孫翔 李慶林

摘 要 目的：研究吡拉格雷鈉對腦缺血再灌注損傷模型大鼠神經(jīng)功能的改善作用及相關(guān)機(jī)制。方法：將72只SD大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組（地佐環(huán)平 0.8 mg/kg）和吡拉格雷鈉低、中、高劑量組（20、30、45 mg/kg），每組12只。除假手術(shù)組大鼠行假手術(shù)外，其余各組大鼠均采用大腦中動(dòng)脈結(jié)扎誘導(dǎo)腦缺血再灌注損傷模型。術(shù)后2 h尾靜脈注射相應(yīng)藥物，假手術(shù)組和模型組大鼠注射等量生理鹽水，連續(xù)給藥6 d，給藥間隔均為24 h。再灌注24 h和末次給藥后，評估大鼠的神經(jīng)功能缺陷評分和姿勢反射評分，采用微正電子發(fā)射斷層掃描評估腦損傷情況（包括全腦、島狀皮層﹑殼核﹑紋狀體﹑體細(xì)胞皮層﹑杏仁核、運(yùn)動(dòng)皮層）。然后處死大鼠，2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色后觀察腦梗死情況并計(jì)算腦梗死體積，酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)檢測其腦組織中Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和谷氨酸（Glu）含量。結(jié)果：與假手術(shù)組比較，模型組大鼠缺血再灌注后24 h和末次給藥后的神經(jīng)功能缺陷評分、姿勢反射評分均明顯升高（P<0.05或P<0.01），腦缺血再灌注24 h與末次給藥后腦組織的SUV、全腦及各不同腦區(qū)的右左腦SUV比值均明顯降低（P<0.01）；末次給藥后腦梗死體積百分?jǐn)?shù)明顯升高（P<0.01），腦組織中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性明顯降低（P<0.01），Glu含量明顯升高（P<0.01）。與模型組比較，吡拉格雷鈉低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠上述指標(biāo)均明顯改善（P<0.05或P<0.01）。結(jié)論：吡拉格雷鈉對大鼠腦缺血再灌注損傷和神經(jīng)功能有改善作用，這可能與上調(diào)腦組織中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性和下調(diào)Glu含量有關(guān)。

關(guān)鍵詞 吡拉格雷鈉；腦缺血再灌注損傷；神經(jīng)功能；大鼠；機(jī)制

Improvement Effects and Mechanism Study of Pyragrel Sodium on Cerebral Ischemia-reperfusion Injury in Rats

SUN Xiang，LI Qinglin（Research Laboratory Center， Anhui University of TCM/Key Lab of Xin’an Medical Medicine， Ministry of Education， Hefei 230038， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To study the improvement effect and related mechanism of pyragrel sodium on nerve function of cerebral ischemia-reperfusion injury model rats. METHODS： Totally 72 SD rats were randomly divided into sham operation group， model group， positive control group （dizocilpine 0.8 mg/kg）， pyragrel sodium low-dose， medium-dose and high-dose groups （20， 30， 45 mg/kg）， with 12 rats in each group. Except sham operation group received sham operation， rats in the other groups were treated with middle cerebral artery ligation to induce cerebral ischemia-reperfusion injury model. The rats in the sham operation group and the model group were injected with the constant volume of normal saline， for consecutive 6 d， and the interval of administration was 24 hours. After 24 h reperfusion and last medication， neurological deficit score and postural reflex score in rats were evaluated. The situation of cerebral injury （including whole brain， insular cortex， putamen， striatum， somatic cortex， amygdala， motor cortex） was evaluated by using micropositron emission tomography. The rats were sacrificed， and the situation of cerebral infarction was observed by TTC and cerebral infarction volume was calculated. Na+-K+-ATPase， Ca2+-ATPase activity and Glu content were detected by ELISA. RESULTS： Compared with sham operation group， neurological deficit score and postural reflex score increased significantly in model group 24 h after ischemia-reperfusion and after last medication （P<0.05 or P<0.01）. After 24 hours of cerebral ischemia-reperfusion and the last medication， SUV of brain tissue， SUV ratio of right left brain of different cerebral areas were decreased significantly （P<0.01）. After last medication， the percentage of cerebral infarction volume was increased significantly （P<0.01）； the activities of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase were decreased significantly （P<0.01）， while Glu content was increased significantly （P<0.01）. Compared with model group， above indexes of pyragrel sodium low-dose， medium-dose and high-dose group， positive control group were all improved significantly （P<0.05 or P<0.01）. CONCLUSIONS： Pyragrel sodium can improve cerebral ischemia-reperfusion injury and nerve function， which is related to the activity up-regulation of Na+-K+-ATPase and Ca2+-ATPase， the down-regulation of Glu content.

