李慶元 肖微微 張本旭 邢翔

摘?要：篩選具有利用食用油脂功能的菌株，為廢棄食用油脂的資源化應用開展基礎性前期研究。利用油脂中性紅平板篩選法篩選到1株具有脂類降解能力的菌株鑒定為蒙氏假單胞菌。通過菌株形態(tài)特征掃描、生理生化特性，進而利用分光光度法探索了該菌株最適溫度、最適pH等生長條件。并研究其在最適生長條件下的生長曲線及其在不同油脂作唯一碳源條件下的生長情況。結果表明，該菌株生長的最適溫度為28℃、最適pH值為7.0、最適鹽度為2g/L，達到最大培養(yǎng)生物量的時間為7h。對玉米油、動物油、花生油、芝麻油、椰子油、橄欖油共7種食用油脂具有相應的利用能力。

關鍵詞：蒙氏假單胞菌;食用油脂;利用效率

隨著人民生活水平的提高和城市第三產業(yè)的發(fā)展，我國餐飲產業(yè)正以每年10%以上的速度遞增[1]，食用油脂作為重要的餐飲原料，其使用量隨之增加。廢棄食用油脂回流食品市場所造成的危害已經引起人們的高度重視。統(tǒng)計數據顯示，我國年產廢棄油高達500萬t，以京津為例，2016年達到30萬t左右。大量地溝油若放任自流經非法渠道流向食用油、飼料油市場，將會嚴重危及食品安全[2]。而且廢棄食用油脂一旦作為污染物進入環(huán)境，造成環(huán)境壓力不可估量[3]。目前，處理廢棄食用油脂的途徑有厭氧發(fā)酵、生產炸藥、化工重利用和生物降解[4-7]等途徑。本研究利用海洋微生物資源高效轉化效率的特點，以油、脂為原料，探索菌株對其利用度，為進一步降解處理廢棄食品油脂提供科學依據。

1?材料與方法

1.1?樣品

蒙氏假單胞菌（Pseudomonas monteilii），山東省海洋微生物資源中心保藏。

1.2?培養(yǎng)基

（1）TSB培養(yǎng)基（g/L）：胰蛋白胨17g、大豆蛋白胨3g、氯化鈉5g、磷酸氫二鉀2.5g、葡萄糖2.5g。（2）油脂中性紅培養(yǎng)基（g/L）：橄欖油6mL、吐溫-80℃ 20mL、氯化鈉5g、磷酸二氫鉀2g、無水硫酸鎂0.1g、磷酸氫二鉀1.5g、硫酸銨1g、硝酸鉀1g、0.8%中性紅水溶液2mL、瓊脂18g、純水1 000mL，pH 7.2，121℃滅菌20min。（3）發(fā)酵培養(yǎng)基（g/L）：橄欖油6mL、吐溫-80℃ 20mL、氯化鈉5g、磷酸二氫鉀2g、無水硫酸鎂0.1g、磷酸氫二鉀1.5g、硫酸銨1g、硝酸鉀1g、純水1 000mL，pH 7.2，121℃滅菌20min。（4）油脂培養(yǎng)基（g/L）：油脂6mL、吐溫-80℃ 20mL、氯化鈉2g、磷酸二氫鉀2g、無水硫酸鎂0.1g、磷酸氫二鉀1.5g、硫酸銨1g、硝酸鉀1g、純水1 000mL，pH 7.5，121℃滅菌20min。

1.3?菌株的活化與生化特性

1.3.1?活化?取冷凍管，常溫解凍，取200μL涂布于分離培養(yǎng)基上，20～25℃培養(yǎng)24～48h。挑取單菌落，再次純化。

1.3.2?培養(yǎng)特征與形態(tài)?將純化出的菌株接種到油脂中性紅培養(yǎng)基平板，28℃恒溫培養(yǎng)48h，觀察菌落生長及培養(yǎng)基變色。將純化后的菌株接種至TSB培養(yǎng)基，25℃培養(yǎng)24h，觀察單菌落的大小、形狀、顏色、透明度和色澤特征。同時以戊二醛前處理菌體，郵寄青島大學掃描電鏡觀察。

1.3.3?生理生化特征?將斜面瓊脂中生長的菌苔刮取至ATB菌液管中，配制成濁度0.5麥氏單位。接種20E、ZYM、ATB-ID32試劑條中，28±1℃培養(yǎng) 18～24h觀察結果，并由ATB NEW細菌鑒定儀判讀結果[9]。

1.3.4?最適生長條件?自油脂中性紅培養(yǎng)基上挑取菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、110r/min的條件下培養(yǎng)48h。以1%的接種量接種到初始pH為5.5～9.0的發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、110r/min的條件下培養(yǎng)48h，測定600nm處的吸光度，判斷最佳的pH。同理，設定不同的鹽度1～6g/L，設計溫度15～37℃，培養(yǎng)48h后在600nm處測定其吸光度，判斷最佳生長條件。

