelength Switching Method

SUN Jin，ZHANG Peng，PENG Qing，MENG Shuo，REN Junguo，LIU Jianxun（Institute of Basic Medical Sciences， Xiyuan Hospital， China Academy of Chinese Medical Sciences， Beijing 100091， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To develop an method for determining the contents of dehydrocorydine and salvianolic acid B in Shuangshen tongguan capsules simultaneously. METHODS： The HPLC-dual wavelength switching method was used. The determination was performed on Waters symmetry C18 column with mobile phase consisted of acetonitrile-0.05% phosphoric acid solution （gradient elution） at the flow rate of 1.0 mL/min， the detection wavelength was 286 nm （salvianolic acid B） and 336 nm （dehydrocorydine）. The column temperature was maintained at 25 ℃， and sample size was 10 μL. RESULTS： Under this condition， dehydrocorydaline and salvianolic acid B could be separated in baseline. The linear range of them were 0.157-1.259 μg and 0.391-3.131 μg （r=0.999 9）. RSDs of precision， reproducibility and stability tests （within 24 h） were all lower than 2.00% （n=6-10）. The average recovery rates were 101.61% and 102.85% （RSD=3.59% and 2.85%， n=6）. CONCLUSIONS： Established HPLC-dual wavelength switching method can be used for simultaneous determination of dehydrocorydine and salvianolic acid B in Shuangshen tongguan capsules. The method is simple and rapid， and can be used for the quality control of Shuangshen tongguan capsule.

KEYWORDS Shuangshen tongguan capsules； HPLC-dual wavelength switching method； Content determination； Salvianolic acid B； Dehydrocorydine

雙參通冠膠囊是由人參、丹參、延胡索等中藥提取物以一定比例配伍而成的組分中藥，目前正處于臨床前研究階段。在該制劑中，人參大補(bǔ)元?dú)?、養(yǎng)血生津，丹參活血、化瘀、消癰，延胡索行氣活血并具有良好的止痛效果，三藥配伍具有益氣活血、理氣止痛之效[1]。前期研究表明，三藥組成的方劑或制劑（原方曾用名有雙參通冠方、雙參寧心方、雙參寧心膠囊等）具有明顯改善動(dòng)物急性心肌缺血和心肌梗塞的作用，能夠減輕心肌損傷程度、縮小心肌梗塞面積，對(duì)心肌缺血再灌注損傷具有保護(hù)作用[2-4]；另還可擴(kuò)張冠脈血管、降低冠脈阻力、增加冠脈血流量，從而改善心肌的供血供氧，對(duì)心血管系統(tǒng)起到調(diào)整和改善作用[5-6]。為有效地控制其內(nèi)在質(zhì)量，本實(shí)驗(yàn)室前期建立了分別對(duì)其有效成分脫氫紫堇堿（延胡索）和丹酚酸B（丹參）進(jìn)行含量測(cè)定的色譜方法，操作較煩瑣；為優(yōu)化其測(cè)定方法，本文中通過切換波長、采用梯度洗脫，建立了同時(shí)測(cè)定雙參通冠膠囊中脫氫紫堇堿和丹酚酸B含量的方法，以期為其質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)擬定提供依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1200型高效液相色譜儀（美國安捷倫公司）；METTLER AE240型電子分析天平（瑞士梅特勒-托利多公司）；KQ-300型超聲波清洗器（昆山市超聲儀器有限公司）；Milli-Q型超純水儀（美國密理博公司）。

1.2 藥品與試劑

雙參通冠膠囊[本實(shí)驗(yàn)室制備，批號(hào)：20180510（小試樣品），20180810、20180829、20180917（中試樣品），規(guī)格：160 mg/粒]；脫氫紫堇堿對(duì)照品（日本和光純藥工業(yè)株式會(huì)社，批號(hào)：045-32941，純度：85.53%）；丹酚酸B對(duì)照品（中國食品藥品檢定研究院，批號(hào)：111562-201716，純度：94.1%）；乙腈、磷酸均為色譜純，水為超純水。

2 方法

2.1 混合對(duì)照品溶液的制備

取脫氫紫堇堿、丹酚酸B對(duì)照品適量，精密稱定，加甲醇制成每1 mL中含脫氫紫堇堿0.09 mg、丹酚酸B 0.2 mg的混合溶液，即得。

2.2 供試品溶液的制備

取雙參通冠膠囊10粒，倒出其內(nèi)容物，研細(xì)，混勻。取細(xì)粉約10 mg，精密稱定，置于10 mL量瓶中，加入80%甲醇，超聲（功率：300 W，頻率：40 kHz，10 min）處理使其溶解，定容，搖勻，過0.45 μm微孔濾膜，取續(xù)濾液，即得。