KEYWORDS Pyragrel sodium； Cerebral ischemia-reperfusion injury； Nerve function； Rats； Mechanism

腦卒中是一種急性腦血管疾病，是腦血管破裂或血管阻塞導(dǎo)致血液無法流入大腦引起的腦部損傷。在腦卒中的兩個(gè)主要亞型中，缺血性腦卒中的發(fā)生率高于出血性腦卒中[1]。缺血性腦卒中具有發(fā)病率高、病死率高、致殘率高的特點(diǎn)，已經(jīng)是成年人致殘的主要原因之一。尤其是腦卒中缺血后的再灌注損傷，是導(dǎo)致腦部損傷的主要原因，其中神經(jīng)損傷最為嚴(yán)重。目前，缺血性腦卒中的治療主要包括手術(shù)治療和藥物治療，藥物治療又分為溶栓治療、抗血小板治療、早期抗凝治療和應(yīng)用神經(jīng)保護(hù)劑等[2]，其中，應(yīng)用神經(jīng)保護(hù)劑是急性缺血性腦卒中特異性治療的主要方法。

吡拉格雷鈉（Pyragrel sodium）是一種以中藥活性成分川芎嗪和阿魏酸為基本骨架設(shè)計(jì)合成的新型化合物[3]。前期研究表明，吡拉格雷鈉可以擴(kuò)張血管、抑制血小板聚集、防止血栓形成、增強(qiáng)組織抗氧化作用，并具有顯著的抗腦缺血作用，此外，吡拉格雷鈉還具有促進(jìn)微循環(huán)血流、改善內(nèi)皮損傷和神經(jīng)功能的作用[4-5]。但是吡拉格雷鈉對于腦缺血再灌注損傷和神經(jīng)功能是否也有保護(hù)作用尚不清楚。為了給臨床試驗(yàn)提供參考，本研究通過神經(jīng)學(xué)評分、微正電子發(fā)射斷層掃描（Micro-PET）和2，3，5-氯化三苯基四氮唑（TTC）染色評估吡拉格雷鈉對腦缺血再灌注損傷模型大鼠神經(jīng)功能的改善作用，以證實(shí)吡拉格雷鈉的神經(jīng)保護(hù)作用。同時(shí)，對吡拉格雷鈉的神經(jīng)保護(hù)機(jī)制進(jìn)行初步探索。

1 材料

1.1 儀器

HH-2數(shù)顯恒溫水浴鍋（國華電器有限公司）；FSH- 2A可調(diào)高速勻漿機(jī)（金壇市大盛實(shí)驗(yàn)儀器有限公司）；80-2臺(tái)式低速離心機(jī)[上海醫(yī)療器械（基團(tuán)）有限公司手術(shù)器械廠]；JA3003 電子天平（上海精科天平儀器廠）；Infinite M 200 PRO全波長酶標(biāo)儀（瑞士Tecan公司）；AtomlabTM 500活度計(jì)（美國Biodex公司）；Inveon Micro-PET儀（美國西門子公司）；VIP 3000麻醉機(jī)（美國Matrx公司）。