1.3.5?最適生長條件下脂降解菌的生長曲線測定?自油脂中性紅培養(yǎng)基上挑取菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、110r/min的條件下培養(yǎng)48h。以1%的接種量接種到初始pH為7.0、初始鹽度為2g/L的發(fā)酵培養(yǎng)基中，在110r/min、28℃的條件下培養(yǎng)。測定菌液在1～9h時在600nm處的吸光度，繪制生長曲線。

1.3.6?最適生長條件下對不同油脂的利用效率?自油脂中性紅培養(yǎng)基上挑取菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、110r/min的條件下培養(yǎng)48h。以1%的接種量分別接種到玉米油培養(yǎng)基、花生油培養(yǎng)基、動物油培養(yǎng)基、芝麻油培養(yǎng)基、椰子油培養(yǎng)基、橄欖油培養(yǎng)基中，在初始pH為7.0、初始鹽度為2g/L、28℃、110r/min的條件下培養(yǎng)。培養(yǎng)48h后在600nm處測定其吸光度。

2?結果與分析

2.1?Pseudomonas monteilii的形態(tài)及生理生化特征

將獲得純培養(yǎng)的Pseudomonas monteilii菌株接種于TSB培養(yǎng)基，置25℃培養(yǎng)，菌落呈乳黃色、隆起狀，邊緣不規(guī)則，表面光滑（圖1）。菌株革蘭氏染色后呈紅色，為革蘭氏陰性菌。電鏡照片顯示其為具鞭毛的短桿狀（圖2）。生理生化檢測結果表明，油脂降解菌Pseudomonas monteilii可利用梓檬酸鈉，并可產生萘酚-AS-BI-磷酸酶和脲酶（附表）。

2.2?最適生長條件

設定的培養(yǎng)基初始pH為5.5～9.0，自油脂中性紅培養(yǎng)基上挑取菌種接種到發(fā)酵培養(yǎng)基中，28℃、110r/min的條件下培養(yǎng)48h。同理，設定不同的鹽度1～6g/L，不同的溫度15～37℃，培養(yǎng)48h后在600nm處測定其吸光度，得到最佳的生長條件為初始pH 7.0、初始鹽度2g/L、培養(yǎng)溫度28℃（圖3）。

2.3?最適生長條件下Pseudomonas monteilii生長曲線

在最適pH、鹽度、溫度條件下?lián)u瓶培養(yǎng)Pseudomonas monteilii，培養(yǎng)1～9h后測定菌液在600nm處的吸光度。圖4表明，Pseudomonas monteilii在最適條件下培養(yǎng)7h即可達到。

2.4?最適生長條件下Pseudomonas monteilii對不同種油脂的利用效率

設定的油脂種類有玉米油、動物油、花生油、芝麻油、椰子油、橄欖油，初始pH為7.0、鹽度為2g/L、溫度為28℃，培養(yǎng)48h后利用分光光度計法測定菌液在600nm處的吸光度。圖5表明，Pseudomonas monteilii在多種油脂中均能生長，在玉米油、花生油、芝麻油中生長情況較好，具有利用多種油脂生長增殖的能力。

3?結論

廢棄食用油脂回流餐桌已成為社會公害，引起人們的極大重視，多地相繼出臺法規(guī)規(guī)范、監(jiān)管廢棄食用油脂的去向[8-9]。廢棄油脂的處理目前多采用生物技術，包括固定化微生物技術、PAC生物處理技術、UASB法[10-12]，以及超臨界 CO2 分解技術[13]等。對于微生物利用廢棄食用油脂也有報道，韓德軍等[14]、馮蘭等[15]和陳紅艷等[16]對葡萄球菌、厚壁菌、假單胞菌利用動植物油能力的研究[14-16]。本研究從初始pH、初始鹽度、溫度三方面確定了Pseudomonas monteilii的最適生長條件。該菌株對鹽度的適應范圍廣泛。并測定了在最適條件下，Pseudomonas monteilii的生長曲線。其油脂效率較快，短時間內即可達到最大吸收峰。通過對其在不同種油脂中生長情況的研究，發(fā)現(xiàn)該種菌可在多種油脂中增殖到較高濃度，具有降解多種油脂的能力。現(xiàn)今已有多項研究表明，Pseudomonas monteilii產生的活性物質可破壞TMV粒體，對病毒產生鈍化作用，使病毒粒體缺乏完整性，從而無法在寄主體內增殖，降低病毒的侵染能力[17-18]。本研究對菌株利用廢棄食用油脂培育生防生物制劑，應用于植物病毒病的生物防治提供了科學依據。

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（責任編輯?唐建敏）