2.3 陰性樣品溶液的制備

雙參通冠膠囊在制劑過程中加入了一定量的輔料糊精，為考察輔料和人參提取物對(duì)測(cè)定結(jié)果是否有干擾，按處方比例稱取適量輔料和人參提取物制成陰性樣品，按“2.3”項(xiàng)下方法制備陰性樣品溶液。

2.4 色譜條件與系統(tǒng)適用性試驗(yàn)

色譜柱為Waters symmetry C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流速：1. 0 mL/min；柱溫：25 ℃ ；進(jìn)樣量：10 μL；流動(dòng)相：乙腈-0.05%磷酸溶液（V/V），梯度洗脫；檢測(cè)波長：0～30 min：336 nm（脫氫紫堇堿），30～60 min：286 nm（丹酚酸B）。在上述色譜條件下，取“2.1”“2.2”“2.3”項(xiàng)下混合對(duì)照品溶液、供試品溶液（批號(hào)：20180510）和陰性樣品溶液進(jìn)樣分析，結(jié)果脫氫紫堇堿和丹酚酸B理論板數(shù)均不低于20 000，相鄰峰之間分離度均大于1.5。梯度洗脫程序見表1，3種溶液的色譜圖見圖1。

2.5 方法學(xué)考察

2.5.1 線性關(guān)系考察與定量限試驗(yàn) 精密吸取混合對(duì)照品溶液 2、4、6、8、10、12、14、16 μL，注入液相色譜儀中，按照“2.1”項(xiàng)下色譜條件測(cè)定。分別以進(jìn)樣量（x，μg）為橫坐標(biāo)、峰面積（y）為縱坐標(biāo)，計(jì)算回歸方程。結(jié)果，脫氫紫堇堿、丹酚酸B的回歸方程分別為：y=330.12x-17.62（r=0.999 9）、y=252.31x-17.62（r=0.999 9），表明脫氫紫堇堿、丹酚酸B進(jìn)樣量分別在 0.157～1.259、0.391～3.131 μg范圍內(nèi)與其峰面積具有良好的線性關(guān)系。

以信噪比約10 ∶ 1時(shí)相應(yīng)的質(zhì)量濃度作為定量限進(jìn)行試驗(yàn)。結(jié)果表明，脫氫紫堇堿定量限為1.60 μg/mL（信噪比為9.8），丹酚酸B的定量限為5.18 mg/mL（信噪比為12.6）。

2.5.2 精密度試驗(yàn) 精密吸取同一混合對(duì)照品溶液，按“2.1”項(xiàng)色譜條件連續(xù)進(jìn)樣 6 次。結(jié)果，脫氫紫堇堿、丹酚酸B峰面積的 RSD分別為0.54%、0.54%（n=6），表明儀器精密度良好。

2.5.3 穩(wěn)定性試驗(yàn) 精密吸取同一供試品溶液（批號(hào)：20180510），按“2.1”項(xiàng)色譜條件，分別于0、1、2、4、6、8、12、16、20、24 h進(jìn)樣測(cè)定，讀取各成分峰面積值。結(jié)果，脫氫紫堇堿、丹酚酸B峰面積的 RSD分別為 0.79%、0.68%（n=10），表明供試品溶液在24 h內(nèi)穩(wěn)定性良好。

2.5.4 重復(fù)性試驗(yàn) 精密稱取同一批樣品（批號(hào)：20180510）共6份，按“2.3”項(xiàng)下方法制備成供試品溶液，依法獨(dú)立測(cè)定，計(jì)算樣品中脫氫紫堇堿、丹酚酸B含量，結(jié)果含量的RSD分別為2.00%、1.82%（n=6），表明該方法重復(fù)性良好。

2.5.5 加樣回收率試驗(yàn) 精密稱取已知含量樣品（批號(hào)：20180510）共6份（脫氫紫堇堿21.01 mg/g、丹酚酸B 49.37 mg/g），分別精密加入對(duì)照品適量，依法測(cè)定，結(jié)果表明本法準(zhǔn)確度較好，方法可行，詳見表2。

2.6 樣品含量測(cè)定

取3批中試樣品（批號(hào)分別為20180810、20180829、20180917），依法制備成供試品溶液，注入液相色譜儀，測(cè)定峰面積，計(jì)算含量，并與本試驗(yàn)室前期建立的分別測(cè)定2種成分含量（各測(cè)定波長均分別與本法相同）的結(jié)果進(jìn)行比較，詳見表3。