1.2 藥品與試劑

吡拉格雷鈉原料藥（合肥醫(yī)工醫(yī)藥有限公司，批號(hào)：20170616，純度：99.3%）；地佐環(huán)平原料藥（批號(hào)：080M4610V，純度：99.5%）、TTC均購自美國Sigma公司；生理鹽水（山東科瑞藥業(yè)有限公司，批號(hào)：20170125）；PET掃描顯像劑氟化脫氧葡萄糖（18F-FDG）[米度（南京）生物技術(shù)有限公司]；谷氨酸（Glu）檢測試劑盒、Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶酶聯(lián)免疫吸附試驗(yàn)（ELISA）檢測試劑盒（上海寶曼生物科技有限公司）。

1.3 動(dòng)物

SPF級SD大鼠72只，♂，8周齡，體質(zhì)量200～250 g，購自浙江省實(shí)驗(yàn)動(dòng)物中心，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號(hào)：SCXK（浙）2017-0001。

2 方法

2.1 缺血再灌注損傷模型的復(fù)制

采用大腦中動(dòng)脈結(jié)扎復(fù)制大鼠腦缺血再灌注損傷模型[6]。通過腹膜注射10%水合氯醛（0.3 mL/100 g）麻醉大鼠，暴露左頸總動(dòng)脈（CCA）和頸外動(dòng)脈（ECA），然后將尼龍縫合線從CCA插入頸內(nèi)動(dòng)脈（ICA）并向前移動(dòng)，以封閉左大腦中動(dòng)脈（MCA）的根部直至出現(xiàn)輕微阻力。在缺血2 h后，除去尼龍縫合線以恢復(fù)血流（再灌注）持續(xù)24 h。假手術(shù)組大鼠接受相同的手術(shù)，但未插入尼龍縫合線。在整個(gè)過程中保持大鼠體溫在（37.0±0.5） ℃。

2.2 分組

將大鼠隨機(jī)分為假手術(shù)組、模型組、陽性對照組和吡拉格雷鈉低、中、高劑量組，每組12只，其中6只用于腦組織TTC染色進(jìn)行腦梗死體積檢測，剩余6只用于檢測腦組織勻漿中Glu含量和ATP酶活性。

2.3 給藥方法

吡拉格雷鈉低、中、高劑量組大鼠按“2.1”項(xiàng)下方法復(fù)制腦缺血再灌注損傷模型后尾靜脈注射吡拉格雷鈉，給藥劑量依據(jù)前期實(shí)驗(yàn)研究結(jié)果設(shè)定為20、30、45 mg/kg，每日1次；陽性對照組大鼠按“2.1”項(xiàng)下方法復(fù)制腦缺血再灌注損傷模型后尾靜脈注射地佐環(huán)平，給藥劑量為0.8 mg/kg[7]，每日1次；模型組大鼠按“2.1”項(xiàng)下方法復(fù)制腦缺血再灌注損傷模型后每日注射1次生理鹽水；假手術(shù)組大鼠行假手術(shù)后每日尾靜脈注射1次生理鹽水。首次給藥時(shí)間均為缺血后2 h，連續(xù)用藥6 d，給藥間隔均為24 h。

2.4 神經(jīng)學(xué)評分

缺血再灌注后24 h和末次給藥后，使用改良的Longa五點(diǎn)量表評分系統(tǒng)[6]分別對各組大鼠進(jìn)行神經(jīng)功能缺陷評分和姿勢反射評分。神經(jīng)功能缺陷評分標(biāo)準(zhǔn)：無神經(jīng)缺陷為0分；左肢體不能完全伸展為1分；行走時(shí)向右側(cè)轉(zhuǎn)圈為2分；行走時(shí)向右側(cè)傾倒為3分；不能自發(fā)行走為4分；死亡為5分。姿勢反射評分標(biāo)準(zhǔn)：兩前肢完全伸展為0分（正常）；左前肢貼在胸部，右前肢伸展為1分（輕度異常）；左前肢貼在胸前，上半身卷曲為2分（嚴(yán)重異常）。

