荀桂洲 傅慧敏 胡敏 張全 葉靜 張紹蘭

摘 要 目的：建立測定大鼠體內(nèi)米托蒽醌血藥濃度的方法，研究米托蒽醌在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)。方法：取SD大鼠6只，尾靜脈注射米托蒽醌5 mg/kg，分別于給藥前和給藥后5、10、20、40、60、120、240、480、720 min取尾靜脈血0.3 mL，置于肝素化EP 管中，離心分離血漿，加入硅膠充分研磨混勻后，再加入含0.5 mol/L鹽酸的甲醇溶液沉淀蛋白，研磨混勻，離心取上清液，氮?dú)獯蹈珊蠹恿鲃?dòng)相復(fù)溶。采用高效液相色譜法測定米托蒽醌的血藥濃度，色譜柱為ZORBAX SB-C18，流動(dòng)相為20 mmoL/L乙酸銨水溶液（用稀鹽酸調(diào)pH至2.0）-甲醇（65 ∶ 35，V/V），流速為1.0 mL/min，檢測波長為244 nm，柱溫為30 ℃，進(jìn)樣量為20 μL，應(yīng)用DAS 3.0軟件計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。結(jié)果：米托蒽醌檢測質(zhì)量濃度的線性范圍為200～10 000 μg/L（r=0.999 6，n=6），定量下限為200 μg/L，檢測限為150 μg/L；日內(nèi)、日間精密度和穩(wěn)定性試驗(yàn)的RSD均<8.0%（n分別為5、3、6）；提取回收率為（85.64±3.93）%～（92.31±1.68）%（n=3）；準(zhǔn)確度試驗(yàn)中的回收率為（93.58±1.42）%～（113.92±2.74）%（n=6）。米托蒽醌在大鼠體內(nèi)的藥動(dòng)學(xué)參數(shù)AUC0-720 min為（5 247.1±474.6） μg·h/L，t1/2z為（24.88±6.94） h，CLZ為（0.46±0.09） L/（h·kg），Vz為（11.07±2.64） L/kg。結(jié)論：該方法提取回收率高、重復(fù)性好，適用于米托蒽醌血藥濃度的測定和藥動(dòng)學(xué)研究。

關(guān)鍵詞 米托蒽醌；血藥濃度測定；藥動(dòng)學(xué)；大鼠

Blood Concentration Determination and Pharmacokinetic Study of Mitoxantrone in Rats

XUN Guizhou1，F(xiàn)U Huimin2，HU Min1，ZHANG Quan1，YE Jing1，ZHANG Shaolan3（1.School of Pharmacy， Chengdu Medical College， Chengdu 610500， China；2.Dept. of Pharmacy， Chengdu Women’s & Children’s Central Hospital， Chengdu 610091， China；3.School of Basic Medicine， Chengdu Medical College， Chengdu 610500， China）

ABSTRACT OBJECTIVE： To extablish the method for blood concentration determination of mitoxantrone in rats， and to study the pharamokinetics of mitoxantrone in rats. METHODS： Totally 6 SD rats were collected and given mitoxantrone 5 mg/kg via tail vein. The blood samples 0.3 mL were collected before medication and 5， 10， 20， 40， 60， 120， 240， 480， 720 min after medication. Blood samples were placed in heparinized EP tube， and the plasma was centrifuged and separated. After adding silica gel， the plasma were ground and mixed well， then added into methanol solution containing 0.5 mol/L hydrochloric acid to precipitate protein. After grinding and mixing， the supernatant was centrifuged and dried with nitrogen and then dissolved with mobile phase. HPLC method was adopted to determine the plasma concentration of mitoxantrone. The determination was performed on ZORBAX SB-C18 column with mobile phase consisted of 20 mmol/L ammonium acetate （pH adjusted to 2.0 with hydrochloric acid）-methanol （65 ∶ 35， V/V） at the flow rate of 1.0 mL/min. The detection wavelength was set at 244 nm， and column temperature was 30 ℃. The sample size was 20 μL. Pharmacokinetic parameters were calculated with DAS 3.0 software. RESULTS： The linear range of mitoxantrone were 200-10 000 μg/L （r=0.999 6， n=6）. The lower limit of quantitation was 200 μg/L， and the limit of detection was 150 μg/L， respectively. RSDs of intra-day and inter-day precision and stability were all lower than 8.0% （n=5， 3， 6， respectively）. The extraction recoveries were （85.64±3.93）%-（92.31±1.68）% （n=3）. The recoveries of accuracy test were （93.58±1.42）%-（113.92±2.74）% （n=3）. The pharmacokinetic parameters of mitoxantrone were as follows as AUC0-720 min was （5 247.1±474.6.0） μg·h/L； t1 /2z was （24.88±6.94） h； CLZ was （0.46±0.09） L/（h·kg）； Vz was （11.07±2.64） L/kg. CONCLUSIONS： The method has recovery and good repeatability， and is suitable for the determination of blood concentration of mitoxantrone and its pharmacokinetic research.