3 討論

3.1 測(cè)定成分的選擇

丹參藥材中含有水溶性的酚酸類成分和脂溶性的丹參酮類成分，而研究發(fā)現(xiàn)對(duì)于冠心病的治療，其中水溶性部分更為重要，而丹酚酸B是水溶性物質(zhì)中活性最強(qiáng)的成分[7]；另外，2015年版《中國藥典》（一部）也以丹酚酸B為指標(biāo)對(duì)丹參藥材進(jìn)行質(zhì)量控制。延胡索中的主要化合物為生物堿，其中叔胺類生物堿約占0.65%，季胺類生物堿約占0.3%[8]。2015年版《中國藥典》以延胡索乙素（叔胺類生物堿）作為指標(biāo)性成分對(duì)延胡索藥材進(jìn)行質(zhì)量控制，但在延胡索中還同時(shí)含有季胺類生物堿如脫氫紫堇堿。研究表明，叔胺類生物堿延胡索乙素是延胡索鎮(zhèn)痛的主要活性成分[9]，而季胺類生物堿在治療心血管疾病中具有重要作用[10]。結(jié)合本實(shí)驗(yàn)室初期工藝篩選及藥效學(xué)實(shí)驗(yàn)研究發(fā)現(xiàn)，延胡索含有的季胺類生物堿中以脫氫紫堇堿含量較高，并具有較好的藥理作用，所以最終決定選擇丹酚酸B和脫氫紫堇堿作為該制劑的指標(biāo)性成分進(jìn)行含量測(cè)定。

3.2 供試品制備方法的確定

本研究在前期試驗(yàn)中，采用了單因素試驗(yàn)對(duì)供試品溶液制備過程中的提取溶劑、提取時(shí)間和溶劑用量進(jìn)行了考察。分別考察了不同體積分?jǐn)?shù)（50%、80%、100%）的甲醇、乙醇（乙醇最高體積分?jǐn)?shù)為95%）等溶劑的提取效果，結(jié)果表明采用 80%甲醇或80%乙醇為提取溶劑時(shí)各指標(biāo)成分提取率均較高，純甲醇對(duì)丹酚酸B的提取有影響，導(dǎo)致提取率偏低；分別對(duì)不同提取時(shí)間（5、10、15、30 min）進(jìn)行了考察，結(jié)果表明以 80%甲醇為溶劑，超聲提取10、15 min的提取率基本一致，且超聲提取 10 min 時(shí)有效成分基本提取完全，故選擇超聲提取 10 min；分別對(duì)提取溶劑用量為10、15、20 mL（樣品量為10 mg）時(shí)進(jìn)行比較，結(jié)果表明使用10 mL溶劑量即可有效提取出各成分。故最終得到優(yōu)化的提取方法為用80%甲醇10 mL超聲提取10 min。

3.3 色譜條件的選擇

在對(duì)中藥進(jìn)行分析時(shí)，流動(dòng)相選擇不當(dāng)，常常會(huì)使峰形不佳[11]。本試驗(yàn)需同時(shí)測(cè)定丹參中水溶性酚酸類成分和延胡索中生物堿類成分，2種成分性質(zhì)相差較大，故最終采用梯度洗脫。在前期試驗(yàn)中，筆者曾考察了乙腈-0.1% 磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH至6）、乙腈-0.2%磷酸溶液（三乙胺調(diào)pH至4）、乙腈-0.1%磷酸溶液和乙腈-0.05%磷酸溶液等不同溶液組成的流動(dòng)相[12-14]以不同比例進(jìn)行對(duì)比試驗(yàn)研究。結(jié)果表明，采用乙腈-0.05%磷酸系統(tǒng)較其他系統(tǒng)基線平穩(wěn)、洗脫能力強(qiáng)，可以使各指標(biāo)成分良好分離，峰形對(duì)稱，故確定乙腈-0.05%磷酸溶液作為流動(dòng)相進(jìn)行梯度洗脫。在前期試驗(yàn)中，對(duì)對(duì)照品溶液進(jìn)行全波長掃描，結(jié)果發(fā)現(xiàn)丹酚酸B和脫氫紫堇堿分別在波長約286、336 nm處呈現(xiàn)最大吸收，與文獻(xiàn)報(bào)道相似[15-17]。因2種成分最大吸收波長差異較大，故本文采用波長切換法對(duì)雙參通冠膠囊中2種成分進(jìn)行含量測(cè)定。