2.5 腦損傷掃描

通過Micro-PET確定各組大鼠腦攝取18F-FDG的情況評價(jià)腦損傷情況。缺血再灌注后24 h和末次給藥后，分別對所有大鼠進(jìn)行Micro-PET，在Micro-PET之前，大鼠禁食12 h以增強(qiáng)腦18F-FDG攝取，然后尾靜脈注射18F-FDG（1.5 mCi/kg），1 h后將大鼠固定在掃描床上，進(jìn)行掃描，掃描時(shí)間10 min，記錄整個(gè)大腦的掃描圖及整個(gè)大腦和不同腦區(qū)（島狀皮層﹑殼核﹑紋狀體﹑體細(xì)胞皮層﹑杏仁核、運(yùn)動(dòng)皮層）的標(biāo)準(zhǔn)化攝取值（SUV）。SUV值越低，腦損傷越嚴(yán)重。計(jì)算右左腦SUV比值=右側(cè)分區(qū)SUV/左側(cè)分區(qū)SUV。

2.6 腦梗死體積的測量

Micro-PET掃描后，麻醉下處死大鼠，每組取6只大鼠的腦組織切成2.0 mm切片并浸入2%TTC中30 min，然后在4%多聚甲醛中于4 ℃下固定過夜，然后使用Image-Pro Plus 6.0軟件計(jì)算腦梗死體積，取平均值。正常腦組織呈紅色，梗死組織呈淺灰色。

2.7 腦組織中Glu含量和Na+-K+-ATP酶、Ca2+-ATP酶活性的檢測

將每組剩余的6只大鼠，在冰浴中取下全腦，制備成10%的組織勻漿，按試劑盒操作，檢測腦組織中Na+-K+- ATP酶、Ca2+-ATP酶活性和Glu含量。

2.8 統(tǒng)計(jì)學(xué)方法

使用SPSS 17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計(jì)分析。通過單因素方差分析分析多組之間的差異，t檢驗(yàn)評估兩組之間的差異。P<0.05表示差異具有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

3 結(jié)果

3.1 神經(jīng)功能缺陷評分和姿勢反射評分

假手術(shù)組大鼠神經(jīng)功能缺陷評分和姿勢反射評分均為0，模型組大鼠神經(jīng)功能缺陷評分和姿勢反射評分明顯高于假手術(shù)組（P<0.01）。與模型組比較，吡拉格雷鈉低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠缺血再灌注后24 h和末次給藥后的神經(jīng)功能缺陷評分、姿勢反射評分均明顯降低（P<0.05或P<0.01）。說明吡拉格雷鈉可以顯著改善缺血再灌注的神經(jīng)功能，且具有劑量依賴性。5組大鼠不同時(shí)間點(diǎn)的神經(jīng)功能缺陷評分、姿勢反射評分結(jié)果見圖1。

3.2 Micro-PET掃描

3.2.1 各組大鼠腦部SUV比較 假手術(shù)組大鼠呈現(xiàn)出完整的腦區(qū)，未觀察到腦缺血損傷；其余各組大鼠缺血再灌注后24 h均呈現(xiàn)出腦缺血損傷。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦缺血再灌注后24 h與末次給藥后腦組織的SUV明顯降低。與模型組比較，吡拉格雷鈉低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠腦缺血再灌注24 h與末次給藥后腦組織的SUV明顯增加。各組大鼠腦組織的Micro-PET掃描圖見圖2。

3.2.2 各組大鼠右左腦SUV比值 假手術(shù)組大鼠呈現(xiàn)出完整的腦區(qū)，右左腦SUV比值為“1”。與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦缺血再灌注后24 h與末次給藥后右左腦SUV比值明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，吡拉格雷鈉低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠腦缺血再灌注后24 h右左腦SUV比值明顯升高（P<0.01），吡拉格雷鈉低、中劑量組和陽性對照組大鼠末次給藥后右左腦SUV比值明顯升高（P<0.01），更接近“1”，說明吡拉格雷鈉具有改善腦缺血再灌注損傷的作用。各組大鼠的右左腦SUV比值結(jié)果見圖3。