KEYWORDS Mitoxantrone； Blood concentration determination； Pharmacokinetics； Rat

米托蒽醌（Mitoxantrone）是一種具有蒽環(huán)結(jié)構(gòu)的廣譜抗生素，有明確的高效抗癌性，臨床上主要用于治療惡性淋巴癌、乳腺癌和急性白血病，也可用于治療肺癌、腎癌、卵巢癌等疾病[1-3]。但米托蒽醌有較明顯的骨髓抑制作用和劑量依賴性，使其臨床使用受到了明顯的影響[4-6]。因此開展米托蒽醌的血藥濃度監(jiān)測工作，有利于早期預(yù)防其毒性的發(fā)生，對于米托蒽醌的臨床安全用藥具有積極意義。

近年來，不少文獻(xiàn)報(bào)道了關(guān)于米托蒽醌的體內(nèi)分析方法和檢測技術(shù)[7-17]。這些分析技術(shù)中對樣品的分析主要采用了高效液相色譜法和高效液相色譜-質(zhì)譜聯(lián)用法，而對生物樣品的處理則有多種方法，如沉淀蛋白法、萃取法等。其中，萃取法操作復(fù)雜、耗時(shí)；而沉淀蛋白法操作簡單、省時(shí)。但是，筆者在預(yù)試驗(yàn)中發(fā)現(xiàn)，用已報(bào)道的方法[15-17]處理米托蒽醌血漿樣品，其回收率很低，且重復(fù)性不好。這可能是因?yàn)槊淄休祯c血漿中的蛋白結(jié)合力較強(qiáng)所致。由此可見，生物樣品分析中血液樣品的預(yù)處理方法對米托蒽醌準(zhǔn)確快速地分析顯得尤為重要。

由于米托蒽醌與血漿蛋白的結(jié)合主要是通過非共價(jià)結(jié)合的方式存在，基于藥物分布實(shí)驗(yàn)中研磨法處理組織樣品的原理，筆者推測先通過物理手段使血漿蛋白與米托蒽醌分離，然后沉淀蛋白，這樣便可以將米托蒽醌保留在上清液中而不會(huì)被包埋在蛋白沉淀中。為了驗(yàn)證該推測，本研究中筆者先將血漿樣品與硅膠充分研磨后，再加入甲醇沉淀蛋白處理血漿，并采用高效液相色譜法建立了大鼠血漿中米托蒽醌濃度的檢測方法，并將其應(yīng)用于大鼠體內(nèi)米托蒽醌藥動(dòng)學(xué)的研究，以期為臨床合理使用米托蒽醌提供實(shí)驗(yàn)依據(jù)。

1 材料

1.1 儀器

Agilent1260高效液相色譜儀和四元梯度泵（美國Agilent公司）；BS-224S電子天平（德國Sartorius公司）；KH2200DB數(shù)控超聲波清洗器（昆山禾創(chuàng)超聲儀器有限公司）。

1.2 藥品與試劑

鹽酸米托蒽醌對照品（成都普菲德生物技術(shù)有限公司，批號：160315，純度：98%）；硅膠（青島海洋化工廠分廠，批號：20160162，規(guī)格：200目）；甲醇（美國Mreda公司，色譜純）；其他試劑均為分析純，水為屈臣氏蒸餾水。

1.3 動(dòng)物

健康SD大鼠6只，SPF級，♂，3.5月齡，體質(zhì)量240～300 g，購自四川省人民醫(yī)院實(shí)驗(yàn)動(dòng)物研究所，實(shí)驗(yàn)動(dòng)物生產(chǎn)許可證號：SCXK（川）2016-15，飼養(yǎng)在溫度（25±2） ℃下，自然光照射，自由進(jìn)食和飲水。

2 方法與結(jié)果

2.1 鹽酸米托蒽醌對照品溶液的制備

精密稱取鹽酸米托蒽醌對照品適量，置于蒸餾水中，充分溶解，制備成質(zhì)量濃度為1.0 mg/mL的對照品貯備液，于-20 ℃冰箱中保存，臨用時(shí)用流動(dòng)相稀釋至所需濃度。