綜上，本試驗(yàn)建立的 HPLC-雙波長切換法可同時(shí)測(cè)定雙參通冠膠囊中酚酸類成分丹酚酸B和生物堿類成分脫氫紫堇堿的含量，該方法簡單快速、重復(fù)性好，且在各組分適宜波長處分別測(cè)定其含量，使得測(cè)定結(jié)果更加準(zhǔn)確。本法可作為雙參通冠膠囊含量測(cè)定方法，可為其質(zhì)量控制和質(zhì)量標(biāo)準(zhǔn)的建立提供參考。

參考文獻(xiàn)

[ 1 ] 林曉斐.基于藥代動(dòng)力學(xué)機(jī)制的雙參通冠方配伍關(guān)系的研究[D].北京：中國中醫(yī)科學(xué)院，2015.

[ 2 ] 李雪麗，劉建勛，郭宇潔.雙參寧心方對(duì)大鼠心肌缺血/再灌注損傷能量代謝的影響[J].中國中藥雜志，2013，38（17）：2874-2877.

[ 3 ] 孫宇揚(yáng).雙參寧心膠囊干預(yù)心肌缺血的分子機(jī)制研究[D].北京：中國中醫(yī)科學(xué)院，2006.

[ 4 ] 于震，劉建勛，李欣志，等.雙參寧心膠囊對(duì)小型豬介入性心肌缺血的保護(hù)作用[J].中國中藥雜志，2007，32（16）：1695-1699.

[ 5 ] 孫宇揚(yáng)，劉建勛，吳曉洋，等.雙參寧心方血清藥物化學(xué)和抗心肌細(xì)胞缺氧/復(fù)氧損傷的實(shí)驗(yàn)研究[J].中國中醫(yī)藥信息雜志，2006，13（5）：36-37.

[ 6 ] 劉建勛，于震，李欣志，等.雙參寧心膠囊對(duì)心導(dǎo)管介入血栓法制備小型豬心肌缺血模型的影響[J].中國中西醫(yī)結(jié)合雜志，2006，26（8）：728-731.

[ 7 ] 尹音，王峰，徐向陽.丹酚酸B研究進(jìn)展[J].中國藥師，2007，10（10）：1034-1037.

[ 8 ] 唐逸豐.延胡索化學(xué)成分與藥理作用研究概況[J].中醫(yī)臨床研究，2018，10（23）：144-146.

[ 9 ] 徐婷，金昔陸，曹惠明.延胡索乙素藥理作用的研究進(jìn)展[J].中國臨床藥學(xué)雜志，2001，10（1）：58-60.

[10] 賀凱，高建莉，趙光樹.延胡索化學(xué)成分、藥理作用及質(zhì)量控制研究進(jìn)展[J].中草藥，2007，38（12）：1909-1912.

[11] 王海嶺，張艷萍，王傳升，等. HPLC法同時(shí)測(cè)定舒眠膠囊中酸棗仁皂苷A和槲皮苷的含量[J].中國藥房，2013，24（8）：739-741.

[12] 戴金明，林徐劍，施曉萍，等.丹參藥材用不同水溫超聲提取后丹酚酸B的含量測(cè)定[J].藥學(xué)研究，2016，35（8）：460-462.

[13] 王紅，田明，王一，等.高效液相色譜法測(cè)定延胡索總生物堿滴丸中巴馬汀堿和脫氫紫堇堿含量[J].中醫(yī)藥學(xué)報(bào)，2013，41（1）：63-64.

[14] 姜曉燕，張琳，竇志華，等.反相高效液相色譜法同時(shí)測(cè)定丹參中5種成分含量[J].醫(yī)藥導(dǎo)報(bào)，2016，35（9）：997- 1000.

[15] 侯曉琳，劉芳馨，鮑慧瑋，等.延冰片中脫氫紫堇堿的含量測(cè)定[J].中國民族民間醫(yī)藥，2015，24（18）：17-19.

[16] 姚建標(biāo)，葉偉峰，王如偉.延胡索中脫氫延胡索堿的含量測(cè)定方法研究[J].中國藥業(yè)，2008，17（24）：18.

[17] 趙靜宜，陸洋，杜守穎，等.雙波長HPLC同時(shí)測(cè)定延胡索中3種生物堿的含量[J].中國實(shí)驗(yàn)方劑學(xué)雜志，2012，18（13）：107-110.

（收稿日期：2018-11-07 修回日期：2019-01-01）

（編輯：劉 萍）