3.2.3 不同腦區(qū)右左腦SUV比值 與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的島狀皮層﹑殼核﹑紋狀體﹑體細(xì)胞皮層﹑杏仁核、運(yùn)動(dòng)皮層腦區(qū)的右左腦SUV比值明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，吡拉格雷鈉低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠的島狀皮層﹑殼核﹑紋狀體﹑體細(xì)胞皮層、杏仁核、運(yùn)動(dòng)皮層腦區(qū)的右左腦SUV比值明顯升高（P<0.05或P<0.01），更接近“1”。各組大鼠不同腦區(qū)右左腦SUV比值測定結(jié)果見圖4。

3.3 腦梗死體積

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠的腦梗死體積明顯增加（P<0.01）。與模型組比較，吡拉格雷鈉低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠的腦梗死體積明顯減小（P<0.05或P<0.01），且與吡拉格雷鈉呈現(xiàn)劑量依賴性。各組大鼠的腦梗死體積圖片見圖5，測定結(jié)果見表1。

3.4 Na+-K+-ATP酶活性

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性明顯降低（P<0.01）。與模型組比較，吡拉格雷鈉低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠腦組織中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性明顯升高（P<0.05或P<0.01）。表明吡拉格雷鈉可以增強(qiáng)缺血再灌注后腦組織中ATP酶活性。各組大鼠腦組織中Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶活性測定結(jié)果見圖6。

3.5 Glu含量

與假手術(shù)組比較，模型組大鼠腦組織中Glu含量明顯升高（P<0.01），說明腦缺血再灌注后腦組織Glu水平上升。與模型組比較，吡拉格雷鈉低、中、高劑量組和陽性對照組大鼠腦組織中Glu含量均明顯降低（P<0.01），說明吡拉格雷鈉可能會(huì)降低腦缺血再灌注后Glu誘導(dǎo)的興奮性毒性。 各組大鼠腦組織中Glu含量的測定結(jié)果見圖7。

4 討論

由腦動(dòng)脈閉塞誘導(dǎo)的缺血性中風(fēng)會(huì)顯著降低局部腦血流量，并誘導(dǎo)細(xì)胞死亡，使腦萎縮和功能缺陷[8-9]。缺血性腦組織中局部血液灌注的恢復(fù)在組織修復(fù)和功能恢復(fù)中起關(guān)鍵作用[10]。地佐環(huán)平可以特異性地拮抗N-甲基-D-天冬氨酸（NMDA）受體并降低Glu的毒性，是實(shí)驗(yàn)中常用的神經(jīng)保護(hù)劑，因此本研究以其為陽性對照藥[7]。ATP酶活性與Glu轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白活性密切相關(guān)，而谷氨酸轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白對于維持突觸間隙中Glu濃度的穩(wěn)定性非常重要。

在腦缺血再灌注的藥物研究中，神經(jīng)功能評分是一個(gè)重要指標(biāo)[11-12]，其與后期生存率密切相關(guān)。吡拉格雷鈉低、中、高劑量組的神經(jīng)功能評分和姿勢反射評分顯著低于模型組。表明吡拉格雷鈉可以改善腦缺血再灌注損傷模型大鼠的神經(jīng)功能。此外，吡拉格雷鈉減少了模型大鼠的腦梗死體積。