2.2 血漿樣品處理

取血漿樣品100 μL，置于研缽中，加入100 mg硅膠，充分研磨混勻，再加入沉淀劑0.5 mol/L 鹽酸的甲醇溶液1 mL，研磨混勻。用移液槍將2 mL混懸液吸入EP管中，12 000 r/min離心8 min，取上清液1 mL，氮?dú)獯蹈珊蠹?00 μL流動(dòng)相復(fù)溶，作為供試品溶液。

2.3 色譜條件

色譜柱：ZORBAX SB-C18（150 mm×4.6 mm，5 μm）；流動(dòng)相：20 mmol/L乙酸銨溶液（用稀鹽酸調(diào)pH至2.0）-甲醇（65 ∶ 35，V/V）；流速：1.0 mL/min；檢測波長：244 nm；柱溫：30 ℃；進(jìn)樣量：20 μL。

2.4 方法學(xué)研究

2.4.1 專屬性 取適量鹽酸米托蒽醌對照品貯備液，用流動(dòng)相稀釋至5 000 μg/L，作為米托蒽醌對照品溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜。取適量空白血漿作為陰性對照樣品，取給藥后4 h時(shí)收集的血漿作為供試品。將陰性對照樣品和供試品按照“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄色譜。在該色譜條件下，米托蒽醌的保留時(shí)間為5.2 min，其色譜峰與其他峰的分離度均大于1.5，無其他內(nèi)源性雜質(zhì)的干擾，色譜圖見圖1。

2.4.2 線性關(guān)系 在空白血漿中加入不同質(zhì)量濃度的米托蒽醌對照品溶液，使血漿中米托蒽醌的質(zhì)量濃度分別為200、500、1 000、2 500、5 000、10 000 μg/L，按照“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，每一濃度進(jìn)行3樣本分析，記錄峰面積。以測得峰面積（y）為縱坐標(biāo)、米托蒽醌血藥濃度（x）為橫坐標(biāo)繪制標(biāo)準(zhǔn)曲線。得回歸方程為y=0.813 1x-48.12（r= 0.999 6，n=6），結(jié)果表明，米托蒽醌檢測質(zhì)量濃度在200～10 000 μg/L范圍內(nèi)，與峰面積之間線性關(guān)系良好，符合定量分析要求，定量下限為200 μg/L。

2.4.3 檢測限 制備一系列低濃度的米托蒽醌對照品溶液，加入一定量空白血漿，按照“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積。以信噪比為3 ∶ 1時(shí)對應(yīng)的米托蒽醌的質(zhì)量濃度為此分析方法的檢測限。結(jié)果顯示，米托蒽醌的檢測限為150 μg/L。

2.4.4 精密度 在空白血漿中加入不同質(zhì)量濃度的米托蒽醌對照品溶液，制備成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（250、5 000、8 000 μg/L）的血漿樣品，每個(gè)濃度5個(gè)樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，考察日內(nèi)精密度；連續(xù)測定3 d，考察日間精密度。精密度試驗(yàn)結(jié)果見表1。

2.4.5 提取回收率 取空白血漿200 μL，加入不同質(zhì)量濃度的米托蒽醌對照品溶液，制備成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（250、5 000、8 000 μg/L）的血漿樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，獲得相應(yīng)峰面積為P1；另取鹽酸米托蒽醌對照品貯備液適量，用流動(dòng)相直接稀釋得到質(zhì)量濃度分別為250、5 000、8 000 μg/L的米托蒽醌溶液，按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，獲得相應(yīng)峰面積為P2。以 P1與P2的比值計(jì)算提取回收率。結(jié)果顯示，低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度血漿樣品中米托蒽醌的提取回收率分別為（85.64±3.93）%、（92.31±1.68）%、（88.87±2.62）（n=6）。

2.4.6 準(zhǔn)確度 取米托蒽醌對照品貯備液適量，與空白血漿混合后，制備成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（250、5 000、8 000 μg/L）的血漿樣品，按照“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，每一濃度進(jìn)行6樣本分析，記錄峰面積。將所測得的峰面積代入回歸方程計(jì)算米托蒽醌的測定濃度，以測定濃度與真實(shí)濃度之比計(jì)算回收率。結(jié)果顯示，低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度血漿樣品中米托蒽醌的回收率分別為（113.92±2.74）%、（100.79±1.36）%、（93.58±1.42）（n=6）。

2.4.7 穩(wěn)定性 取米托蒽醌對照品貯備液適量，與空白血漿混合后，制備成低、中、高3個(gè)質(zhì)量濃度（250、5 000、8 000 μg/L）的血漿樣品，各6份，取3份在常溫下放置8 h，剩余3份在-40 ℃下放置21 d，然后按照“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，考察穩(wěn)定性。結(jié)果顯示，本方法穩(wěn)定性良好，結(jié)果見表2。

2.5 藥動(dòng)學(xué)研究

取大鼠6只，尾靜脈注射給予米托蒽醌5 mg/kg[8]，分別于給藥前（空白）與給藥后5、10、20、40、60、120、240、480、720 min 取大鼠尾靜脈血0.3 mL，置于肝素化EP 管中，5 000 r/min離心10 min，分離得100 μL血漿，于 -40 ℃保存?zhèn)溆?。將血漿樣品按照“2.2”項(xiàng)下方法處理后，再按照“2.3”項(xiàng)下色譜條件進(jìn)樣測定，記錄峰面積，繪制藥-時(shí)曲線，再應(yīng)用DAS 3.0軟件，按統(tǒng)計(jì)矩原理，計(jì)算藥動(dòng)學(xué)參數(shù)。米托蒽醌在大鼠體內(nèi)的藥-時(shí)曲線見圖2，藥動(dòng)學(xué)參數(shù)見表3。

3 討論

在生物樣品分析中，最重要的兩部分就是生物樣品的前處理和建立目標(biāo)待測物合適的檢測方法。目前已報(bào)道的米托蒽醌檢測方法大都采用高效液相色譜法，如代廣會(huì)等[7]建立了固相萃取-高效液相色譜法測定細(xì)胞內(nèi)、外米托蒽醌含量的方法；熊素彬等[8]采用反相-高效液相色譜法對生物樣本中的米托蒽醌進(jìn)行測定，但文獻(xiàn)報(bào)道的血液樣品預(yù)處理方法多種多樣且方法復(fù)雜、耗時(shí)。也有研究報(bào)道，使用磺基水楊酸和乙腈對血漿樣本進(jìn)行處理，或采用10%三氯乙酸甲醇一步沉淀法提取血漿中的米托蒽醌[15-17]，筆者對文獻(xiàn)方法進(jìn)行了多次重復(fù)操作，但是回收率測定結(jié)果都只能達(dá)到30%～50%，且重現(xiàn)性不好。相對而言，本研究通過在血漿樣品處理過程中加入適量的硅膠混勻研磨，再加入有機(jī)溶劑沉淀蛋白，即便是100 μL樣本量也能獲得較高的回收率，且重復(fù)性良好。

在流動(dòng)相的選擇上，筆者考察了甲酸銨、磷酸二氫鈉和乙酸銨，結(jié)果發(fā)現(xiàn)，以甲酸銨、磷酸二氫鈉作為流動(dòng)相時(shí)米托蒽醌的峰形均出現(xiàn)不同程度地拖尾，且有雜峰出現(xiàn)，而以乙酸銨作為流動(dòng)相時(shí)能明顯改善米托蒽醌的峰形。

用硅膠研磨處理血漿的方法目前國內(nèi)外文獻(xiàn)均未見報(bào)道，結(jié)合硅膠的物理特性及血漿樣品的信息，筆者就本方法提高回收率的原理作如下猜想：因藥物在體內(nèi)大多以自由態(tài)和結(jié)合態(tài)的形式存在，將米托蒽醌加入血漿中時(shí)，藥物與血漿蛋白結(jié)合，形成一種化學(xué)鍵，通過加入硅膠研磨，使藥物與血漿蛋白分離，此時(shí)加入有機(jī)溶劑能使蛋白充分沉淀。此法制得米托蒽醌回收率比直接用有機(jī)溶劑沉淀蛋白的回收率高。用硅膠處理血漿使米托蒽醌回收率顯著提高的確切原理還有待進(jìn)一步研究。

本試驗(yàn)采用硅膠與血漿充分研磨后再加入有機(jī)溶劑沉淀蛋白的方法處理米托蒽醌的血漿樣品，大大提高了血漿中米托蒽醌的回收率，并用高效液相色譜法建立了大鼠血漿中米托蒽醌含量的檢測方法，結(jié)果米托蒽醌峰形較好，血漿雜質(zhì)對其測定無干擾，方法學(xué)驗(yàn)證如線性、精密度、回收率和穩(wěn)定性均符合相關(guān)要求，適用于米托蒽醌的藥動(dòng)學(xué)研究。

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（收稿日期：2018-10-16 修回日期：2019-01-17）

（編輯：鄒麗娟）