Micro-PET是一種成像技術(shù)，可以對大腦中的各種分子水平進(jìn)行無創(chuàng)的體內(nèi)測量。18F-PDG是Micro-PET成像中最常用的正電子成像劑。作為葡萄糖類似物，18F-PDG與葡萄糖競爭性地結(jié)合細(xì)胞膜上的葡糖轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白（GLUT）并進(jìn)入細(xì)胞。然后，18F-FDG在己糖激酶的作用下產(chǎn)生6-磷酸-18F-FDG。6-磷酸-18F-FDG不能進(jìn)入細(xì)胞中參與糖酵解而停留在體內(nèi)[13]。因此，18F-FDG可以反映組織吸收葡萄糖和葡萄糖代謝活動(dòng)的能力，此外，18F-FDG的攝取也與組織血液供應(yīng)密切相關(guān)，正常情況下，大腦右左腦區(qū)對18F-FDG的攝取值SUV值比率為1[14]。Micro-PET圖像顯示，假手術(shù)組在24 h均呈現(xiàn)出完整的腦區(qū)，未觀察到腦缺血再灌注；從24 h圖像可觀察到各手術(shù)組SD大鼠呈現(xiàn)出腦缺血再灌注，主要出現(xiàn)在殼核、杏仁核、紋狀體、聽覺皮層、內(nèi)嗅皮層、頂葉、軀體感覺皮層、下丘腦、嗅覺球等腦區(qū)分區(qū)，缺血再灌注后各手術(shù)組上述左右腦區(qū)分區(qū)的SUV比率降低；小腦灰質(zhì)、小腦白質(zhì)區(qū)域SUV比值基本無化，提示該部位無腦缺血再灌注；吡拉格雷鈉和陽性藥物可不同程度地改善大鼠腦缺血再灌注損傷。

作為主要的興奮性神經(jīng)遞質(zhì)之一，Glu在大腦的正常生理狀態(tài)中起重要作用。然而，在腦缺血再灌注和其他病理狀況中，大腦中大量Glu釋放可引起興奮性毒性并成為缺血性神經(jīng)元損傷的主要誘發(fā)因素。Glu的興奮毒性主要由與神經(jīng)細(xì)胞膜受體的結(jié)合引起，并導(dǎo)致細(xì)胞內(nèi)Na+和Ca2+的增加[15]。細(xì)胞內(nèi)Ca2+濃度的增加可誘導(dǎo)線粒體功能異常、蛋白酶活化、活性氧（ROS）的產(chǎn)生和NO的釋放，從而導(dǎo)致神經(jīng)元死亡。細(xì)胞內(nèi)Na+的增加可導(dǎo)致過量的水進(jìn)入細(xì)胞，從而導(dǎo)致神經(jīng)毒性水腫和細(xì)胞死亡。一方面，當(dāng)缺血和缺氧發(fā)生時(shí)，細(xì)胞內(nèi)ATP產(chǎn)生減少會(huì)導(dǎo)致ATP酶功能障礙，進(jìn)而影響Glu轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)，進(jìn)而導(dǎo)致Glu過量。Glu在突觸間隙中的積累和Glu受體的激活，最終導(dǎo)致興奮性毒性。另一方面，大量的Glu將與神經(jīng)元細(xì)胞膜受體結(jié)合并抑制Na+-K+-ATP酶和Ca2+-ATP酶的活性。進(jìn)而導(dǎo)致Na+和Ca2+內(nèi)流并進(jìn)一步引發(fā)神經(jīng)元細(xì)胞死亡的級聯(lián)[16]。吡拉格雷鈉可通過增加ATP酶活性，增強(qiáng)Glu轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白的轉(zhuǎn)運(yùn)能力，然后去除突觸間隙中Glu的積累來降低興奮性毒性，從而保護(hù)神經(jīng)系統(tǒng)。

總之，吡拉格雷鈉能顯著改善神經(jīng)功能缺損評分、降低術(shù)后腦梗死體積、改善腦缺血再灌注后腦部葡萄糖的攝取量、改善腦部血流，還能增強(qiáng)缺血再灌注腦組織中的ATP酶活性、降低Glu含量。提示吡拉格雷鈉對腦缺血再灌注損傷和神經(jīng)功能均有保護(hù)作用，這可能與ATP酶-Glu轉(zhuǎn)運(yùn)蛋白-Glu信號(hào)通路有關(guān)。

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（收稿日期：2018-12-11 修回日期：2019-02-18）

（編輯：鄒麗娟）